Bu protokol, baculovirüs-böcek hücre kültürü sistemini kullanarak AAV üretimi ve saflaştırılması için yöntemler geliştirmek isteyen araştırmacılar için yararlı olacaktır. Baculovirüs-böcek hücre kültürü sistemi kullanılarak AAV üretimi, ölçeğinin büyütülması kolay ve mevcut iyi üretim uygulamasıyla uyumlu, uygun maliyetli bir yöntemdir. Protokolün bazı bölümleri laboratuvarımın araştırma asistanı Alan Heizer tarafından gösterilecek.
Bir şişe Sf9 hücresini çözerek başlayın ve hemen 15 mililitre böcek hücresi kültürü ortamına tohumlayın. Sf9 hücrelerini 125 RPM'de bir orbital çalkalayıcı inkübatörde ve 28 santigrat derece yuvarlak tabanlı şişelerde, hava değişimi için gevşek bir şekilde tutturulmuş bir kapakla büyütün. TIPS hücre üretimi için yeterli hücre elde etmek için hücreleri 200 mililitre orta içeren bir litrelik bir şişeye yayın.
mililitre başına 6. güç hücrelerine iki şişede 2 kez 10'da 50 mililitre Sf9 hücresi ekleyin. Sf9 hücrelerinin bir şişesini 0,5 mililitre baculovirüs-AAV2-GFP ile, diğer hücre şişesini ise 0,5 mililitre baculovirüs-AAV2-rep-cap ile enfekte edin. Üç gün sonra, TIPS hücreleri olarak da bilinen baculovirüs bulaşmış Sf9 hücrelerinin küçük bir aliquot'ını hasat edin.
Karanlıkta ortam sıcaklığında 30 dakika boyunca 100 mikrolitre bloke tamponunda floresan boya içeren 0,5 mikrogram fare anti-bakülovirüs gp64 antikoru ile hem enfekte olmayan hem de baculovirüs bulaşmış Sf9 hücrelerinin 5. gücüne 2 kez 10 lekeleyin. Antikoru çıkarmak için hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, 0,5 sığır serum albümini içeren 300 mikrolitre PBS'de lekeli hücreleri yeniden askıya alın. Akış sitometrisi kullanarak hücrelerde baculovirus gp64 ekspresyon analiz edin.
Hücreler% 80 ila 90 yaşayabilir olduğunda, çapı arttığında, hücreleri hasat edin ve kriyoprezerserve 1 kez 10 ila 7 inci güç hücrelerini bir mililitre böcek kültürü ortamında, % 10 fetal sığır serumu ve% 10 dimetil süloksit ile desteklenmiş, yavaş donan bir kapta eksi 80 santigrat derecede. Ertesi gün, TIPS hücrelerini içeren tüpü uzun süreli depolama için sıvı bir azot dondurucuya aktarın. Adeno ilişkili virüs veya AAV üretimi için gerekli olan bir çalkalayıcı inkübatörde 400 mililitre böcek hücresi kültürü ortamı içeren birkaç iki litrelik şişelerde mililitre başına 2 kez 10 ila 6.
Üç ila dört gün sonra, hücre yoğunluğu mililitre başına 6. Yörüngesel çalkalayıcı inkübatördeki şişelerde AAV üretimi için, 400 mililitre Sf9 kültürünü 2 kez 10 ila 6. Yörüngesel çalkalayıcıyı 125 RPM ve 28 santigrat derecede kurun.
Her baculovirüs-AAV-GFP ve baculovirus-AAV-rep-cap TIPS hücrelerinden bir şişe çözün. Hücreleri 20 mililitre böcek kültürü ortamı ile seyreltin ve trippan mavisi kullanarak hücrelerin canlılık sayısını gerçekleştirin. Her iki TIPS hücresini de bir çalkalayıcı şişede veya biyo-reaktörde kültürlenmiş naif Sf9 hücrelerine göre 1 ila 10.000 oranında aşılayın.
İkinci gün, bir mililitre Sf9 kültürünü aseptik olarak hasat edin ve hücre sayısını, canlılığı ve morfolojiyi analiz etmek için trypan mavi boya ile lekelenin. Üçüncü gün, ikinci günde yapılan adımları tekrarlayın ve Sf9 hücrelerini lekeledikten sonra baculovirüs enfeksiyonunun durumunu kontrol edin. Beşinci günde, ikinci günde gerçekleştirilen adımları tekrarlayın ve ardından Sf9 canlılığı yaklaşık% 50'ye düştüğünde kültür ortamını ve hücrelerini hasat edin Döndükten sonra süpernatantı ve hücre peletini toplayın ve negatif 80 santigrat derecede saklayın.
AAV-prodüktör hücre peleti çözüldükten sonra, içine hücre liziz tamponu ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. AAV parçacıklarını serbest bırakmak için yeniden askıya alınan peleni ortam sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya bırakın. Santrifüjlemeden sonra, hücre lisatını yeni bir kaba aktarın.
Çözdükten sonra hücre lisatını ve hücre kültürü üstnatantını karıştırın. DNA ve RNA'yı sindirmek için mililitre nükleaz başına 20 birim ve hücre lisatine 10 milimoler magnezyum klorür ekleyin ve 37 santigrat derecede iki ila dört saat kuluçkaya yatırın. Bir pompa kullanarak 0,8 mikrometre ve 0,2 mikrometre poliethersülfon çift filtrasyon sistemi ile listi filtreleyin.
Netleştirilmiş hücre lisasını bir gecede dört santigrat derecede saklayın veya AAV'yi hemen arındırın. Kromatografi makinesine 10 mililitre avb sepharose sütun monte edin ve boru hattını AAV numunesine, yıkama tamponuna ve elüsyon tamponuna yerleştirin. AAV parçacıklarını içeren sütun geçiş çözeltisi, yıkama tamponu ve elütion tamponunun fraksiyonlarını toplamak için kromatografi makinesinin fraksiyon toplayıcı yuvalarına tüpler yerleştirin.
AVB Sepharose sütununu dakikada beş mililitre akış hızında beş sütun pbs hacmi ile dengele. AAV parçacıklarını içeren filtrelenmiş hücre lisatı, örnek bir pompa ile donatılmış kromatografi makinesini kullanarak AVB Sepharose benzeşim sütununa yükleyin. Örneği dakikada üç mililitrelik bir akış hızında çalıştırın.
PBS'yi, 280 nanometredeki ultraviyole emiciliği eğrisi taban çizgisine dönene ve kararlı hale gelene kadar dakikada üç mililitrelik bir akış hızında sütun boyunca çalıştırın. AVB Sepharose sütunundaki AAV parçacıklarını dakikada üç mililitre akış hızında 50 milimolar sodyum sitrat tampon pH 3 ile elute edin. AAV'yi içeren asidik elüasyon tamponu nötralize etmek için AAV süpernatantını beşte bir hacme sahip 500 milimolar Tris HCl pH 8.0 ile hemen seyreltin.
Bu, asidik pH 3.0 elüasyon tamponu ile oluşabilecek pH aracılı bozulmayı önler. Daha sonra AAV süpernatantını PBS ile on kat seyreltin, böylece AAV parçacıkları fizyolojik bir tampondadır. AAV'nin varlığını hedef hücrelerin enfeksiyonuyla değerlendirmek için her sütundan bir mililitre numune, yıkama tamponu ve 100 mikrolitre eluted AAV süpernatantı depolayın.
AAV'yi konsantre etmek için 100 kilodalton moleküler ağırlık kesmeli poliethersülfon membran kartuşu ile donatılmış teğetsel akış filtrasyon sistemini kurun. Teğetsel akış filtrasyon modülunu aşındırmak için 10 dakika boyunca 200 mililitre PBS çalıştırın. Numune istenen hacme inene kadar pompanın akışını kontrol ederek AAV örneğini yükleyin.
100 mililitre PBS ile retentate diafiltrate. AAV örneğini istenen hacme konsantre ettikten sonra, AAV örneğini toplayın, 0,2 mikrometre poliethersülfon filtreden filtreleyin ve aliquotlayın. Ardından AAV örneğini eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Sf9 hücrelerinin çoğu, baculovirüs glikoprotein gp64 ekspresyonu ile kanıtlanan çoklu enfeksiyon turları nedeniyle üç ila dört gün içinde baculovirüs ile enfekte oldu. Hücrelerin çoğu da çapında bir artış gösterir. Hücreler çapında bir artış, sitopatik etki gösterir ve hücrelerin yaklaşık yarısı, AAV üretiminin tamamlanmasının belirtileri olan enfeksiyon sonrası beş gün içinde ölür.
AAV fraksiyonuna karşılık gelen asidik bir tampon ile elüsyon yaparken protein zirvesi görüldü. Saflaştırılmış AAV örnekleri üç farklı kapsid proteini gösterir: SDS-PAGE ve gümüş boyamadan sonra VP1, VP2 ve VP3. En kritik adım, hücrelerin çoğu baculovirüs ile enfekte olduğunda, en az sayıda hücre ölümü ile kriyoprezervasyondan önce TIPS hücrelerinin toplanmasıdır.
Serotip 2'nin AAV vektörün üretimini ve saflaştırılmasını burada bir model olarak tanımladık. Ancak, protokol diğer AAV serotipleri için de uygulanabilir.
