Bu protokol, kritik derin ven trombozunu tedavi etmek için alternatif bir non-invaziv yaklaşım olan histotripsi destekli trombolitik tedavi veya lizotripsinin etkinliğini ve etki mekanizmalarını değerlendirmek için bir tezgah üstü yöntem sağlar. Bu teknik, gelişmiş bir litik doğum ve pıhtı içindeki kırmızı kan hücrelerinin hemolizi nedeniyle artan fibrinoliz yoluyla iki yönlü bir etkiye sahip olmak için kabarcık aktivitesini kullanır. Derin ven trombozunun tedavisindeki bu tezgah üstü yaklaşım, kan pıhtılarının modellenerek lizotripsi ile tedavisini ve tedavi sırasında eşzamanlı görüntülemeyi kolaylaştırır.
Kabarcık bulutu üretimi, tedavi planlaması ve görüntü rehberliği, böbrek ve karaciğer tümörleri gibi diğer hastalıkların in vitro histripsi bazlı tedavilerini araştırmak için daha fazla kullanılabilir. Histotripsi kaynağını ayarlamak için kaynağı motorlu bir konumlandırma sistemine monte edin. Görüntüleme dizisini bir prob kapağıyla örtün ve diziyi histotripsi kaynağının diyafram açıklığında koaksikal olarak sabitle.
Görüntüleme dizisini ultrason tarama sistemine bağlayın ve histotripsi kaynağını ve görüntüleme dizisini tanka tamamen batırın. Hava kabarcıklarını nazikçe çıkarmak için bir şırınga kullanın ve saniyede 20 karede gazsız B modu su görüntüleri elde etmek için görüntüleme dizisini ve tarayıcıyı kullanın. Görüntüleri alırken, kabarcık bulut yaklaşık olarak görüntü penceresinin ortasına yerlenene kadar görüntüleme dizisinin konfokal dönüştürücü açıklığı içindeki konumunu ayarlayın ve algılanan odak konumunu görüntüleme penceresine kaydedin.
Daha sonra inzotasyonu durdurun ve histotripsi kaynağına uygulanan voltajı sıfıra ayarlayın. Analiz için bir pıhtı hazırlamak için, pıhtı içeren bir pipetin kapalı ucunu kesmek ve pıhtı ve serumun bir petri kabına kaymasına izin vermek için pense kullanın. Pıhtıyı bir santimetre uzunluğa kesmek için bir neşter kullanın ve fazla sıvıyı çıkarmak için kesim bölümünü hafifçe lekelamak için bir temizleme mendili kullanın.
Pıhtı bölümünü dikkatlice bir ölçeğe yerleştirmek ve ağırlığı kaydetmek için cımbız kullanın. Ardından, akış kanalını gazsız bir ters ozmos su deposundan manuel olarak kaldırın ve model kabı kanaldan çıkarın. Pıhtıya zarar vermeden pıhtıyı model damara dikkatlice yerleştirmek ve damarı akış kanalına bağlamak için cımbız kullanın.
Akış kanalını tanka, rezervuara göre sahnenin proksimal ucu distal tarafa göre düşük olacak şekilde küçümser ve rezervuara 37 santigrat derecelik 30 mikrolitre plazma eklemek için bir pipet kullanın. Su deposunun sıcaklığını en az 36 santigrat dereceye ulaşana kadar izleyin ve plazma rezervuarına 80,4 mikrogram rt-PA eklemek için bir pipet kullanın. Akış kanalını astarlamak için, model kap dolana kadar plazmayı rezervuardan kanala çekmek için bir şırınna pompası kullanın.
Daha sonra modelleme penceresinde görüldüğü gibi model kapta hava kabarcığı olmadığından emin olmak için model kabı manuel olarak düzleştirme. Pıhtı uzunluğu boyunca tek tip histtripsi maruziyeti için histtripsi kaynağı ve görüntüleme dizisi için bir yol planlamak için, görüntüleme dizisini pıhtının uzunluğuna paralel hizalamak ve damarda hava kabarcıklarının bulunmadığını doğrulamak için motorlu konum belirleyicileri kullanmak için görüntüleme komut dosyasını kullanın. Görüntüleme düzlemini pıhtının kesitine paralel olacak şekilde görüntüleme dizisini hizalamak için motorlu konumlayıcıları kullanın.
Görüntüleme penceresini kılavuz olarak kullanarak, histotripsi kaynağını rezervuara göre pıhtının proksimal ucuna taşıyın. Pıhtı uzunluğu boyunca insonasyon yolunu belirlemek için, pıhtının uzunluğu boyunca yol noktalarını beş milimetrelik artışlarla ayarlayın. Her bir ara noktayı sonuçlandırmadan önce, histotripsi kaynağından ateş testi darbeleri, gösterildiği gibi aynı insonasyon parametreleriyle, ancak genel maruziyet 10 toplam darbeye düşürülür.
Her ara noktada, üretici tarafından belirlenen komutları kullanarak motor konumlarını kaydedin. Pıhtıyı ön işlem adımında tanımlanan yola göre uzunluğu boyunca tedavi etmek için şırınna pompasını dakikada 0,65 mililitreye ayarlayın ve plazmanın menisküslerinin hareket etmesini bekleyin. Tedavi yolunu sabit adım boyutuna sahip yerleşik ara noktalar arasında ara adımlarla enterpolasyonlayın ve konumlayıcıları, başlangıçta ayarlanan insonasyon parametrelerini kullanarak histotripsi kaynağını her yol konumunda taşımak için kullanın.
Daha sonra, görüntüleme dizisini, her yerde histotripsi darbesinin uygulanmasından birkaç saniye önce pıhtı ve model kabının B modu görüntüsünü alacak şekilde ayarlamak için bir komut dosyası oluşturun. Daha sonra her bir ara noktada histotripsi darbesini uygulayın, analizden sonra pasif kavitasyon görüntüleri oluşturmak için senaryodaki akustik emisyonları elde edin. Her yol konumunda histotripsi darbesinin uygulanması sırasında kabarcık etkinliğini görüntülemek için görüntüleme penceresini kullanın.
Analizden sonra, perfüzyonu yerçekimi yoluyla boşaltmak için model kabı su deposundan manuel olarak kaldırın ve tüm perfüzyonun küçük bir beherde toplanmasına izin vermek için plazma çözeltisini akış kanalından çekmek için şırıngar pompasını kullanın. Model kabın bağlantısını kesin ve pıhtıyı çıkarın. Daha sonra pıhtıyı laboratuvar dokularıyla silin ve pıhtı kütle kaybını değerlendirmek için pıhtıyı tartın.
Histtripsi kaynağına yeterli voltaj uygulanması üzerine transdüserin odak bölgesinde bir kabarcık bulutu üretilir ve ultrason görüntüleme ile görselleştirilir. Odak konumu kabarcık bulutunun merkezi olarak tanımlanır. Sadece plazmaya maruz kalan bir pıhtının bu kontrol perfüzyonu ve lizotripsi ile tedavi edilen bir pıhtının bu perfüzyonu, gösterildiği gibi hemoglobin ve D-dimer içeriğini değerlendirmek için kullanılmıştır.
Hemoglobin konsantrasyonundaki değişkenlik optik absorbans ile ölçülebilir. Burada, pasif kavitasyon görüntüsünün segmentasyonu için pıhtı pozisyonunu belirlemek için histtripsi maruziyeti öncesinde B-modu görüntüleme yoluyla bir model damar içinde bir pıhtı görselleştirilebilir. Pıhtının B-modu görüntüsü ile birlikte kaydedilen bu pasif kavitasyon görüntüsünün de doğrulayıp, akustik enerji öncelikle histtripsi maruziyeti sırasında pıhtının içinde bulunur.
Histtripsiye maruz kalan örneklerde, bozulma öncelikle pasif kavitasyon görüntüleme ile izlenen kabarcık aktivitesinin gözlenen konumları ile tutarlı olarak pıhtı merkezi ile sınırlıdır. Litik ilavesi ile pıhtının çevresine daha yakın bölgelerde de kitle kaybı meydana gelir. Alternatif olarak, rt-PA içeren ekojenik lipozomlar, pıhtıya hedeflenen ilaç teslimatının değerlendirilmesini sağlamak için sistemik rt-PA teslimatı yerine kullanılabilir.
Lizotripsi, birçok hastalığın tedavisinde alternatif bir non-invaziv yaklaşım sağlar. Bu in vitro protokol, tedavinin etkinliğinin ve in vivo uygulamadaki potansiyel başarısının değerlendirilmesini sağlar.
