Isı şoku tepkisi sitoplazmik proteostazı koruyan ve deniz eleganlarında moleküler, hücresel ve organizma salalarında karakterize edilebilen önemli bir hücresel stres yanıt yoludur. Isı şoktepkisi alanında tekrarlanabilirliği artırmaya yardımcı olmak için deniz eleganlarında ısı şoktepkisinin sağlam indüksiyonu oluşturan bir dizi standart protokol ve en iyi uygulamaları saiyoruz. Yaygın olarak kullanılan bir organizma analizi olan termo toleransın ısı şoku tepkisine bağlı olmadığını gösteriyoruz.
Bunun yerine, ısı şoku tepkisine bağımlı bir organizma olan termal geri kazanım kullanmanızı öneririz. Isı şoku tepkisi, yumurtlamanın başlangıcıyla zayıflatılır. Bu nedenle, gelişimsel zamanlama ısı şoku tepki deneylerinde hesaba katılması gereken kritik bir değişkendir.
Senkronize solucan popülasyonu oluşturarak başlayın. Yaklaşık 10 gravid yetişkin solucanı taze bir tabağa aktarmak için platin tel çekme kullanın. Yetişkinlerle birlikte transfer edilmiş olabilecek yumurta veya larvaları çıkardığınızdan emin olun.
Solucanlar bir saat için yumurtlamak için izin, sonra plaka dan yetişkin kaldırın. Senkronize solucanları istenilen gelişim aşamasına kadar 20 derecede koruyun, gelişimsel zamanlamanın her zorlanmaya ve solucanların yükseltildiği sıcaklıkla değiştiğini göz önünde bulundurarak. Solucanlar ısı şoku için hazır olduğunda, parafin film ile plakaları sarın ve bir saat boyunca 33 santigrat derece dolaşan bir su banyosu onları batırmak için kurşun ağırlığı ile bir test tüpü raf kullanın.
Su banyosundan tabakları kurtarın ve kağıt havlu ile kurulayın. Parafin filmini çıkarın ve solucanların 20 derecede 6 ila 24 saat boyunca toparlanmasına izin verin, bu da GFP sentezi için yeterli bir zaman olacaktır. Görüntüleme için slaytlar hazırlamak için, üzerinde laboratuvar bandı şeridi olan diğer iki slayt arasına bir mikroskop slaytı yerleştirin.
Suda %3 agarose çözeltisi yapın ve agaroselar eriyene kadar mikrodalgada ısıtın. Sonra slayt merkezine agarose yaklaşık 150 mikrolitre yerleştirmek için bir mililitrelik pipet kullanın. Hemen boş bir slayt ile slayt kapağı, böylece laboratuvar bandı üzerinde dayanıyor dik yerleştirerek, sonra dikkatlice kaldırın.
Solucanları hareketsiz hale getirmek için, agarose pedinin ortasına bir milimolar levamisole, bir M9 tamponküçük bir damla ekleyin ve platin tel çekme kullanarak damla içine 10 solucan transfer. İsteğe bağlı olarak, levamisole kapalı agarose ped in dışına yayıldı ve onlar felç olduğunda almak ile solucanlar hizalamak. Solucanları bir kapak fişi ile kapatın ve floresan mikroskobu kullanarak mümkün olan en kısa sürede görüntüleyin.
Termokurtarma tayini yapmak için solucanları senkronize edin ve istenilen gelişim aşamasına kadar 20 derece santigrat derecede muhafaza edin. Sonra onları altı saat ısı şoku. Su banyosundan tabakları çıkarın ve 48 saat boyunca 20 derecede iyileşmelerini bekleyin.
İyileştikten sonra, sarsıntılı hareket veya felç olmadan mekanik stimülasyon dan sonra hemen uzak craw olabilir solucanların sayısını saymak. Hücresel düzeyde ısı şoku tepki indüksiyonu görselleştirmek için, iki floresan muhabir deniz elegans suşları analiz edildi. Isı şoku olmadan negatif kontrol örneklerinde, hsp-16.2 muhabiri normal otomatik floresan gösterdi, ama hsp-70 muhabiri anal depresör kas kurucu floresan vardı.
Bir saatlik ısı şokundan sonra, rnai muhabir indüksiyonölçmeden önce HSF-1'i devirmek için kullanıldığında her iki muhabirde de sağlam floresan gözlendi. Her iki suşun floresansı ciddi şekilde azalmış, bu da bu muhabirlerin HSF-1'e bağımlı olduğunu gösteriyor. Moleküler düzeyde ısı şoku tepkisinin indüksiyonu için rt tuşu PCR ile iki yerli ısı şokproteini ölçüldü.
Bir saat 33 derece Santigrat ısı şokunun iki ısı şoku geninin göreceli ifadesinde 2.000 kat artışa neden olduğu bulunmuştur. Termokurtarma test, altı saatlik ısı şokuna maruz kalmanın 48 saatlik bir iyileşmeden sonra normal hareket eden solucanlarda %20'lik bir azalmaya yol açtığını göstermiştir. HSF-1'in yıkılması normal harekette dramatik bir düşüşe neden olurken, solucanların %95'inden fazlası prodded edildikten sonra sarsıntılı hareket veya felç gösterdi.
Buna karşılık, hsf-1'in nakavtı, solucanların sürekli 35 derece lik santigrat sıcaklığa maruz kaldığı ve solucanların canlı lık yüzdesi çeşitli zaman noktalarında ölçüldüğü termo tolerans tahkikatSonuçları üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi. Bu tekniği ilk kez yaparken, suyun plakalara girmesini ve deneyi mahvetmesini önlemek için plakaları iki kez parafin filmle sardığından emin olun. Moleküler tahliller RNA-seq kullanılarak genomik analizlere genişletilebilir.
Isı şoku tepkisinden etkilenen diğer organizma salaları da dahil edilebilir, örneğin yaşam süresi. Deniz elegans moleküler, hücresel ve organizmasal ısı şoku yanıt tahlilleri ilişkilendirmek için benzersiz yeteneği geliştirme ve hastalık bu yolun rolünü anlamak için paha biçilmez kanıtlamıştır.
