Nöroinflamasyon çeşitli nörolojik bozukluklarda önemli bir oyuncudur. Bu nedenle, patolojik gelişim çalışmalarını kolaylaştırmak için alternatif in vivo nöroinflamasyon modellerinin araştırılması ve geliştirilmesi büyük ilgi görmektedir. Burada açıklanan teknik, in vivo görüntüleme yoluyla beyindeki patolojik değişiklikleri daha iyi anlamak ve olası anti-nöroinflamatuar ilaçları hızlı ve verimli bir şekilde değerlendirmek için mükemmel bir araçtır.
Cam kılcal tüp çekme için beş adımlı protokolü izleyerek bir mikropipet çektirme makinesi kullanarak cam kılcal damarları çekerek enjeksiyona hazırlanın. Forseps kullanarak iğnenin ucunu uygun boyutta bir açıyla açın. Kabarcık olmadığından emin olmak için iğneyi 0,1 mililitre mineral yağ ile doldurun.
Mikroenjeksiyon aparatının çelik iğnesinin vidalı kapağını çıkarın. Cam iğne deliğini çelik iğneyle hizalayın, ardından vidalı kapağı sıkın. Yüklü iğne mikroenjeksiyon aparatını bir mikromanipülatöre monte edin.
Mikroenjeksiyon aparatının konumunu, mikromanipülatörün cihazı mikroskop altında esnek bir şekilde hareket ettirebilmesi için ayarlayın. Çelik iğnenin kılcal cam tüpe girmesini sağlamak için gereken uygun miktarda parafin yağı boşaltın. PBS veya lipopolisakkaritten oluşan enjeksiyon çözeltisini% 70 etanol ile sterilize edilmiş bir cam slayt üzerine bırakın ve mikroenjeksiyon aparatını, ucun sıvı damlasına yerleştirilmesi için ayarlayın.
İğneye yaklaşık iki mikrolitre enjeksiyon çözeltisi yükleyin. Mikromanipülatörü, mikroenjeksiyon aparatının iğne ucu, yüksek büyütmeli larvalarla aynı görüş alanında olacak şekilde ayarlayın. Bir mikrodalga kullanarak çift damıtılmış sudamıtılmış% 2'lik bir agaroz çözeltisini eritin.
Erimiş agarozu plastik bir kaba dökün. Anestezi uygulanan larvaları% 2 agaroz kaplı plastik bir kabın merkezine taşımak için plastik bir transfer pipeti kullanın. İğne erişimi için monte edilmiş larvaları beyin tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin.
Zebra balıklarının beyin ventriküler yapısı görüş alanında açıkça gösterilecek şekilde mikroskopun büyütülmesini ayarlayın. İğneyi dikkatlice beyin tektumunun üzerine yerleştirin. Beyin bölgesini% 70 etanol ile temizleyin ve mikromanipülatörü kullanarak zebra balığı beyninin cildini iğne ucuyla yavaşça delin.
Bir nanolitre 1X PBS veya farklı konsantrasyonlarda lipopolisakkarit çıkarmak için ayak pedalına basın. Larvaları enjeksiyondan hemen sonra temiz bir E3 ortamına aktarın. 24 saat sonra, mikroskobik görüntüleme, lokomotif davranışsal tahlil ve diğer göstergelerin belirlenmesi için larvaları toplayın.
E3 ortamında% 1.5 düşük eriyikli agaroz çözeltisi hazırlayın ve berrak bir sıvı oluşturmak için bir mikrodalgada ısıtın. Larvaları bir cam slayta taşımak ve mümkün olduğunca fazla su çıkarmak için temiz bir plastik transfer pipeti kullanın. Larvalara% 1.5 düşük eriyikli agaroz damlası eklemek için plastik bir transfer pipeti kullanın.
Larvaları yönlendirmek için bir mililitrelik bir şırınga iğnesi kullanın. Görüntülemeye başlamadan önce agaroz soğuyana ve katılaşana kadar bekleyin. Lipopolisakkarit beyin ventrikül enjeksiyonundan 24 saat sonra, gen ekspresyon belirteçlerini belirlemeye devam edin.
Larvaların baş kısımlarını göz ve yumurta sarısı kesesi bölgeleri olmadan ayırmak için iki adet bir mililitrelik şırınga kullanın. Beş saniye boyunca dakikada 11.000 rotasyonda bir doku öğütücü kullanarak kafa kısmını 200 mikrolitre RNA ekstraksiyon reaktifi ile homojenize edin, ardından kloroform izopropanol yöntemini kullanarak RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. RNA peletini beş ila 10 dakika boyunca hava ile kurutun, ardından RNA peletini çözmek için 30 mikrolitre RNAse içermeyen su ekleyin.
Metin makalesinde açıklandığı gibi rastgele primerlerle ters transkriptaz kullanarak cDNA'yı sentezleyin. Ardından, hedef genlerin ekspresyonunu belirlemek için piyasada satılan bir RT-qPCR kiti kullanarak bir qPCR sisteminde gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin. Lipopolisakkarit beyin ventrikül enjeksiyonundan 24 saat sonra, zebra balığı larvalarını ayrı ayrı 96 kuyucuklu kare mikroplakanın kuyularına aktarın.
Her bir oyuğa 300 mikrolitre E3 ortamı ekleyin ve daha sonra larvaları test plakasına alışmak için dört saat boyunca inkübe edin. Larva yüklü mikro plakayı zebra balığı izleme kutusuna aktarın. Işık kaynağını açın ve çevreye alışmak için larvaları test kutusunda 30 dakika boyunca inkübe edin.
Otomatik bir video izleme sistemi kullanarak zebra balığı davranışını izleyin ve kaydedin. Bireysel zebra balığı larvaları için her biri beş dakikalık 12 seans kaydedin ve metin yazısında açıklandığı gibi toplam mesafeyi tanımlayın. 24 saat tedaviden sonra, mililitre başına bir ila beş miligram lipopolisakkarit ventriküler beyin enjeksiyonu, TgEtvmat2: GFP larva zebra balığının beyninde kontrol ve sahte gruplara kıyasla önemli miktarda RA nöron kaybına neden oldu.
Transgenik çizgi elavl3: mCherry zebra balığı, mililitre lipopolisakkarit başına 2.5 ila beş miligram enjekte edildiğinde larva beyin nöronlarının floresan entegre yoğunluğunda önemli değişiklikler gösterirken, mililitre lipopolisakkarit enjeksiyonu başına bir miligram hiçbir etki göstermedi. Ayrıca, mililitre lipopolisakkarit başına beş miligram, hareket eksikliğine neden oldu ve 60 dakikalık bir izleme süresi boyunca zebra balığı hareketinin toplam mesafesini azalttı. Zebra balığı larvalarının başındaki pro-inflamatuar sitokinlerin azot oksit üretimi ve mRNA ekspresyonu, kontrol ve sahte gruplardaki ekspresyona kıyasla, mililitre lipopolisakkarit tedavisi başına 2.5 ila beş miligram üzerinde artmıştır.
Mililitre lipopolisakkarit başına bir ila beş miligram enjeksiyonu, nötrofillerin larva zebra balığı beynine alındığını gösterdi ve Tgmpo: eGFP zebra balığı beyin bölgesindeki nötrofil sayısında önemli bir artışa neden oldu. İğnelerin açılma boyutu ve mikroenjeksiyon için enjeksiyon kuvveti miktarının yanı sıra zebra balıklarının gözlerinden ve vücudundan kafa ayrımı bu prosedür için çok önemlidir.
