İnsülin direnci primer adipositlerde değerlendirilebilir, bu da donörlerin yağsız ve obez veya farklı yağ depolarından hücreler gibi farklı fizyopatolojik bağlamlar altında incelenmesine izin verir. Primer adipositler, içsel özelliklerinin çoğunu korur ve hücresel çevresel faktörlerin sıkı bir kontrolü ile uzun bir süre boyunca tanımlanmış koşullar altında kültürlenebilir. Farklılaşma sürecini başlatmak için, hücreler% 80 birleşimde olmalıdır.
Farklılaşma daha düşük veya daha yüksek bir birleşimde başlarsa, hücreler daha az farklılaşır veya farklılaşma kapasitelerini kaybeder. Hayvanı feda ettikten sonra,% 70 etanol ile ovalayarak fareleri dezenfekte edin. Kasık altı yağ dokusunu her fareden diseke edin ve buz üzerinde 15 mililitre tip bir kollajenaz çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir konik tüpte toplayın.
Yağ dokusunu steril cerrahi makasla küçük parçalara ayırın ve numuneleri 30 dakika boyunca 150 RPM'de bir orbital çalkalayıcıda 37 santigrat derecede tip bir kollajenaz çözeltisi ile inkübasyona tabi tutarak sindirin. Çalıştığından emin olmak ve aşırı sindirimi önlemek için sindirimi her 10 dakikada bir kontrol edin. Kollajenaz ile sindirilmeyen dokuyu ortadan kaldırmak için 200 mikrometrelik bir ağ şırıngası kullanarak filtreleyin ve çözeltiye mümkün olduğunca çok hücre boşaltmak için filtreyi tüpün kenarından geçirin.
Sindirimi durdurmak için 15 mililitre soğuk DMEM %1 BSA ekleyin ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 400 G'de santrifüj yapın. Olgun adipositleri içeren üst tabakayı ve sıvı tabakanın çoğunu aspire edin. Üzerine 20 mililitre soğuk PBS% 2 FBS ekleyin ve peleti yeniden askıya alın.
Beş dakika boyunca tekrar santrifüj yaptıktan sonra, kalan adipositleri ve yağları ortadan kaldırmak için üst tabakayı aspire ederek süpernatantı çıkarın. Peletleri bir mililitre ACK lizing tamponunda tekrar askıya alın. Beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
10 mililitre PBS% 2 FBS ekleyin ve karıştırın. Beş dakika boyunca santrifüj yaptıktan ve süpernatanı aspire ettikten sonra, peleti 200 mikrolitre anti-FC çözeltisinde yeniden askıya alın. Beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve hücre süspansiyonunu, manyetik hücre ayırıcısının önceden soğutulmuş raflarına uyan beş mililitrelik bir tüpe aktarın.
Beş dakika boyunca santrifüj yaptıktan ve süpernatanı ortadan kaldırdıktan sonra, CD 31 monoklonal antikor biyotin ve CD 45 monoklonal antikor biyotin karışımından 200 mikrolitre ekleyin. İyice karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra 400 mikrolitre PBS% 2 FBS ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 400 G'de tekrar santrifüj yapın.
Süpernatantı aspire edin ve buz üzerinde 15 dakika boyunca 100 mikrolitre anti-biyotin mikroboncuk içinde inkübe edin. 400 mikrolitre PBS% 2 FBS ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 400 G'de tekrar santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, pelet 350 mikrolitre PBS% 2 FBS içinde yeniden askıya alın.
Hücre agregalarını veya büyük parçacıkları, 70 mikrometrelik bir ön ayırma filtresine sahip tek hücre süspansiyonlarından çıkarmak için, filtreyi 100 mikrolitre PBS% 2 FBS ile etkinleştirin. Hücre süspansiyonunu filtreden geçirin ve temiz bir tüpte toplayın. Ardından filtreyi 100 mikrolitre PBS% 2 FBS ile yıkayın.
Negatif ayırma stratejisini kullanarak hücrelerin manyetik ayrımını gerçekleştirmek için, etiketlenmemiş ve etiketlenmiş hücreleri kurtarmak için numuneyi soğutulmuş rafın A konumuna ve B ve C konumlarındaki iki boş tüpü yerleştirin. Daha sonra yıkama tamponunu ve çalışma tamponunu ilgili şişelere yükleyin. Ayırma bölümünde, ayrılacak örnek sayısını seçin ve tükenme protokolünü seçin.
Çalıştır'a basın ve ayırmayı başlatın. Programın sonunda, etiketlenmemiş hücreleri kurtarın. Daha sonra, her bir kuyucuğun tüm yüzeyini kaplamak için 400 mikrolitre% 2.5 bazal membran matrisi ekleyerek 12 delikli bir plakayı bazal membran matrisi ile kaplayın.
Fazla çözeltiyi çıkarın ve plakanın laminer akış davlumbazının içinde en az bir saat kurumasını bekleyin. Beş dakika boyunca santrifüj yaptıktan ve süpernatanı attıktan sonra, pelet 500 mikrolitre büyüme ortamında tekrar askıya alın. Adiposit öncü hücrelerini veya APC'leri, daha önce% 2.5 bazal membran matrisi ile kaplanmış 12 delikli plakanın bir kuyucuğuna tohumlayın.
% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede inkübe edin ve hücreler% 80 birleşime ulaşana kadar ortamı her 48 saatte bir değiştirin. Ortamı tamamen çıkardıktan sonra, hücreleri 350 mikrolitre PBS% 2 FBS ile yıkayın. Hücreleri 350 mikrolitre% 0.05 tripsin EDTA ile 37 santigrat derecede iki dakika boyunca hasat edin ve iki mililitre büyüme ortamı ekleyin.
Hücreleri yeni bir 50 mililitrelik konik tüpte toplayın ve beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin. APC'leri daha önce %2,5 bazal membran matrisi ile kaplanmış 12 delikli plakalara geçirin ve %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler% 80 birleşime ulaşana kadar ortamı her 48 saatte bir değiştirin.
% 80 birleşimde, herhangi bir büyüme ortamını aspire edin ve her bir kuyucukta 3.3 nanomolar kemik morfogenetik protein içeren 500 mikrolitre farklılaşma ortamı ile değiştirin. 48 saat sonra, ortamı kuyu farklılaştırma ortamı başına 500 mikrolitre ve farklılaştırma kokteyli ile değiştirin. Ortamı 72 saat sonra çıkarın ve 500 mikrolitre taze farklılaşma ortamına 100 nanomolar insülin ekleyin.
48 saat sonra, mililitre başına dört nanogram tümör nekroz faktörü alfa veya TNF alfa ile insülin direncini indükler. Herhangi bir farklılaşma ortamını aspire edin ve TNF alfa ile 500 mikrolitre basit ortam% 2 FBS ile değiştirin. 24 saat inkübe ettikten sonra, basit bir ortamda% 0 FBS'de mililitre TNF alfa başına dört nanogram ekleyin.
24 saat sonra 100 nanomolar insülin ekleyerek insülin sinyal yolunu aktive edin ve daha önce gösterildiği gibi% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve 500 mikrolitre PBS ile yıkayın, insülin tedavisi olmadan bir kontrol kuyusu ekleyin. Proteini çıkarın ve insülin sinyal belirteçlerinin fosforilasyonunu Western blot ile ölçün.
Bu şekilde, 12 kuyucuklu kültür plakalarında diferansiyasyonu indüklemeden önce %80 birleşimde subkutan adiposit öncü hücreleri ve yedi günlük diferansiyasyon indükledikten sonra primer adipositler gösterilmiştir. Subkutan primer adipositlerde TNF alfa tarafından indüklenen insülin direnci, insülin reseptörünün, insülin reseptör substratının ve protein kinaz B veya AKT'nin insülin kaynaklı fosforilasyonunun azalması ile gösterilmiştir. Membran anti-fosforile insülin reseptörü, anti-fosforile insülin reseptörü substratı bir, anti-fosforile AKT ve yükleme kontrolü olarak anti-beta tübülin ile incelendi.
Sinyal kemilüminesans tespiti ile görselleştirildi. Temsili lekeler ve üç bağımsız deneyden elde edilen niceliklendirme burada gösterilmiştir. Bu prosedürü denerken, dikkat edilmesi gereken bir şey, TNF alfa ile insülin direncinin indüklenmesinin 24 saat boyunca% 2 FBS ve son 24 saat boyunca% 0 FBS ile olmasıdır.
