Protokolümüz kullanıcı dostudur. Bu tekniği kullanarak, herkes bileşeni kandan kolayca izole edebilir. Kontaminasyon en aza indirilebilir ve malzemeler doğru bir şekilde ayrılabilir.
Otomasyon ve bu protokolün kurulmasıyla, araştırmacılar kanserle ilgili maddeleri yüksek saflıkta kolayca elde edebilirler, bu da çeşitli aşağı akış çalışmaları için yararlıdır. Özellikle son kullanıcı araştırmaları için önemli avantajlar sağlaması beklenmektedir. Prosedürlerini gösteren, Kanser Genomik Araştırma Enstitüsü'nde kıdemli bir araştırmacı ve müdür yardımcısı olan Jay Jeong olacak.
Başlamak için, cihazın dokunmatik ekran panelinde kartuş türünü seçerek LBx 1 kartuşunu yükleyin. Örnek sayısını değiştirmek için ok düğmesine basın. Ardından, cihaz kapağını açın ve kullanılacak tüm kartuşları kartuş tutucusundaki numaraya göre takın.
Toplam dört kartuş için, kukla kartuşu kartuş tutucunun boş alanına yerleştirin. Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın. Kapıyı kapatın ve dokunmatik yüzey ekranındaki çalıştır düğmesine basın.
Cihaz, kartuşların üzerindeki valfleri kapatır ve bu işlem yaklaşık 30 saniye sürer. Kapıyı açmak için mesajı takip edin. Destek tekerleğini çıkarın ve valf kapalı kartuşu kartuş tutucusundan çıkarın.
Serolojik pipet kullanarak maksimum 10 mililitre tam kan örneği pipetin. Pipet ucunu kartuşun numune girişinin derinliklerine yerleştirin ve tüm kan örneğini yavaşça enjekte edin. Kartuşları cihaza taktıktan sonra, cihazın kapağını kapatın ve OK düğmesine basın.
Plazma ve buffy katlar otomatik olarak tam kandan ayrılır ve bu da yaklaşık 30 dakika sürer. Plazma ve buffy ceket ayrıldıktan sonra, ekranda alarm sesinin eşlik ettiği bir mesaj görünecektir. Kapıyı açarak veya durdurma düğmesine basarak alarmı durdurun.
Kapıyı aç. Kartuşu çıkarın ve masanın üzerine yerleştirin. Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak plazma çıkışından üç mililitre plazma geri kazanın.
Ardından, bir mililitrelik pipet ucu kullanarak buffy ceketin üç mililitresini buffy ceket çıkışından geri kazanın. Ardından, cihazın dokunmatik ekran panelinde kartuş adını seçerek LBx 2 kartuşunu yükleyin. Numune sayısını değiştirmek için ok düğmesine basın ve kartuşu kartuş tutucusuna takmak üzere LBx 1 kartuşu için gösterilen prosedürün aynısını izleyin.
Kartuşu taktıktan ve kapağı kapattıktan sonra, dokunmatik yüzey ekranındaki çalıştır düğmesine basın. Valf kapalı kartuşu kartuş tutucusundan çıkarmak ve masanın üzerine yerleştirmek için daha önce gösterilen prosedürü izleyin. Serolojik pipet kullanarak yoğunluk gradyanı çözeltisini pipetleyin.
Pipet ucunu kartuşun girişinin derinliklerine yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça enjekte edin. Ardından, tüm kan örneğini pipetleyin ve yavaşça numune girişine enjekte edin. Kartuşu takıp sabitledikten sonra, kapağı kapatın ve OK düğmesine basın.
Plazma ve PBMC otomatik olarak tam kandan ayrıldıktan sonra, alarm sesinin eşlik ettiği bir mesaj görünecektir. Kapağı açın ve kartuşu çıkarın. Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak plazma çıkışından üç mililitre plazmayı geri kazanın ve ardından PBMC çıkışından üç mililitre PBMC'yi geri kazanın.
Benzer şekilde, FAST-auto kartuşu için, valf kapalı kartuşu kartuş tutucusundan çıkardıktan sonra, kartuşun PBS girişine altı mililitre PBS çözeltisi enjekte edin. Daha sonra, LBx 1'den elde edilen üç mililitre tam kan veya kabarık kat veya LBx 2'den elde edilen PBMC numunesi pipet ve numuneyi kartuşun numune girişine yavaşça enjekte edin. Kartuşu takıp sabitledikten sonra, kapıyı kapatın ve OK düğmesine basın.
CTC'lerin otomatik zenginleştirilmesi tamamlandığında, alarmı durdurun. Kartuşu çıkarın ve arka plaka sökücüyü veya BPR'yi kartuşun önündeki dört deliğe takın. Koyu mavi kanadı her iki elinizin baş parmaklarıyla bastırın ve ardından tıklayana kadar açık mavi gövdeye basın.
Kartuş gövdesini kaldırarak dikkatlice çıkarın. Çok nazikçe, bir cımbız kullanarak filtre zarını kenardan alın ve membranı nükleik asit hazırlanması için 1,5 mililitrelik bir tüpe veya boyama için bir slayt camına yerleştirin. Gerekirse, filtrelenmiş kanı bir mililitrelik pipet ucu kullanarak kan çıkışına geri kazanın.
Ekstrakte edilen cfDNA'lar Biyoanalizör kullanılarak değerlendirildi ve cfDNA tarama bantları elektronik merdivenle birlikte kullanıldı. Merdiveni ve numuneyi hizalamak için yeşil çizgi kullanıldı. Üçgen işaretleri DNA bandını gösterir.
Çoğu cfDNA'nın uzunluğu 166 baz çiftidir ve bazıları uzunluğun tamsayı katlarında bulunur. Genellikle, cfDNA konsantrasyonu 50 ila 700 baz çifti boyutuna kadar ölçülür. Her bir numuneden elde edilen miktarda, mililitre başına 8.47 nanogram ve mililitre başına 5.2 nanogram gibi bir fark olmasına rağmen, cfDNA ekstraksiyonunun sonuçları her durumda hem konsantrasyon hem de boyut dağılımı için iyiydi.
Bu sonuçlar, LBx 1 yönteminin cfDNA içeren plazmayı doğru bir şekilde ayırdığını göstermektedir. FAST-auto'da, zar çıkarıldı ve CTC'leri ve beyaz kan hücrelerini tespit etmek için floresan antikorlarla boyandı. Cam slaytlara yerleştirilen vitray membran, floresan mikroskop altında gözlemlendi.
Membran boyamasından sonra, hücreler DAPI veya nükleer-pozitif sinyalleri mavi renkte gösterirken, EpCAM ve CK veya CTC'ler pozitif yeşil renkle vurgulanır ve CD45 veya WBC pozitif kırmızı renkle vurgulanır. Membranı çıkarmak zor değildir. Bununla birlikte, CTC'lerin kaybı ve kontaminasyonu konusunda dikkatli olmak gerekir.
Tam kan, PBMC ve buffy ceket hepsi mevcuttur. Bunun yerine, tüm ses seviyesini ayarlamanız yeterlidir. Diğer sıvılar da kullanılabilir, ancak test gerekli olacaktır.
Bu teknik doğrudan hastanelerde ameliyat edilebilir ve madde hızlı bir şekilde elde edilebilir.
