Bu teknik, çoğu laboratuvar ortamında yaygın olarak bulunan aletleri kullanır ve aynı anda birkaç numunenin analizini sağlar. Bu yöntem, lipid metabolizması enzimlerinin hücresel bağlamda ve farklı genetik arka planlarda nasıl düzenlendiği hakkında önemli içgörüler sağlayabilir. Bir koloniyi bir maya kültür plakasından% 2 dekstroz içeren 20 mililitre SC ortamına aşıla ve 200 rpm'de sallanarak bir gecede 30 santigrat derecede kuluçkaya yatır.
Ertesi gün, kültürü 50 mililitre taze ortamda 0,2'lik son bir OD'ye seyreltin ve sabit faza ulaşılana kadar 24 saat boyunca büyütün. Her örnek için iki adet 20 mililitrelik söndürme tamponu hazırlayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Aynı zamanda, mililitre başına 10 mikrokürie'lik son konsantrasyonda dekstroz içermeyen SC ortamına asetik asit sodyum tuzu ekleyerek radyolabeling ortamı hazırlayın.
Hücreleri 10 dakika boyunca 4,100 x g'da santrifüjleyarak toplayın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 20 mililitre dekstroz içermeyen SC ortamıyla bir kez yıkayın. Hücreleri beş dakika boyunca 4, 100 x g'da santrifüjleyarak tekrar toplayın ve dekstroz içermeyen ortam kullanarak etiketli iki mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Hücreleri iki dakika daha santrifüjleyin. Hücreleri 500 mikrolitre dekstrozsuz SC ortamına yeniden boşaltın ve her hücre süspansiyonu için hızlı bir şekilde 500 mikrolitre radyolabeling ortamı ekleyerek radyolabeling dönemine başlayın. Tüpleri 30 santigrat derecede dönen bir inkübatörde 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Bu arada, 50 mililitre konik tüp için donatılmış santrifüjü eksi 10 santigrat dereceye kadar önceden soğutun ve bir adet 20 mililitrelik söndürme tamponu çözün. Radyolabeling süresi sona erdiğinde, bir mililitrelik numunenin tamamını buzdaki çözülmüş söndürme tamponuna daldırmak için bir pipet kullanın. Üç dakika boyunca 5.000 x g'da önceden soğutulmuş bir santrifüjde dönerek hücre peletini toplayın ve 20 mililitre taze soğuk söndürme tamponu ekleyin.
Vortex ve söndürme tamponunda tamamen yeniden dirsinmek için örnekleri sallayın ve hücreleri toplamak için örnekleri tekrar santrifüj edin. Hücreler peletlendikten sonra, üsttan dökerek ve fazlalıkları bir pipetle çıkararak tüm söndürme tamponunu numunelerden iyice çıkarın. Daha fazla işlem için tüpleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Her örnek için 0,3 gram asitle yıkanmış cam boncukları tartın ve buz üzerinde iki mililitre mikrosantrifüj tüpünde saklayın. Hücre topaklarını eksi 80 derecelik dondurucudan çıkarın ve buza yerleştirin. Daha sonra, her numuneye 350 mikrolitre metanol ve 700 mikrolitre kloroform ekleyin ve hücreleri yeniden biriktirin.
Bunları önceden tartılmış cam boncuklar içeren mikro santrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri bir dakika boyunca üç kez girdaplayarak, ajitasyonlar arasındaki buzda 30 saniye inkübasyon ile lyse. Hücreleri 15 mililitrelik bir cam santrifüj tüpüne dökün ve tüpü A.Tüp A olarak etiketleyin Mikrosantrifüj tüpünü bir mililitre metanol ile yıkayın, vorteksleyin ve metanolünü A tüpüne dökün.
Örnekleri bir dakika boyunca girdaplayın ve ardından 1000 x g'da beş dakikalık bir santrifüjleme ile sulu ve organik aşamaları arayüzde yatan hücre kalıntılarıyla net bir şekilde ayırın. Cam mera pipeti kullanarak, organik fazı B etiketli yeni bir cam santrifüj tüpüne toplayın ve bir mililitre azı dişi potasyum klorür ekleyin. A tüpüne bir mililitre metanol ve iki mililitre kloroform ekleyin ve girdap ve santrifüj adımlarını tekrarlayın.
Sulu ve organik fazı ayırmak için girdap ve santrifüj tüpü B. Üst sulu tabakayı çıkarın ve tüm alt organik tabakayı dört mililitrelik bir cam şişeye toplayın. Lipid özlerindeki çözücüyü inert gaz altında kurutarak tamamen buharlaştırın ve TLC plakasını ısıtmak için fırını 145 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.
Hücreleri TLC plakasına yüklemeden önce hücreler tarafından alınan göreceli radyolabel miktarlarını belirleyin. Örnek lipitleri 40 ila 50 mikrolitre kloroform ve metanolde beş dakika boyunca girdaplayarak bire bir oranında yeniden inşa edin. Cam mezunu bir silindirde 101 mililitre mobil faz çözücü hazırlayın.
Ardından, çözücüyü 20 x 20 TLC doygunluk pedi ve sıkı bir montaj kapağı içeren bir cam TLC haznesine dökün. Kanallı bir 20'ye 20 silika jel 60G plaka hazırlayın ve bir kalem kullanarak plakanın altından 1,5 santimetre yukarıda bir çizgi işaretleyin. Plaka yeterince ısıtıldıktan ve TLC doygunluk pedi çözücü ile doyuruldıktan sonra, TLC plakasını fırından çıkarın ve hemen yüklemeye devam edin.
Bir pipet kullanarak, TLC plakasının dibinden 1,5 santimetre yukarıda bulunan her şeridin kökenine beş mikrolitre numune tespit edin ve her şeride 20 ila 40 mikrolitre numune yüklenene kadar tekrar yüklemeyi tekrarlayın. Standart ve numuneler yüklendikten sonra, plakayı gelişmekte olan odaya yerleştirin ve çözücü plakanın tepesine ulaşana kadar bekleyin. Plaka tamamen geliştirildiğinde, hazneden çıkarın ve duman kaputunda 20 dakika kurumasını bekleyin.
Plaka kuruduktan sonra plastik filmle örtün ve otoradyografi ekranı ile gelişmekte olan bir kasete yerleştirin. Ekranı gelişmekte olan kasetten çıkarın ve fosfor görüntüleyicinin içine yerleştirin. TLC plakasını silika doyurulana kadar p-Anisaldehit reaktifi ile püskürtün, ardından 145 derece fırında beş dakika veya bantlar ortaya çıkana kadar pişirin.
Lipid türlerini ölçmek için, bireysel lipit türlerini içeren silika jelini kazıyın ve cam scintillation şişelerine aktarın. Silika bandı küçük parçalara indirgenene kadar altı mililitre scintillation sıvısı ve girdabı kuvvetlice ekleyin. Scintillation şişeleri ile rafı bir scintillation sayacına yerleştirin ve sayım süresini şişe başına iki dakikaya ayarlayarak sayın.
Fosfor görüntüleme, etiketsiz yağ asidi, triacylglycerol, diacylglycerol, kolesterol ve squalane otoradyogramının görselleştirilmesine izin verir. Bu yöntemde saflaştırılmış lipit türlerinin ayrılabileceği ve daha sonra TLC plakasının p-Anisaldehit reaktifi ile püskürtülmesiyle görselleştirilebileceği gösterilmiştir. Görselleştirilmiş türler, steril esterlere ek olarak daha önce bahsedilen tüm lipitleri içerir.
Nabzı takip eden radyolabel içermeyen medyada 10 dakikalık bir kovalama süresi uygulanarak, majör squalane havuzunda gözlendi ve toplam kolesterol yükseldi. Benzer şekilde, kovalama döneminde diacylglycerol görünümü serbest yağ asitleri sinyalinde bir azalma ile ilişkilidir. Tam protokolü gerçekleştirmeden önce, hücrelerin büyüme durumunda ve ilginin genetik arka planında asetik asit radyolabelini alıp almayacağını belirlemek önemlidir.
