Bu protokol, bireysel hücrelerde bulunan mitokondriyal DNA'nın kopyalarının sayısını ve belirli mitokondriyal DNA mutasyon tiplerinin seviyesini doğru bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Önceki yöntemler, bu ölçümleri birçok hücre içeren doku örneklerinde doğru bir şekilde yapabilir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı ölçümleri tek hücrelerde yapabilmemizdir.
Bu yöntem özellikle mitokondri üzerinde çalışanlar için kullanışlıdır ve bu alanda geniş uygulamalara sahip olacaktır. Tek hücrelerin etkili izolasyonu ve lizisi bu tekniğin anahtarıdır. Tek hücre sıralama ile ilgili önceki deneyim çok yardımcı olacaktır.
Başlamak için, metinde açıklandığı gibi, buz üzerinde örnek DNA olmadan PCR için ana karışımı hazırlayın. Vorteksten kısa bir süre sonra, hazırlanan ana karışımın gerekli hacmini, damlacık üretimi PCR 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna dağıtın ve numuneleri tam sütunlar halinde düzenleyin. Ardından, ana karışımı şablon dışı denetimler olarak kullanmak için tamamlanmamış sütunlardaki boş kuyucuklara ekleyin.
Ardından, her bir kuyucuğun toplam hacmini 22 mikrolitre yapmak için giriş DNA'sını her bir kuyucuğa ekleyin. Plakayı yapışkan bir plaka contasıyla kapatın ve bir dakika boyunca 2000 RPM'de bir çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra plakayı buzun üzerine koymadan önce dört santigrat derecede bir dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüj yapın.
Damlacık üretimi için, önce damlacık jeneratörünün açık olduğundan emin olun ve alet güvertesinin E konumuna bir şişe damlacık üreten yağ yüklenip yüklenmediğini kontrol edin. Ardından dokunmatik ekranda Örnek Plakayı Yapılandır'ı tıklayın. Numuneleri veya boşlukları içeren numune plakasındaki tüm sütunları seçtikten sonra, plaka konfigürasyonunu onaylamak için Tamam'a tıklayın.
Ardından, damlacık jeneratörü kartuşlarını enstrüman güvertesinde B konumuna yerleştirin, böylece tüm ışıklar yeşile döner ve boş bir uç atık oluğunu C konumuna yerleştirin. Ardından, numune plakasını alet güvertesinin F konumuna yerleştirmeden önce yapışkan contayı çıkarın, böylece ışık yeşile döner. Ayrıca, ışığın yeşile dönmesi için G konumunda, eksi 20 santigrat derecede önceden soğutulmuş, serin bir bloğa yerleştirilmiş boş bir damlacık toplama 96 delikli plaka yükleyin.
Cihazın dokunmatik ekranında Damlacık Oluşturmayı Başlat'a tıkladığınızda damlacık jeneratörü kapağı otomatik olarak kapanır. Damlacık üretimi tamamlandıktan sonra, her bir kuyucukta yağ fazının üzerinde bir damlacık emülsiyon tabakasının bulunduğunu doğrulamak için numune toplama plakasını görsel olarak kontrol edin. Ardından, plaka kapatıcıyı açın ve sıcaklığı 180 santigrat dereceye ayarlayın ve kapatma süresini beş saniyeye ayarlayın.
Makinenin çalışma sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Daha sonra numune toplama plakasını plaka kapatıcının plaka tutucusuna yerleştirin ve plakanın üstüne kırmızı çizgi yukarı bakacak şekilde taze bir folyo conta yerleştirin. Plaka sızdırmazlık elemanı çalışma sıcaklığına ulaştığında, cihazın dokunmatik ekranında çıkarma düğmesine basın.
Plaka tutucuyu plaka kapatıcının çekmecesine yerleştirdikten sonra, çekmeceyi kapatmak için contaya basın. Sızdırmazlık tamamlandığında, çekmece otomatik olarak açılacaktır. Sızdırmaz plakayı çıkarın ve soğuk bloğun üzerine yerleştirin.
Ardından plaka kapatıcıyı kapatın. PCR'yi çalıştırmak için, kapalı damlacık toplama plakasını 96 derin kuyucuklu bir bloğa sahip bir PCR makinesine yerleştirin. PCR tamamlandıktan sonra, damlacık okuyucuyu ve bağlı bilgisayarı açın.
PCR sonrası numunelerle plakayı damlacık okuyucu plaka tutucusuna yükleyin. Folyo kapağını numune plakasında tutarken, kapağı tutucunun üstüne yerleştirin ve siyah kilitleme klipsleriyle yerine sabitleyin. Ardından, damlacık okuyucu kapağını açmak için aç/kapat düğmesine basın.
Ardından, damlacık okuyucu plakası tutucusunu numune plakasıyla birlikte okuyucu odasına yükleyin ve manyetik tabana güvenli bir şekilde yerleştirin. Kapağı kapatmak için aç/kapat düğmesine tekrar basın. Analiz yazılımı arayüzünü açın.
Plaka Ekle sekmesini seçin, Plaka Ekle'yi tıklatın ve ardından Plakayı Yapılandır'ı tıklatın. Plaka Bilgileri sekmesinde bir plaka adı girin, Supermix Açılır menüsünden Problar için Supermix, DUTP Yok'u seçin ve Kuyu Seçimi sekmesindeki Veri Dosyasını Kaydet As.In altına bir dosya adı girin, analiz edilecek kuyuları vurgulayın ve Seçilen Kuyuları Dahil Et'i tıklatın. Ardından, Kuyu Bilgileri sekmesinde, açıklama eklenecek kuyuları seçin.
Deneme Türü açılır menüsünden Doğrudan Nicelik'i seçin. Ardından örnek açıklamasını, örnek türünü ve hedef adı kutularını doldurun ve gerektiğinde iyi notlar ve/veya plaka notları ekleyin. Ardından Uygula'yı tıklayın.
Plaka yapılandırması tamamlandıktan sonra, Çalıştırmayı Başlat'ı tıklatın. Sonuç analizi için, Veri Analizi sekmesini seçin ve analiz edilecek dosyayı Veri Dosyalarım menüsünden açın. Ardından, tek renkli denemeler için 1B Genlik sekmesini veya iki renkli denemeler için 2B Genlik sekmesini tıklatın.
Ardından, eşik gerektiren kuyuları seçin. Genlik grafiğindeki pozitif ve negatif popülasyonlar arasındaki boş alana eşiği manuel olarak uygulamak için Eşik Çizgisi Modu aracını kullanın ve artı işaretinin dört damlacık popülasyonunun açıkça ayrılacağı şekilde yerleştirilmesini sağlayın. Eşik tüm örnekler için uygulandıktan sonra, Veri Tablosu sekmesi, İçe/Dışa Aktar'a tıklayıp Görünür Verileri CSV'ye Aktar'ı seçerek sonuçları daha fazla analiz için csv dosyası olarak dışa aktarın.
Uygun bir dosya adı girin ve Kaydet'i tıklatın. Bu protokolde kullanılan PCR ve damlacık okuma prosedürleri, hem fam hem de hex kanallarında açıkça ayrılmış pozitif ve negatif damlacık popülasyonlarının varlığını göstermiştir. Her iki prob için pozitif olan mitokondriyal DNA popülasyonları, tek hücreli lizatlardan da ayırt edilebilir.
Bu yöntem aynı zamanda mitokondriyal DNA'da delesyonları olan örnekler için, DNA'nın sadece silinmemiş kısmı için pozitif olan çift pozitif damlacıklar ve damlacıklardan oluşan karışık bir popülasyonun mevcut olduğunu göstermiştir. Bu yöntem, fare oositleri ve birincil fare embriyonik hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli memeli hücrelerinde hücre başına mitokondriyal DNA kopya sayısını saymak için başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, yüksek delesyon heteroplazmisine sahip hücrelerde, tek bir prob için pozitif olan popülasyonun, çift pozitif popülasyondan anlamlı derecede daha büyük olduğu bulunmuştur.
Bununla birlikte, düşük delesyonlu heteroplazmiye sahip hücrelerde, her iki popülasyon da benzer büyüklükteydi. Bu nedenle doğru sonuçlar her zaman damlacık üretiminin başarılı olmasını ve eşiklemenin 1D veya 2D genlik görünümü kullanılarak uygun şekilde uygulanmasını sağlar. Kullanılmayan lizat, tek nükleotid polimorfizm heteroplazmını ölçebilen pirosekanslama gibi diğer tek hücreli testler için kullanılabilir.
Bu tekniğin geliştirilmesi, mitokondriyal DNA kopya sayısının doğru ölçümlerini yapmamıza ve daha önce mümkün olmayan bireysel hücrelerde delesyon heteroplazmisini yapmamıza izin verdi.
