Bu protokol, dev bir ankyrin-G'nin yokluğu nedeniyle önceden monte edilmiş AIS'den yoksun Hipokampal Nöronların akson ilk segmentlerinin montajını ve yapısını nicel olarak incelemek için kullanılır. Başlamak için, bir Petri kabında HBSS ortamına sahip altı ila sekiz hipokampiyi doğum sonrası, bir günlük yavrulardan parçalara ayırt edin. Hipokampiyi diseksiyon makasıyla daha küçük parçalara ayırın ve tabaktan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Hipokampiyi beş mililitre HBSS ile iki kez yıkayın ve yıkadıktan sonra 4,5 mililitre HBSS'de bırakın. 4,5 mililitre HBSS'ye 0,5 mililitre %2,5 trypsin ekleyin ve 37 santigrat derecelik su banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatırarak tüpü her beş dakikada bir ters çevirin. İyi sindirilmiş hipokampi yapışkan hale gelmeli ve bir küme oluşturmalıdır.
Gerekirse, sindirimi beş dakika daha uzatın. Hipokampiyi HBSS ile yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Yıkamadan sonra, iki mililitre HBSS ekleyin ve hipokampiyi 15 kez pasteur pipetle yukarı ve aşağı pipetleyin.
Dokuyu 10 kez ateş cilalı pasteur pipetle üçe bölün ve tüm parçalar dibe ayarlanana kadar tüpü beş dakika dinlendirin. Çoğu kaybolana kadar tritürasyonu kalan parçalarla tekrarlayın. Daha sonra, ayrışmış nöronları içeren süpernatantı kaplama yemeklerine hafifçe aktarmak için bir mililitre pipet ucu kullanın.
Doğrudan önceden inkübe edilmiş kaplama ortamına ekleyin ve plakayı hafifçe sallayın. Tohumlamadan iki ila dört saat sonra, kaplama yemeklerini hafif bir mikroskopla kontrol edin. Nöronların çoğu kapak kaymasına bağlı olmalıydı.
İnce uçlu bir önpsek kullanarak, kapak kaymalarını balmumu noktaları tarafı aşağı bakacak şekilde ön koşullanmış nöronal kültür ortamı içeren glial hücre besleyici tabaklarına çevirin. Nöronlar glial hücre besleyici yemeklerinde bir aya kadar büyüyebilir. Nöronları her yedi günde bir mililitre taze nöron kültürü ortamıyla besleyin.
Üçüncü gün in vitro, balmumu nokta tarafı yukarı bakacak şekilde kapak kaymalarını şartlandırılmış nöronal kültür ortamına sahip bir glial hücre besleyici kabına çevirin. Dört kapak fişini transfect etmek için 1,7 mililitrelik bir tüpte 0,25 mikrogram CRE BFP DNA'sını 0,5 mikrogram ankyrin-G GFP DNA ile karıştırın. Optimum 100 mikrolitre ekleyin.
Sonra tüpü karıştırın ve bir rafa dinlendirin. Sadece CRE BFP transfected ise, GFP plazmik omurgası toplam DNA miktarıyla eşleşmek için kullanılır. Üç mikrolitre transfeksiyon reaktifini 1,7 mililitrelik yeni bir tüpte 100 mikrolitre optimum ile karıştırın ve tüpü oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, daha önce karıştırılan DNA'nın 100 mikrolitresini 100 mikrolitre transfeksiyon reaktif karışımı ile karıştırın ve bir rafta beş ila 10 dakika bekletin. Kapak kaymalarına dokunmadan ucu ortamın hemen altına yerleştirerek her kapak fişinin üzerine 50 mikrolitre DNA karışımı ekleyin. DNA karışımını yaymamak için yavaşça pipet.
Yemeği yavaşça inkübatöre geri getirin ve 30 ila 45 dakika orada bırakın. Kapak kaymalarını balmumu nokta tarafı aşağı bakacak şekilde ev glial besleyici kabına geri çevirin ve kabı tekrar inkübatöre koyun. AIS nicelemesi için Fiji'deki Z serisi görüntüleri açın ve maksimum görüntü projeksiyonu oluşturun.
Görüntüden boş kapak kayması arka plan sinyalini çıkardıktan sonra, çizginin genişliğinin AIS'yi tam olarak kapsadığından emin olarak AIS boyunca bir çizgi çizin. AIS sinyali arka planın üzerine çıkmadan önce satırı başlatın ve arka plana düştükten sonra durun. Satır boyunca ortalama piksel yoğunluğunu ölçün ve bir elektronik tabloya dışa aktarın.
Ardından, son rakamı oluşturmak için bir MATLAB komut dosyası çalıştırın. Deney, negatif kontrol olarak sadece Cre-BFP transfeksiyonunu, pozitif kontrol olarak Cre-BFP artı 480 kilodalton ankyrin-G kotransfeksiyonunu ve teknik kontrol olarak transfeksiyonsuz bir durumu içermelidir. Sadece Cre-BFP kontrolünde, transfected nöronlar ankyrin-G, beta 4 spektrin, nörofassin ve voltaj kapılı sodyum kanalları da dahil olmak üzere AIS belirteçlerinin birikmesinden yoksundir.
Buna karşılık, Cre ve 480 kilodalton ankyrin-G ko-transfected nöronları, AIS belirteçlerinin varlığı ile gösterilen AIS'yi tamamen bir araya getirmişlerdir. Transfected olmayan yemekler ile karşılaştırıldığında kültürün kalitesini onaylamak önemlidir. Sağlıksız nöronlar, durdurulmuş veya ektopik AIS gibi anormal AIS yapısı gösterme eğilimindedir.
Ankyrin-G insan nörogelişimsel bozukluk mutasyonu AIS derlemesini nasıl etkilediğini değerlendirmek için, ortalama AIS yoğunluğu somadan distal aksona kadar çizildi. AIS zenginleştirilmiş proteinler normalde proksimal aksondan gelen sinyalin hızlı bir şekilde arttığını ve sinyalin distal aksona yavaş bir şekilde azaldığını gösterir. Transfected olmayan AIS ile hizalandığında, mutant eğri daha geniştir ve eğrinin zirvesi daha düşüktür, bu da AIS'nin yapı değişikliğini düşündürür.
Vahşi tip ankyrin-G, AIS'i transfected olmayanla yakından hizalanmış olarak bir araya getirmiş.
