Name: a contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model
Uploaded: 2020-11-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model at JoVE.com

Bu çalışma LSUHSC Vakfı (PLF) ve kısmen Louisiana Klinik ve Çeviri Bilim Merkezi'ni finanse eden Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden U54 GM104940 tarafından desteklendi.

Kuyruk damarı enjeksiyonları ve ısınma/kısıtlama cihazının kullanımını içeren tüm hayvan protokolleri yerel Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.
1. Hazırlık
<ol><li>Hayvanları en az 1 hafta boyunca barınma ortamına alıştırın ve yiyecek ve su reklam libitumuna izin verin. NOT: Bu enjeksiyon tekniğinin çoğu yeni kullanıcısı için, kuyruk damarları ciltte kolayca görülebildiğinden, beyaz veya açık renkli kürklü hayvan suşları tercih edilebilir. Farelerin koyu renkli suşları (örneğin, C57BL/6) veya sıçanlar (örneğin, Kahverengi Norveç) derin pigmentli kuyruklara sahiptir ve bu da damara karşı zayıf bir renk kontrastı ile sonuçlanır. Yeterlilik elde edilene kadar yeni kullanıcıların yeterli eğitim alması şiddetle tavsiye edilir.</li>
	<li>Kuyruk damarı enjeksiyonu için ajanlar<ol>
<li>Tüm test ajanlarını ve çözümlerini aseptik olarak hazırlayın. Organizmaları veya hücresel malzemeleri uygularken, pirojen içermeyen koşulları korumak için tüm işlem adımları sırasında önlem alın.</li>
		<li>Kuyruk damarı enjeksiyonu için araç olarak sadece normal salin (%0,9 w/v sodyum klorür) veya fosfat tamponlu salin (PBS) gibi dengeli tuz çözeltileri kullanın. DİkKAT: Potansiyel damar hasarı riski nedeniyle asla su, yağ veya viskoz çözeltiler kullanmayın. Kemirgenlerde kanın tamponlama etkisi ve hızlı kan akış hızları nedeniyle çok çeşitli pH (4.5–8.0) tolere edilebilir. Bununla birlikte, yüksek derecede asidik veya alkali çözeltiler enjeksiyon bölgesinde gereksiz doku hasarına neden olabilir ve kaçınılmalıdır.</li>
		<li>Enjeksiyon hacmini ve sıklığını minimumla sınırlayın. Hayvana stresi en aza indirmek için enjeksiyondan önce vücut sıcaklığında fareler ve sıçanlar için önerilen hacimleri (sırasıyla ≤200 μL ve≤500μL) kullanın 3 .</li>
		<li>Şırınga ve iğnenin her preparatının çözeltideki hava kabarcıklarından arındırılmış olduğundan emin olun; kabarcıklar varsa, emboli riskini önlemek için tamamen temizleyin. NOT: Tipik olarak, 27 G, 1/2 inç iğneli 1 mL şırıngalar çoğu kuyruk damarı enjeksiyonu için yeterlidir.</li>
		<li>En az tek kullanımlık veya özel önlük ve lateks veya nitril eldiven ile yerel IACUC'un gerektirdiği uygun kişisel koruyucu ekipmanı (KKD) kullanın. Kuyruk damarı enjeksiyonu yapılırken güvenlik gözlüklerinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isınma ve kısıtlama cihazı<ol>
<li>Cihazın herhangi bir kusurdan arındırılmasını sağlamak için kullanmadan önce tüm bileşenleri dikkatlice inceleyin (Şekil 1).</li>
		<li>Isınma cihazı başlatma (Şekil 2A)<ol>
<li>Isınma ünitesini temiz düz bir tezgah üzerine yerleştirin ve cihazı açık tutun. Termostat güç göstergesi lambasının yeşil yandığından emin olun. Alanı kuru tutmak ve ısıyı korumak için yatak malzemelerini ısıtma odasının içine yerleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kısıtlama cihazı kurulumu (Şekil 2B)<ol>
<li>Kısıtlama ünitesini ısıtma ünitesinin yanına yerleştirin ve hayvan için uygun koni boyutlarını belirleyin. Gerekirse, hayvan için yeterli kısıtlama sağlamak için esnek alüminyum koninin taban genişliklerini manuel olarak ayarlayın. Alternatif olarak, koniyi, farklı vücut boyutlarındaki fareleri veya sıçanları barındırmak için özel olarak monte edilmiş modellerle değiştirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kuyruk damarı enjeksiyonu
<ol><li>Aparat ayarlamaları<ol>
<li>İç sıcaklığı ayarlama<ol>
<li>Kontrol kadranını kullanarak termostatı istediğiniz sıcaklığa ayarlayın. Isıtıcı göstergesinin kırmızı yandığından ve ampulnün yandığından emin olun. Ampul yanarken (ısıtma) iç sıcaklık göstergesini dikkatlice izleyin. Termostat, hedef sıcaklık ulaştığında ampulü yaklaşık 10-15 dakika içinde otomatik olarak devre dışı bırakmaz. NOT: Ortam sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklık ayarlamak ısıtıcıyı etkinleştirir. Genel olarak, standart vivaryum koşullarında önerilen muhafaza sıcaklığı 20 ila 26 ° C arasında değişirken, laboratuvar fareleri için nötr (yani rahat) sıcaklık 30 ila 32 ° C42arasında kabul edilir. Bu nedenle, ısınma odasının iç sıcaklığının termonötraliteden biraz daha yüksek, yaklaşık 32-36 ° C'de yükseltilmesi önerilir. Termostatı asla vücut sıcaklığının üzerine ayarlamayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kısıtlama platformunun konumlandırılması<ol>
<li>Yükseklik ayarlama düğmesini kullanarak koni yüksekliğini kullanıcı için en uygun seviyeye ayarlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Isıl işlem (Şekil 3A)<ol>
<li>Hedef sıcaklığa (32-36 °C) ulaştıktan sonra, hayvanları konut kafesinden ısınma odasına hafifçe aktarın. NOT: Vazodilasyona neden olmak ve kuyruk damarlarının görünürlüğünü artırmak için 5-10 dakika ısıl işlem yeterlidir. Bununla birlikte, hayvanlar prosedür süresince termoregüle odasında güvenle tutulabilir (tipik olarak hipertermi belirtisi olmadan 20-30 dk). Isınma odası güvenli bir şekilde 4-6 fare veya bir sıçan içerebilir.</li>
		<li>Hayvanı akut ısı stresi belirtileri için izleyin (örneğin, hızlı solunum, uyuşukluk, atlama kaçış davranışı). DİkKAT: Hipertermi belirtileri gösteren hayvanlar, yeniden kullanımdan önce normal aktiviteye devam edene kadar kafeslerine geri verilmeli ve izlenmelidir. Bunun nedeni iç sıcaklığın en uygun aralığı aşmasıysa, ısınma cihazının kapalı olduğundan emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Ekleme adımları<ol>
<li>Hayvanı kuyruğun tabanından kaldırın ve ısınma odasından çıkarın. Hayvanı kısıtlama ünitesinin koni açıklığı üzerine sokun. DİkKAT: Fareleri asla kuyruk ucundan kaldırmayın; bu ciddi yaralanmalara neden olabilir. Obez veya hamile fareler için alternatif yol tutuş yöntemleri kullanılmalıdır28.</li>
		<li>Hayvan koninin uzak kenarında forelegleriyle kavrarken, kuyruğu yavaşça geriye doğru çekin ve kuyruğu açık yarıktan geçirin. Hayvanın arka ucunu koninin tabanına, bir arka bacağı koniden çıkıntı yaparak sabitleyin, böylece yanal damar saat 12 pozisyonunda gösterilir. Her iki tarafta bir tane olmak üzere iki yanal damar olduğu için arka bacaktan biri çıkıntı yapılabilir (Şekil 3B).</li>
		<li>Kuyruğu orta ila üçte iki uzunluğunda başparmak ve işaret parmağı arasındaki baskın olmayan el ile kavrayın, kuyruk konumlandırmasını ve vazodilasyonunu korumak için yanal damara hafif bir gerginlik koyarak. NOT: Isıl işlemle genişlemiş damarların gelişmiş görünürlüğü, kullanıcının en iyi sonuçlar için hızlı bir şekilde bir enjeksiyon bölgesi belirlemesini sağlar (Şekil 4).</li>
		<li>Enjeksiyon bölgesinin derisini% 70 alkolle nemlendirilmiş bir gazlı bez süngeri veya ped ile silin. Kuyruğun tahrişini önlemek için mümkün olduğunca nazikçe ve hızlı bir şekilde temizleyin. NOT: Bu prosedür kurumsal IACUC'nin takdirine bağlı olarak atlanabilir.</li>
		<li>Şırıngayı baskın el ile tutun ve iğneyi kuyruğa paralel yerleştirin. İğneyi kan akışının yönüne doğru yerleştirin, 10-15° açıyla(Şekil 5A–B)eğimli olun ve 2–4 mm(Şekil5C-D)nüfuz ederek damarın lümenine daha da ilerleyin. Çözeltiyi yavaşça enjekte edin. NOT: Enjeksiyon başarılı olursa pistonda direnç hissedilmemeli ve sıvı damarda hareket ederken görülebilir. Enjeksiyon bölgesinin üzerinde direnç veya beyaz kabarcıklar olması durumunda, iğneyi çıkarın ve orijinal iğne yerleşiminin üzerindeki bir bölgeye ikinci bir enjeksiyon girişiminde bulunun. Sıvı ilk bölgeden geçeceğinden, ilk enjeksiyon bölgesinin altına enjekte etmeye çalışmayın. Bir lateral damar enjeksiyonu başarısız olursa, hayvanı karşı tarafa yeniden konumlandırın ve kontralatör damar üzerinde daha fazla girişimde bulunun. Maksimum deneme sayısı, damar boyunca enjeksiyon girişimine nereden başladığına ve kaçırılan girişimlerle oluşabilecek şişmeye bağlı olacaktır. Yanlış enjeksiyonlar ve ilişkili yaralanmalar için kurumsal IACUC düzenlemelerine danışın.</li>
		<li>İğneyi çıkarın ve enjekte edilen çözeltinin ve/veya kanın geri akışını önlemek için başparmakla sıkıca bastırın. Kanama durana kadar temiz bir gazlı bez/mendil veya doku ile nazik sıkıştırma uygulamaya devam edin (Şekil 6).</li>
		<li>Hayvanı kafesine geri koyun ve en az 5 dakika izleyin. Hayvanın daha fazla kanama olmadan normal aktiviteye devam etmesine emin olun.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Mantar kan dolaşımı enfeksiyonu ve sepsis bir murine modeli
<ol><li>Fare suşları<ol>
<li>Dişi swiss Webster, kurumsal olarak önerilen yönergeler başına 6 haftalıkken fareleri yetiştirdi. Alternatif olarak, değiştirilmiş inocula ile bu protokol için inbred/genetiği değiştirilmiş suşlar (örneğin, C57BL/6 arka plan) kullanın (bkz. NOT). NOT (bkz. Ayrıntı için tartışma): Koyu kürklü farelerin kuyruk damarları, derin pigmentli kuyruk nedeniyle genellikle daha hafif kürklü olanlara göre daha az görünür (Şekil 4). Farklı fare suşları arasında mantar sepsis / öldürücülüğüne karşı değişen duyarlılık vardır. Swiss Webster dışındaki fare suşlarının kullanımı, konak bağışıklık durumunu etkileyebilecek ilgili faktörleri (örneğin, genetik arka plan, yaş, cinsiyet, vücut büyüklüğü) göz önünde bulundurarak ek protokol optimizasyonu gerektirebilir. Örneğin, C57BL/ 6 farelerde ölümcül bir zorluk, İsviçre Webster farelerinde görülen ölüm seviyesine ulaşmak için tipik olarak daha yüksek inokula (10x'e kadar) gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroorganizma -lar<ol>
<li>Ölümcül bir meydan okuma (sepsis) için, Candida albicans'ın donmuş stokları DAY185'i (veya tercih ettikleri suşları) Sabouraud dekstroz agarına zorlar ve 2 gün boyunca 30 ° C'de kuluçkaya yatır.</li>
		<li>Tek bir koloniyi 10 mL maya özü-peptone-dekstroz suyuna ve kültürü sallanarak 30 ° C'de 18 saat boyunca sabit büyüme aşamasına aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculum çözümleri<ol>
<li>Ölümcül bir meydan okuma gününde, et suyu kültürünü toplayın ve peleti steril PBS'de santrifüjleme (800 × g)ile 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Canlı maya hücrelerini trypan mavi boya dışlama ile tanımlayın ve bir hemositometre kullanarak numaralandırır. Oda sıcaklığında steril PBS'de hücre konsantrasyonu 1 x10 6 hücre/mL olarak ayarlayın. NOT: Her hayvan 100 μL inoculum çözeltisi alacaktır. Enjeksiyon işlemi sırasında potansiyel kayba izin vermek için fazla miktarda inoculum (>500 μL) hazırlayın. Son inoculum fare başına 1 x 105 hücredir. Hücre konsantrasyonu buna göre ayarlanarak inokülum hacmi 200 μL'ye kadar arttırılabilir. DİkKAT: Mantar inoculum çözeltisi enjeksiyondan önce oda sıcaklığında tutulmalıdır. Inoculum çözeltisinin vücut sıcaklığına ısıtması maya hücrelerinden hyphae'ye morfolojik bir değişikliğe neden olabilir. Aksine, soğuk çözeltilerin bolus i.v yönetimi hayvanın vücut sıcaklığını hızla düşürebilir ve kaçınılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İntravenöz aşılama<ol>
<li>Hayvanları ısıtın ve bölüm 2'deki prosedürleri izleyerek vazodilasyona neden olan.</li>
		<li>27 G, 1/2 inç iğne ile 1 mL şırınga kullanarak kuyruk damarına 100 μL inoculum çözeltisi enjekte edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşı sonrası izleme<ol>
<li>Hayvanları aşağıdaki sepsis kaynaklı morbidite belirtileri için izleyin: i) kürk yönü (örneğin, pürüzsüz, fırfırlı), ii) aktivite (örneğin, serbestçe hareket eden, tepkisiz), iii) duruş (örneğin, kambur, sert), iv) davranış (örneğin, yavaş, yer değiştirme yok), v) göğüs hareketleri (örneğin, normal solunum, dispne), vi) göz kapakları (örneğin, açık, kapalı)43.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sepsis puanlama<ol>
<li>Sepsis için değiştirilmiş fare klinik değerlendirme puanına (M-CASS) göre gözlemlenen morbiditeyi her kategoride 0'dan 3'e dört puanlık bir derecelendirme ölçeğinde puanlamak: 0, normal; 1, hafif; 2, ılımlı; 3, şiddetli43.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İsteğe bağlı protokol: Mantar sepsisine karşı aşılama<ol>
<li>Ölümcül bir meydan okumadan on dört gün önce, C. albicans DAY185 yerine 3.2-3.4 bölümlerinde açıklandığı gibi, Candida dubliniensis suşu Wü284 veya Δefg1/Δcph1 mutant (fare başına 1x105 hücre) gibi zayıflatılmış C. albicans suşları ile fareleri aşılayın.</li>
		<li>3.2–3.4 bölümlerinde açıklandığı gibi aşılanmış farelerde ölümcül bir zorluk meydana gelir ve 3.5-3.6 bölümlerinde açıklanan sepsis kaynaklı morbidite belirtilerini izleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tutarlı ve doğru dosing, hayvan modellerinde deneysel güvenilirlik için temel gereksinimlerdir. Bu, enjekte edilen ajanların sistemik biyoyararlanımının diğer yönetim yollarına göre önemli ölçüde daha yüksek / daha hızlı olduğu i.v. yönetimi durumlarında özellikle önemlidir3. Bu nedenle, kuyruk damarı enjeksiyonundaki hatalar çalışma sonuçları üzerinde zararlı bir etkiye sahip olabilir. Tarihsel olarak, i.v. yerine intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu, teknik basitlik ve kolaylık nedeniyle kemirgenlerde sistemik erişim için en yaygın yöntem olmuştur. Bununla birlikte, hayvanlardan klinik ortamlara preklinik okumaları çevirirken yönetim yolları daha önemli hale gelir. Bu nedenle, başarılı kuyruk damarı enjeksiyonu kolaylaştırabilecek kemirgen protokollerinde sürekli iyileştirmeye ihtiyaç vardır.
Mevcut protokoldeki temel ilerleme, kemirgenlerde vazodilasyonun etkili bir şekilde indüksiyonunu sağlayan ve kuyruk damarlarının ve iğne hizalamasının görünürlüğünü önemli ölçüde artıran yenilikçi teergüle edilmiş ısıtma cihazıdır. Kötü şekilde terrigüle edilmiş ısıtma yöntemleri (örneğin, lambalar), topikal vazodilatörler veya cilt tahriş edicileri (örneğin, ksilenler) sadece güvenilmez değildir, aynı zamanda hayvan için de güvenli değildir ve kaçınılmalıdır44. Kuyruğu ılık suya batırmak gibi diğer geleneksel yöntemlerin aksine, bu cihazın otomatikgülasyon yeteneği aynı anda birden fazla hayvanı güvenli bir şekilde koşullayabilir. Ek olarak, bu protokol en uygun şekilde tasarlanmış kısıtlama cihazı kullanılarak ve hayvanın yanal kuyruk damarını en iyi şekilde görüntüleyen bir pozisyonda hızlı ve güvenli hareketsiz hale getirilmesine izin vererek daha da güçlendirilir.
Birçok mevcut kısıtlayıcıda görülen şeffaf tubal formatlar, pratik olarak iyi tasarlanmış olsa da, her hayvanla daha fazla kullanım süresi gerektirir, böylece kısıtlama işlemi45. Bu, sınırlı işbirliği sunan agresif özelliklere sahip kemirgen suşlarında daha sorunlu olabilir46,47. Buna karşılık, kısıtlama cihazının yarı kapalı koni yapısı, hayvanın hızlı bir şekilde konumlandırılmasına izin eder ve kısıtlama süresini en aza indirmeye yardımcı olur. Birlikte, yenilikçi, son derece optimize edilmiş ısıtma/kısıtlama sistemini kullanan kolaylaştırılmış protokol enjeksiyon prosedürünü hızlandırarak büyük hayvan gruplarının hızlı ve etkili bir şekilde dolanmasını sağlar. Laboratuvarımızda, genellikle bu protokolü kullanarak 1 saat içinde ısı tedavisinden enjeksiyon sonrası izlemeye kadar 30 farenin tüm enjeksiyon prosedürünü tamamlıyoruz.
Gelişmiş özelliklere rağmen, bu cihazın bazı belirgin dezavantajları vardır: birincisi cihazın maliyeti ve ısınma odasında rutin ampul değişimidir. Bununla birlikte, enjeksiyonların verimliliğine ve hızına ek olarak, cihaz tekrarlanan kullanım için dayanıklıdır ve en yaygın dezenfektanlarla uyumludur ve cihazın kullanımlar arasında kapsamlı bir şekilde temizlenmesine izin eder. Birlikte, bu ilk yatırımıdengeler. Second, sınırlı çalışma alanı olan durumlarda, bu protokole bir dezavantaj, enjeksiyonu gerçekleştirirken iki birimi yan yana yerleştirilecek kadar büyük bir tezgah alanı için gereklilik olabilir. Bununla birlikte, cihaz, i.v. enjeksiyonlarını içeren birkaç kemirgen protokolünde yaygın olarak kullanılabildiğinden, cihazın izofluran buharlaştırıcılar gibi diğer ortak vivarium ekipmanlarına benzer bir çekirdek cihaz olarak hizmet etmesi mümkündür. Ne olursa olsun, iki ünite kolayca taşınabilir ve kullanılmadığı halde paketlenebilir ve yerle bir edilebilir.
Bu protokolde açıklanan murine mantar sepsisinin i.v. ölümcül meydan okuma modeli, insanlarda C. albicans kan dolaşımı enfeksiyonlarını yakından taklit eder ve mantar virülansını incelemek, antifungal tedavilerin etkinliğini test etmek ve enfeksiyona konak immün yanıtları karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmıştır37,39,48. Tekrarlanabilir bir enfeksiyon elde etmek için, yani kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla aşılama, organizmaların kan dolaşımına doğru bir şekilde teslimini sağlamak için protokolün en hayati adımıdır. Aslında, hayvanlar Candida yani zorlukların değişen seviyelerine çok farklı yanıt verirler; çok düşük miktarlarda inoculum verilmesi istenmeyen spontan iyileşmelere neden olurken, çok yüksek doz alan hayvanlar erken yenik düşer. Belirli bir organizmanın tutarlı bir sepsis/mortalite seviyesine neden olmak için spesifik inoculum boyutları penceresi büyük ölçüde hem mantar suşlarına hem de fare suşlarına bağlıdır.
1 x 105 vahşi tip C. albicans inoculum'da İsviçre Webster farelerini kullanan mevcut protokol, 1 gün içinde sepsis morbiditesinin başlangıcını tekrar tekrar indükler, ardından 5-7 gün% 100 öldürücülükle sonuçlanan progresif mortalite. Buna karşılık, 1 x 105'ten yüksek inocula tipik olarak hızlandırılmış ölümlere yol açar (yani, 1 x 10'da 1-2 gün6, 5 x 105'te 3-4gün ) ve 1 x 105'ten düşük olanlar alt öldürücüdür. Literatürdeki çok sayıda rapor doğrultusunda, C. albicans yerine albicans olmayan Candida türlerinin kullanımı önemli ölçüde azalmış ölümcüllük ile sonuçlanır40,49. Ek olarak, fare suşlarının seçimi, hatta kolonilerin kökeni, diğerleri tarafından bildirildiği gibi, fare suşları arasındaki değişen duyarlılıklar nedeniyle enfeksiyon sonuçları üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir39,40,41,50,51,52,53,54,55. Bu nedenle, deneyler tasarlanırken her ikisi de dikkate alınmalıdır.
Ölümcül bir i.v. meydan okumasının ardından, mantar hücreleri kan dolaşımına hızla yayılır ve en çok etkilenen böbrekler41olan birden fazla organı istila etmeye başlar. Etkilenen diğer organlar beyin, dalak ve kemik iliği48,56. Ne olursa olsun, akut sepsis erken zaman noktalarında nihai ölüm nedenidir37. Temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, sepsis şiddeti, meydan okuyan hayvanlarda sepsis durumunun sergilenen belirtilerine dayanarak Sepsis için Fare Klinik Değerlendirme Puanı (M-CASS) ile nicel olarak değerlendirilebilir43,57. Ölümcül sepsisin çeşitli taşıyıcı belirteçleri arasında, hipotermi hem klinik hem de deneysel sepsis43,58,59'da yakın ölüm için kritik bir tahmin edici olarak önerilmiştir.
Bu modelde, bu modeldeki doğuştan gelen farelere karşı doğrudan karşılaştırmak için resmi bir çalışma yapılmamış olsa da, yetiştirilmiş İsviçre Webster fareleri kullanılarak mevcut protokolden elde edilen veriler, tahmin edilen genetik heterojenliğe rağmen, çeşitli sepsis parametrelerinde son derece tekrarlanabilir. Genel olarak, 3-5 gün içinde düşen bir mortalite modeli, sepsis morbiditesinde hızlı yükselme ve ölümcül meydan okumadan sonraki saatler içinde enflamatuar belirteçlerin seviyeleri ile kanıtlanan sağlam bir akut sepsis modelidir50,51. Daha uzun sağkalım süreleri (7-10 gün) için mortalite, muhtemelen hedef organlarda ve merkezi sinir sisteminde ölümcül doku hasarına yol açan mikrobiyal yükün sonucudur. Sepsis veya mikrobiyal yük seçimi, kullanılan inoculum tarafından belirlenen bağışıklık fonksiyonlarının veya antienflamatuar rejimlere veya antifungal tedavilere/aşılara verilen yanıtların değerlendirilmesi için gerektiği şekilde uygulanabilir.
İ.v. ölümcül meydan okuma modeline ek olarak, farelerde C. albicans ile bir i.p. meydan okuma yoluyla karın içi enfeksiyon da yaygın kandidiyazis ve sonraki sepsis yol açabilir, ancak bakteriyel patojen Staphylococcus aureus ile ortak aşılama, sinerjik olarak C. albicans mono-enfeksiyonu51,60,61ile karşılaştırıldığında mortaliteyi arttırır. I.p. ölümcül meydan okuma modelinde, polimikrobiyal peritonitlere ve organizmalarınkarın boşluğundan kan dolaşımına yayılmasına neden olmak için önemli ölçüde daha yüksek mikrobiyal inocula (fare başına1.75x 10 7C. albicans/8 x 10 7S. aureus) gereklidir. Benzer şekilde, bağışıklık sistemini baskılayıcı ve/veya mukozaya zarar veren ajanlarla tedavi edilen farelerde C. albicans ile gastrointestinal enfeksiyon mantar hücrelerinin kan dolaşımına geçişine yol açar ve mantar sepsis62,63ile sonuçlanır. Ayırt edici aşılama yollarına rağmen, mantar sepsisini verme mekanizması, organ yetmezliğine yol açan Candida'ya kontrolsüz sistemik proinflamatuar bir yanıt içeren üç hastalık modeli arasında büyük ölçüde benzerdir37,51,61. Benzer şekilde, insanlarda, sadece kandidiyemi değil, konakçı yanıtının bu sürecidir, sağlık hizmetleri ayarlarında edinilen hematojen olarak yayılan kandidiyazis ile ilişkili yüksek morbidite / mortaliteye neden olur64,65.
Mevcut mantar sepsis modelini kullanarak, burada ölümcül C. albicans enfeksiyonuna karşı korumanın, sepsis morbiditesinde önemli bir azalma ile birlikte C. dubliniensis (avirulent) veya zayıflatılmış C. albicans mutantları ile aşılanma / aşılama ile elde edilebileceğini gösteriyoruz. Koruma, kemik iliğinde eğitilmiş doğuştan gelen bağışıklık formu olarak indüklenmiş gibi görünen doğuştan gelen Gr-1+ miyeloid türevi baskılayıcı hücreler tarafından aracılık edilir66,67. C. albicans kan dolaşımı enfeksiyonlarına karşı doğuştan gelen bu bağışıklık aracılı koruma biçiminin anlaşılmasını genişletme çabaları devam etmektedir.
Sonuç olarak, yenilikçi kemirgen ısıtma / kısıtlama cihazı, büyük ölçekli çok gruplu hayvan çalışmalarının i.v. enjeksiyonlarını verimli ve etkili bir şekilde gerçekleştirme yeteneğimizi ilerletmemizde etkili olmuştur. Bu nedenle, cihaz için Mouse a Minute terimini icat ettik. Cihaz özellikleri, benzer bir cihazın satın alınması talebi üzerine ilgili yazardan temin edilebilir. Burada gösterilen teknikler, çok çeşitli araştırma alanlarında kuyruk damarı enjeksiyonları kullanan kemirgen modellerinde yararlı bir araç olarak hizmet edebilir.

Kemirgenleri içeren hayvan modellerinin kullanımı biyomedikal araştırmaların temelini oluşturuyor. Dünya çapındaki laboratuvarlarda çok sayıda inbred ve outbred suşunun yanı sıra genetiği değiştirilmiş çizgiler mevcuttur ve rutin olarak kullanılmaktadır. Kuyruk damarı enjeksiyonu, kemirgen modellerinde deneysel ajanların intravenöz (yani) yönetimini gerektiren temel yöntemlerden biridir. Genel olarak, i.v. enjeksiyonları, yerel dokuları ve sindirim sistemini atlayarak yüksek emiciliği oranları ve çok çeşitli konsantrasyonların veya fizyolojik olmayan pH1,2,3,4çözeltilerine yüksek tolerans gibi diğer uygulama yollarına göre büyük avantajlara sahiptir. Diğer canlı i.v. rotaları (örneğin, saphenous damarlar, retro-orbital venöz sinüs), kuyruk damarları kemirgenlerde en güvenli ve en kolay erişilebilir kan damarı olarak kabul edilir2,3,5,6. Bu nedenle, kuyruk damarı enjeksiyonu, enfeksiyöz hastalık modelleri 7 ,8,9,biyolojik malzemelerin nakli10,11,klinik öncesi terapötiklerin değerlendirilmesi12,13 ve toksikolojik analizler14,15dahil olmak üzere bir dizi kemirgen modelinde yaygın olarak almıştır.
Başarılı kuyruk damarı enjeksiyonlarında dosingin tutarlılığı ve doğruluğu kritik bir gerekliliktir. Şaşırtıcı bir şekilde, literatürde kuyruk damarı enjeksiyonlarının nicel ve nitel değerlendirilmesi sık sık yanlış enjeksiyonları madde16,17. Bir çalışma, eğitimli enjektörler tarafından gerçekleştirilen otuz enjeksiyondan on ikisinin, enjekte edilen dozların% 10'undan fazlasını kuyruk içinde bıraktığını bildirdi18. Ek olarak, kuyruk damarı enjeksiyonları alan hayvanın güvenliği ve konforu işlem sırasında birincil endişe kaynağı olmalıdır. Yanlış kısıtlama yaralanmalara ve numune kalitesinde önemli değişkenler getirebilecek strese bağlı bir dizi patolojiye (örneğin, kilo kaybı, bağışıklık tepkilerinde bozulma) yol açabilir19,20. Bu hatalar verilerde değişkenliğin artmasına ve tekrarlanabilirliğin zayıflığına neden olabilir, böylece çalışma sonuçlarını olumsuz yönde etkiler.
Hayvanda damar genişlemesinin indüksiyonu, farelerde 300 μm olduğu tahmin edilen damarın küçük çapı nedeniyle kuyruk damarı enjeksiyonları yapılırken genellikle gereklidir21. Vazodilasyon kuyruk damarlarının görünürlüğünü arttırır ve venöz lümen içinde optimum iğne damarı hizalamasının sağlanmasına yardımcı olur. Kuyruğu ılık suya batırmak22,ılık bir örtü, lamba veya saç kurutma makinesi23 , 24kullanarak kuyruğa ısı uygulamak veya hayvanı bu ısı kaynaklarından biriyle birlikte bir ısıtma yastığı, inkübatör veya kutu kullanarak sıcak bir ortama yerleştirmek gibi çeşitli yöntemler laboratuvarlar tarafından bildirilmiştir25. Cihazlar belirli amaçlar için kendi kendine yapılabilir veya ticari tedarikçilerden temin edilebilir. Bununla birlikte, birçoğu thermoregulatory yeteneklerinden yoksundur ve varsa, cihaz sıcaklığı zayıf bir şekilde korunur ve genellikle oda sıcaklığındaki değişikliklere maruz kalır. Benzer şekilde, anestezi kullanımı önerilmediği için kuyruk damarı enjeksiyonları için bir kısıtlama cihazının kullanılması gereklidir26,27. Laboratuvara özgü veya ticari kısıtlama cihazlarının çeşitli türleri geliştirilmiştir. Tipik olarak, hayvan tek kullanımlık 50 ml konik tüp4, oluklu pleksiglas duvarlara, bir tünele veya koni28'e yerleştirilir , bunların hepsi hayvanın hareketlerini kısıtlarken kuyruğun bol miktarda maruz kalmasına izin verir. Bununla birlikte, çoğu kısıtlayıcı, malzemelerin sertliği nedeniyle boyut sınırlamalarına sahiptir. Ayrıca, modern yüksek karmaşıklıklı cihazlar, pratik ve sofistike tasarımlara rağmen, büyük hayvan gruplarını içeren enjeksiyonlar için mümkün görünmüyor22.
Kan dolaşımı enfeksiyonu ve ilişkili sepsis fare modelleri, bu tekniğin kullanılmasını gerektiren durumların en önemli örneğidir. Şiddetli klinik sepsisin tüm mikrobiyal etiyolojisi arasında, mantar sepsis genellikle antifungal tedaviye rağmen% >40 ölüm oranları ile ölümcül bir durumdur29. Aslında, Candida albicans enfeksiyonu, hastane tarafından edinilen kan dolaşımı enfeksiyonunun dördüncü önde gelen nedeni olarak bildirilmiştir (kandidiyemi)30,31. Karın içi kandidiyaziste, gastrointestinal sistemdeki mikroorganizmalar kan dolaşımı yoluyla yayılabilir ve daha da büyük mortalite ile polimikrobiyal sepsise neden olabilir32,33,34. Nozokomi vakalarının çoğu kontamine merkezi hat kateterlerinden veya indwelling tıbbi cihazlardan ortaya çıktığı için35,36,yani kuyruk damarı enjeksiyonu ile C. albicans ile aşılama insan sepsis gelişimini yakından yansıtabilir ve hematojen olarak yayılan kandidiyazis37,38'infare modelinde temel bir yöntem olmuştur. Bu modelde, günler içinde ortaya çıkan mortalite, C. albicans yani inoculum39,40,41ayarlanarak uzatılabilir veya kısaltılabilir.
Son zamanlarda laboratuvarımız, ayarlanabilir bir kısıtlama ünitesi ile eşleştirilmiş, uygun bir sistemde, temoregüle edilmiş bir ısıtma ünitesi ile donatılmış yenilikçi bir cihaz kullanarak en uygun şekilde kolaylaştırılmış kuyruk damarı enjeksiyonu için yenilikçi bir protokol geliştirmiştir. Bu protokol, araştırmacıların kuyruk damarı enjeksiyonlarını doğru ve zamanında yapmalarına izin verirken, hayvanlar prosedür için en az sıkıntıyla güvenli bir şekilde koşullandırılabilir ve kısıtlanabilir. Burada gösterilen teknikler, gelişmiş ısıtma ve kısıtlama cihazının kullanımıyla, kemirgen modellerini kullanan çeşitli araştırma alanlarında yararlı bir araç olarak hizmet edebilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans strain DAY185&lt;/em&gt;</td><td>Carnegie Melon University</td><td>N/A</td><td>provided by the laboratory of Aaron Mitchell</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans strain efg1&amp;Delta;/&amp;Delta; cph1&amp;Delta;/&amp;Delta;&lt;/em&gt;</td><td>University of Tennessee Health Sciences Center</td><td>N/A</td><td>provided by the laboratory of Glen Palmer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Candida dubliniensis&lt;/em&gt; strain W&amp;uuml;284</td><td>Trinity College, Dublin, Ireland</td><td>N/A</td><td>provided by the laboratory of Gary Moran</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Charles River Laboratories</td><td>551NCICr:SW</td><td>Female Swiss Webster; 6-8 weeks old</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Charles River Laboratories</td><td>556NCIC57BL/6</td><td>Female C57BL/6; 6-8 weeks old</td></tr><tr><td>Needles, 27G, &amp;frac12;-in</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td>can be substituted from other vendors</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>GE</td><td>SH30028.02</td><td>can be substituted from other vendors</td></tr><tr><td>Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute)</td><td>LSU Health</td><td>custom order</td><td>Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health</td></tr><tr><td>Sabouraud dextrose agar (SDA)</td><td>Becton Dickinson</td><td>211584</td><td>can be substituted from other vendors</td></tr><tr><td>Syringes, 1 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>can be substituted from other vendors</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Yeast peptone dextrose (YPD) broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2469</td><td>can be substituted from other vendors</td></tr></tbody></table>

a contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model

Kemirgen modellerinde kuyruk damarı enjeksiyonları deneysel ajanların intravenöz yönetimi için önemli yöntemlerdir. Kuyruk damarı enjeksiyonları tipik olarak vazodilasyonu teşvik etmek için hayvanın ısınmasını içerir, bu da hem kan damarlarının tanımlanmasına hem de iğnenin damar lümenine yerleştirilmesine yardımcı olur ve hayvanı güvenli bir şekilde dizginler. Kuyruk damarı enjeksiyonları birçok protokolde yaygın prosedürler olmasına ve doğru yapılması durumunda son derece teknik olarak kabul edilmesine rağmen, doğru ve tutarlı enjeksiyonlar tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek ve değişkenliği en aza indirmek için çok önemlidir. Kuyruk damarı enjeksiyonlarından önce vazodilasyonu teşvik etmek için geleneksel yöntemler genellikle ısı lambası, elektrik/şarj edilebilir ısı pedleri veya 37 °C'de önceden ısıtılmış su gibi bir ısı kaynağının kullanılmasına bağlıdır. Standart bir laboratuvar ortamında kolayca erişilebilen bu araçlar açıkça zayıf/sınırlı termo-düzenleyici kapasiteden muzdariptir. Benzer şekilde, çeşitli kısıtlama cihazları ticari olarak mevcut olmasına rağmen, hayvanlara travmayı önlemek için dikkatlice kullanılmalıdır. Mevcut yöntemlerin bu sınırlamaları deneylerde gereksiz değişkenler yaratır veya deneyler ve/veya laboratuvarlar arasında değişen sonuçlarla sonuçlanır.
Bu yazıda, bağımsız, termal olarak düzenlenmiş, ısıtma cihazını ayarlanabilir bir sınırlama ünitesiyle verimli bir şekilde kolaylaştırılmış kuyruk damarı enjeksiyonu için tek bir sistemde birleştiren yenilikçi bir cihaz kullanarak geliştirilmiş bir protokol gösteriyoruz. Kullandığımız örnek, sepsis ile sonuçlanan mantar kan dolaşımı enfeksiyonunun intravenöz bir modelidir. Isınma aparatı, iç sıcaklığı önceden ayarlanmış bir eşikte tutmak için ayarlanabilir otomatik termostat ile monte edilmiş ısı yansıtıcı akrilik bir kutudan oluşur. Aynı şekilde, koni sınırlama cihazının genişliği ve yüksekliği, çeşitli kemirgen boyutlarını güvenli bir şekilde barındıracak şekilde ayarlanabilir. Cihazın gelişmiş ve çok yönlü özellikleri ile burada gösterilen teknik, kuyruk damarı enjeksiyonları kullanan kemirgen modellerini içeren bir dizi araştırma alanında yararlı bir araç haline gelebilir.

Isınma odasının içindeki sıcaklık, iç sensör tarafından sürekli olarak algılanır ve termostat tarafından otomatik olarak düzenlenir. İlk olarak, termostatın kontrol kadranı ayarlanan sıcaklıkları seçmek için 78, 85, 90 veya 95 °F (26, 29, 32 veya 95 °C) olarak konumlandırılmıştır. Isıtıcı etkinleştirildikten sonra(Şekil 7, sarı noktalar), ampul tarafından ısı emisyonu, ayarlanan sıcaklığa bağlı olarak ilk 5-15 dakika boyunca iç sıcaklığı hızla yükseltti. Isıtıcı, tespit edilen iç sıcaklığın ayarlanan sıcaklığı (gri noktalar) aşması durumunda ampulü devre dışı bırakmıştır. İlk pik sıcaklıklar, hayvan transferi sırasında sıcaklık kaybını dengelemek için tüm gruplarda belirlenen sıcaklıkların 5-7 ° C üzerine çıkmalıdır. Daha sonra, cihaz ısı döngüsünü otomatik olarak tekrarlamaya devam eder ve ısınma odasını ayarlanan sıcaklıkta tutar.
Mevcut protokol kullanılarak başarılı kuyruk damarı enjeksiyonları ile elde edilen deneysel verilere bir örnek Şekil 8'de gösterilmiştir. Sepsis ile sonuçlanan bir kan dolaşımı kan dolaşımı kandidiyazis fare modelinde, İsviçre Webster farelerinde Candida albicans (fare başına 1 x10 5 hücre) ile yapılan bir i.v. meydan okuması, sepsisin hızlı bir şekilde başlamasına ve organizmaların yayılmasına neden oldu ve 3-4 gün içinde yüksek mortaliteye yol açtı (açık noktalar) (Şekil 8A). Buna karşılık, hayvanlar önceki i.v. ön bağışıklama / aşı ile avirulent maya suşu, Candida dubliniensis, virülan C. albicans (katı noktalar) ile ölümcül i.v. meydan okumasından sonra% >95 hayatta kalma elde ederek sepsisten korunabilir. Progresif mortalite ve aşı aracılı koruma ile ilgili bu sonuçlar dört bağımsız deneyde tekrarlanabilir olarak elde edilmiştir(Ek Şekil 1). Benzer koruma, zayıflatılmış C. albicans mutantları (Δefg1/Δcph1) (veriler gösterilmez) gibi diğer avirulent maya suşları kullanılarak elde edilebilir. Sepsis de izlenebilir ve mortalite ile ilişkili olabilir; ölümcül enfeksiyona sahip aşılanmamış hayvanlar sepsis kaynaklı morbiditede önemli bir artış gösterirken, aşılanan grup ölümcül meydan okumanın ardından minimum semptomlar gösterdi (Şekil 8B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig01.jpg"> Şekil 1: Kemirgen ısıtma ve kısıtlama cihazının açıklaması. (A) aşağıdakilerden oluşan ısıtma cihazının dış görünümünü gösterir:
<ol><li>Termostat kapağı – termostatı açığa çıkarmak için tutamak tarafından yukarı doğru kaldırın</li>
	<li>Elektrik muhafazası – koruma için kalıcı olarak kapatılmış</li>
	<li>Oda kapağı – hayvan transferi sırasında yukarı doğru kaldırın/buradan</li>
	<li>Isınma odası – çıkarılabilir, kullanmadan önce zemini yataklarla kaplayın</li>
	<li>Kısıtlama aparatı – kullanılmazken ısıtma cihazıyla birlikte yerleştirilebilir</li>
	<li>Güç anahtarı – ana açma/kapama işlevleri için satır içi rocker anahtarı</li>
	<li>Güç kablosu – gerilim/akım: 120V/10A</li>
</ol>(B) ısıtma cihazının içini gösterir:
<ol><li>Akkor ampul – 100 Watt'ta ışık çıkışı</li>
	<li>Ampul koruyucu kalkan – ampul değişimi için çıkarılabilir</li>
	<li>Sıcaklık sensörü probu – odanın içinde bulunur</li>
	<li>İç sıcaklık termometresi - sıcaklığı izlemek için haznenin içine yerleştirin</li>
</ol>(C) ısıtma cihazı termostatının bileşenlerini gösterir:
<ol><li>İç sıcaklık termometresi</li>
	<li>Termostat – ısıtıcıyı otomatik olarak düzenler</li>
	<li>Setpoint kontrol kolu – minimum/maksimum: 78 °F/108 °F (25 °C/42 °C)</li>
	<li>Termostat güç göstergesi – yeşil ışık normal çalışma gösterir</li>
	<li>Termostat ısıtıcı göstergesi – ısıtma döngüsü sırasında kırmızı yanar</li>
</ol>(D) sınırlama cihazının bileşenlerini gösterir:
<ol><li>Koni – kemirgen kısıtlaması için tasarlanmış esnek alüminyum levha</li>
	<li>Kuyruk kanalı – kuyruğun düzgün konumlandırılmasına izin vermek için şekillendirildi</li>
	<li>Koni kaldırma platformu - koni tabanının sağlam bir şekilde kaldırılmasını sağlar</li>
	<li>Yükseklik ayarlama düğmesi – manuel yükseklik ayarı için tasarlanmıştır</li>
	<li>Makas jakı – yükseklik aralığı 45–140 mm (1,77-5,52")</li>
	<li>Destek plakası – stabilite sağlamak için kauçuk ayaklarla monte edilmiş <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61961/61961fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig02.jpg"> Şekil 2: Kemirgen ısıtma ve kısıtlama cihazı. (A) Kullanmadan önce, cihazın iki parçası temiz bir tezgah üstüne yan yana yerleştirilir. (B) Isınma cihazı açıldıktan sonra, termostat ısıtıcıyı etkinleştirir. Ampul yanmaya devam eder ve ısınma odası ayarlanan sıcaklığa ulaşana kadar ısı yayar. Isınma cihazı, iç sıcaklığı korumak için ısı döngüsünü otomatik olarak tekrarlar. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61961/61961fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig03.jpg"> Şekil 3: Isınma ve kısıtlama cihazına yerleştirilen fareler (C57BL/6). (A) Vazodilasyon için ısıl işlem gören fareler. Hayvanlar (tedavi başına 4-6 fare) barınma kafeslerinden cihazın ısınma odasına aktarılır ve en az 5-10 dakika ısıl işlemden geçirilir. Fare, ısınma odasından, kuyruğu açık yarıktan geçen sınırlama cihazının koni açıkına aktarılır. Fare, kuyruğun tabanı koninin ucuna ulaşana kadar koninin uzak kenarına hafifçe geri çekilir. Hayvan hafif bir yanal dönüşle koninin tabanına doğru çekilirken, bir arka bacak yukarı doğru konumlandırılmıştır, böylece açık yarıktan çıkıntı yaparak yanal kuyruk damarının saat 12'de konumlandırılmasını sağlar. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61961/61961fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig04.jpg"> Şekil 4: Farelerde lateral kuyruk damarlarının tanımlanması. (A) Tedavi edilmemiş bir İsviçre Webster faresinin kuyruğu. Fare, vazodilasyon için önceden ısıl işlem yapılmadan kısıtlama cihazına yerleştirilir. Yanal kuyruk damarı, cildin altından geçen ince koyu bir damar olarak tanımlanabilir. (B) 10 dakika boyunca ısıtma cihazı ile tedavi edilen İsviçreli bir Webster faresinin kuyruğu. Isıl işlem görmüş fare kuyruk damarı enjeksiyonu için kısıtlanmıştır. Lateral kuyruk damarı, vazodilasyonun neden olduğu genişlemiş damar çapı nedeniyle ciltten kolayca görülebilir. (C) Bir C57BL / 6 farenin kuyruğu 10 dakika boyunca ısıtma cihazı ile tedavi edilir ve kuyruk damarı enjeksiyonu için kısıtlanır. Vazodilasyon, damara karşı zayıf bir renk kontrastı nedeniyle damar açık renkli İsviçre Webster farelerindeki kadar kolay görünmese de, derin pigmentli ciltten kuyruk damarının görünürlüğünü arttırır. Kırmızı oklar yanal kuyruk damarının yerini gösterir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61961/61961fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig05.jpg"> Şekil 5: Isıl işlem görmüş farelerde (Swiss Webster) yapılan kuyruk damarı enjeksiyonu. (A–B) Enjeksiyon yerindeki lateral kuyruk damarına iğne yerleştirilmesi. İğne (27 G, 1/2-in) kuyruk damarına paralel olarak eğim yukarı doğru konumlandırılmış ve kan akışına doğru yönlendirilmiş ve yerleştirilmiştir. (C–D) Kuyruk damarında iğne yerleşimi ve enjeksiyon. İğnenin ucu damarın lümenine 2-4 mm daha ilerlemiş. Başparmak şırınnanın pistonu üzerine yerleştirilmiştir ve istenen hacim yavaş ve sabit basınçla dağıtılmıştır. Oval daireler enjeksiyon bölgelerini gösterir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61961/61961fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig06.jpg"> Şekil 6: Enjeksiyon sonrası prosedür. (A) Enjeksiyon bölgesinde kanama bölgesi. Enjekte edilen çözeltinin kanaması ve geri akışı iğne çıkarıldıktan hemen sonra meydana gelir. Bu, başparmakla enjeksiyon bölgesine sıkı sıkıştırma uygulanarak en aza indirilebilir. (B) Enjeksiyon yerinde kan pıhtısı oluşumu. Temiz bir gazlı bez/silme ile nazik sıkıştırma, enjeksiyon yarası üzerinde kanın pıhtılaşmasını kolaylaştırır. Oklar ekleme alanlarını gösterir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61961/61961fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig07.jpg"> Şekil 7: Kullanım sırasında ısınma odasının iç sıcaklığı. Isınma cihazı belirlenen sıcaklıklarda ısınmak için etkinleştirildi. Cihazın ısınma odası iç hava sıcaklığı için izlendi ve ısı döngüleri (ampul açık / sarı noktalar, kapalı / gri noktalar) 45 dakika boyunca kaydedildi. Turuncu alan, kemirgenlerde vazodilasyonun indüksiyonu için en uygun sıcaklık aralığını gösterir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61961/61961fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig08.jpg"> Şekil 8: Sepsis mortalitesi, Candida albicansile ölümcül bir meydan okumanın ardından aşı aracılı korumaya karşı . Fareler (8 haftalık İsviçre Webster dişileri) 14 gün sonra avirulent live Candida dubliniensis Wü284(Cd)ile intravenöz olarak aşılandı ve ardından vahşi tip C. albicans DAY 185 (fare başına 1 x 105 hücre) ile ölümcül bir intravenöz meydan okuma yapıldı. (A)Mortalite, ölümcül meydan okumadan sonraki 10 gün boyunca değerlendirildi. (B) Hayvanlar sepsis morbiditesi açısından izlendi ve Sepsis için değiştirilmiş Fare Klinik Değerlendirme Puanına göre puanlandı (M-CASS)43. Veriler, grup başına 10 fare ile yapılan 4 bağımsız deneyden kümülatiftir ve Mantel-Cox log-rank testi kullanılarak analiz edilir. s < 0.0001. SEM, ortalamanın standart hatası. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61961/61961fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Kan dolaşımı Candida albicans mücadelesinden sepsis mortalitesinin tekrarlanabilirliği ve aşı aracılı sağkalım. Her panel, Şekil 8A'dagösterilen kümülatif bir sonuca dahil edilen dört bağımsız denemeden elde edilen verileri temsil eder. Her deney grup başına 10 fare kullanılarak yapıldı ve Mantel-Cox log-rank testi kullanılarak analiz edildi. Ca, Candida albicans. Cd, Candida Dubliniensis. s < 0.0001. s < 0.01. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61961/supfig01.jpg" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model at JoVE.com

A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model

Burada, benzersiz bir şekilde tasarlanmış bir ısıtma / kısıtlama cihazı kullanarak kemirgen kuyruk damarı enjeksiyonları için etkili ve verimli bir yöntem sunuyoruz. Vazodilasyon ve kısıtlama süreçlerinin başlatılmasını kolaylaştırarak, bu protokol, en az sıkıntıya sahip büyük hayvan gruplarının doğru ve zamanında intravenöz enjeksiyonlarına izin verir.

Murine Mantar Sepsis Modelinde Verimli Kuyruk Damarı Enjeksiyonları için Çağdaş Isınma/Kısıtlama Cihazı

In rodent models, tail vein injections are important methods for intravenous administration of experimental agents. Tail vein injections typically involve ...

a-contemporary-warmingrestraining-device-for-efficient-tail-vein

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K Görüntüleme.  Louisiana State University Health-School of Dentistry. Burada, benzersiz bir şekilde tasarlanmış bir ısıtma / kısıtlama cihazı kullanarak kemirgen kuyruk damarı enjeksiyonları için etkili ve verimli bir yöntem sunuyoruz. Vazodilasyon ve kısıtlama süreçlerinin başlatılmasını kolaylaştırarak, bu protokol, en az sıkıntıya sahip büyük hayvan gruplarının doğru ve zamanında intravenöz enjeksiyonlarına izin verir.

Video: A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Enfarktüsü bir murin Model Koroner Arter ligasyon ve intramiyokardiyal Enjeksiyon

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Tıp

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Kanser Araştırmaları

A New Best Practice for Validating Tail Vein Injections in Rat with Near-infrared-Labeled Agents

Intravenous (IV) administration of agents into the tail vein of rats can be both difficult and inconsistent. Optimizing tail vein injections is a key part of many experimental procedures where reagents need to be introduced directly into the bloodstream. Unwittingly, the injection can be subcutaneous, possibly altering the scientific outcomes. Utilizing a nanoemulsion-based biological probe with an incorporated near-infrared fluorescent (NIRF) dye, this method offers the capability of imaging a successful tail vein injection in vivo. With the use of a NIRF imager, images are taken before and after the injection of the agent. An acceptable IV injection is then qualitatively or quantitatively determined based on the intensity of the NIRF signal at the site of injection.

Here we present a method to validate tail vein injections in rats by utilizing near-infrared fluorescence imaging data from dyes incorporated into agents or biological probes. The tail is imaged before and after the injection, the fluorescent signal is quantified, and an assessment of the injection quality is made.

Kuyruk ven enjeksiyonları sıçan-kızılötesi-etiketli ajanlar ile doğrulamak için yeni bir en iyi yöntem

Intravenous (IV) administration of agents into the tail vein of rats can be both difficult and inconsistent. Optimizing tail vein injections is a key part ...

Murine Model of Central Venous Stenosis using Aortocaval Fistula with an Outflow Stenosis

Central venous stenosis is an important entity contributing to arteriovenous fistula (AVF) failure. A murine AVF model was modified to create a partial ligation of the inferior vena cava (IVC) in the outflow of the fistula, mimicking central venous stenosis. Technical aspects of this model are introduced. The aorta and IVC are exposed, following an abdominal incision. The infra-renal aorta and IVC are dissected for proximal clamping, and the distal aorta is exposed for puncture. The IVC at the midpoint between the left renal vein and the aortic bifurcation is carefully dissected to place an 8-0 suture beneath the IVC. After clamping the aorta and IVC, an AVF is created by puncturing the infra-renal aorta through both walls into the IVC with a 25 G needle, followed by ligating a 22 G intra-venous (IV) catheter and IVC together. The catheter is then removed, creating a reproducible venous stenosis without occlusion. The aorta and IVC are unclamped after confirming primary hemostasis. This novel model of central vein stenosis is easy to perform, reproducible, and will facilitate studies on AVF failure.

An aortocaval fistula was created by puncturing the murine infra-renal aorta through both walls into the inferior vena cava and was followed by creation of a stenosis in its outflow via partial ligation of the inferior vena cava. This reproducible model can be used to study central venous stenosis.

Bir outflow stenozu ile Aokaval fistül kullanarak Merkezi venöz stenozis murine modeli

Central venous stenosis is an important entity contributing to arteriovenous fistula (AVF) failure. A murine AVF model was modified to create a partial ...

A Murine Tail Lymphedema Model

Lymphedema is extremity swelling caused by lymphatic dysfunction. The affected limb enlarges because of accumulation of fluid, adipose, and fibrosis. There is no cure for this disease. A mouse tail model that uses a focal full thickness skin excision near the base of the tail, resulting in tail swelling, has been used to study lymphedema. However, this model may result in vascular comprise and consequent tail necrosis and early tail swelling resolution, limiting its clinical translatability. The chronic murine tail lymphedema model induces sustained lymphedema over 15 weeks and a reliable perfusion to the tail. Enhancements of the traditional murine tail lymphedema model include 1) precise full thickness excision and lymphatic clipping using a surgical microscope, 2) confirmation of post-operative arterial and venous perfusion using high resolution laser speckle, and 3) functional assessment using indocyanine green near infrared laser lymphangiography. We also use tissue nanotransfection technology (TNT) for novel non-viral, transcutaneous, focal delivery of genetic cargo to the mouse tail vasculature.

Lymphedema is extremity swelling caused by lymphatic dysfunction. We describe a chronic murine tail model of lymphedema and the novel use of tissue nanotransfection technology (TNT) for genetic cargo delivery to the tail.

Bir Murine Kuyruk Lenfödem Modeli

Lymphedema is extremity swelling caused by lymphatic dysfunction. The affected limb enlarges because of accumulation of fluid, adipose, and fibrosis. ...

Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice

Tail bleeding models are important tools in hemophilia research, specifically for the assessment of procoagulant effects. The tail vein transection (TVT) survival model has been preferred in many settings due to sensitivity to clinically relevant doses of FVIII, whereas other established models, such as the tail clip model, require higher levels of procoagulant compounds. To avoid using survival as an endpoint, we developed a TVT model establishing blood loss and bleeding time as endpoints and full anesthesia during the entire experiment. Briefly, anesthetized mice are positioned with the tail submerged in temperate saline (37&#176;C) and dosed with the test compound in the right lateral tail vein. After 5 min, the left lateral tail vein is transected using a template guide, the tail is returned to the saline, and all bleeding episodes are monitored and recorded for 40 min while collecting the blood. If no bleeding occurs at 10 min, 20 min, or 30 min post-injury, the clot is challenged gently by wiping the cut twice with a wet gauze swab. After 40 min, blood loss is quantified by the amount of hemoglobin bled into the saline. This fast and relatively simple procedure results in consistent and reproducible bleeds. Compared to the TVT survival model, it uses a more humane procedure without compromising sensitivity to pharmacological intervention. Furthermore, it is possible to use both genders, reducing the total number of animals that need to be bred, in adherence with the principles of 3R&#39;s. A potential limitation in bleeding models is the stochastic nature of hemostasis, which can reduce the reproducibility of the model. To counter this, manual clot disruption ensures that the clot is challenged during monitoring, preventing primary (platelet) hemostasis from stopping bleeding. This addition to the catalog of bleeding injury models provides an option to characterize procoagulant effects in a standardized and humane manner.

The refined tail vein transection (TVT) bleeding model in anesthetized mice is a sensitive in vivo method for the assessment of hemophilic bleeding. This optimized TVT bleeding model uses blood loss and bleeding time as endpoints, refining other models and avoiding death as an endpoint.

Tam Anestezi Uygulanan Hemofili A Farelerinde Kuyruk Ven Transeksiyonu Kanama Modeli

Tail bleeding models are important tools in hemophilia research, specifically for the assessment of procoagulant effects. The tail vein transection (TVT) ...

Biyoloji

Preklinik Fare Modellerinde İntravenöz Enjeksiyon Yoluyla AAV Bazlı Tedaviler

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the affected cells located in different sites. Intravenous injection is a widely used systemic delivery route in preclinical studies that assess treatments intended for body-wide administration. In adult mice, it involves the intravenous administration of the therapeutic agent into the mouse&#39;s lateral tail veins. When mastered, tail-vein injections are safe and fast, and only require simple and commonly available tools. However, tail-vein injections are technically challenging and require extensive training and continuous practice to ensure the accurate delivery of the intended dose.
Here we describe a detailed, optimized, lateral tail-vein injection protocol that we have developed based on our experience and on recommendations that had been previously reported by other groups. Other than the mouse restrainers and insulin syringes, this protocol requires only reagents and equipment that are readily available in most labs. We found that following this protocol results in consistently successful intravenous delivery of adeno-associated virus (AAV) into the tail veins of unsedated 7-9 week-old mice. Additionally, we describe the optimized protocols for the histological detection of fluorescent reporter proteins and vector genome per diploid genome (vg/dg) quantification used to assess AAV transduction and biodistribution. The goal of this protocol is to aid experimenters in easily performing tail-vein injections successfully and consistently, which can reduce the practice time needed to master the technique.

Yazar Spotlight: Kas Distrofileri ve Nöromüsküler Bozukluklar için Gen Terapileri Geliştirme

Here we detail an optimized protocol for mouse lateral tail-vein injection to systemically administer adeno-associated virus (AAV) in adult mice. Additionally, we describe protocols of commonly used assays to assess AAV transduction.

Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

Compound Administration I

Source: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. University of Notre Dame, IN
As many research protocols require that a substance be injected into an animal, the route of delivery and the amount of the substance must be accurately determined. There are several routes of administration available in the mouse and rat. Which route to use is determined by several factors of the substance to be injected: the pH of the solution, the volume required for the desired dosage, and the viscosity of the solution. Severe tissue damage can occur if a substance is administered incorrectly. This video looks at the various restraint methods and technical details for the most commonly used injection routes.

Compound Administration in Rodents- Injection Techniques

Source: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. University of Notre Dame, IN
As many research protocols require that a substance ...

Murine Mantar Sepsis Modelinde Verimli Kuyruk Damarı Enjeksiyonları için Çağdaş Isınma/Kısıtlama Cihazı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Enfarktüsü bir murin Model Koroner Arter ligasyon ve intramiyokardiyal Enjeksiyon

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Kuyruk ven enjeksiyonları sıçan-kızılötesi-etiketli ajanlar ile doğrulamak için yeni bir en iyi yöntem

Bir outflow stenozu ile Aokaval fistül kullanarak Merkezi venöz stenozis murine modeli

Bir Murine Kuyruk Lenfödem Modeli

Tam Anestezi Uygulanan Hemofili A Farelerinde Kuyruk Ven Transeksiyonu Kanama Modeli

Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

Compound Administration I