Protokolümüz dendritik hücrelerde HSV-1 kaynaklı otofajik ciroya etkin bir şekilde müdahale etme yöntemlerini açıklamaktadır. Ve özellikle, enfeksiyon dan önce otofajiyi engellemek için siRNA tabanlı bir strateji ile inhibitör tabanlı karşılaştırıyoruz. Otofaji ile inhibitör tabanlı girişim potansiyel ve belirli hedef dışı etkileri içerirken, gelişmiş siRNA tabanlı stratejimiz daha hedefe özgüdür.
Daha da önemlisi, sunulan her iki teknik de hastalığın olgunlaşma aşamalarını etkilemez. Prosedürü gösteren petra Muhl-Zurbes, bir teknisyen, ve Alexandra Duthorn, yüksek lisans öğrencisi, benim laboratuvar dan olacaktır. Olgunlaşmamış dendritik hücreleri veya iDC'leri, dördüncü gün sonrası yapışmada hücre kültürü şişesinin alt kısmından gevşek yapışık hücreleri hafifçe durulayarak hasat ederek başlayın.
Olgun dendritik hücreler veya mDC'ler oluşturmak için hücrelere olgunlaşma kokteyli ekleyin. Olgunlaşma indüksiyonundan iki gün sonra, hücre kültürü şişesinin alt kısmından mDC'leri durulayın. İki kez durulayın, sonra kendi kültür ortamında 50 mililitretüpler için iDC ve mDC'ler aktarın.
Hücreleri santrifüj yoluyla 300 kez g beş dakika hasat edin. Hücreleri hücre kültürü şişesi başına 5 ila 10 mililitre RPMI 1640 oranında hafifçe askıya alın ve ilgili DC süspansiyonları tek bir tüpte birleştirin. Daha sonra, DC'leri kullanırken sıcaklık değişikliklerini önlemek için bir sayma odası kullanarak hücreleri ölçün.
İki milyon iDC'yi veya mDC'yi iki mililitrelik bir tüpe aktarın, 3,390 kez g'de 1-1/2 dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Yavaşça enfeksiyon orta hücreleri resuspend. Enfeksiyondan bir saat önce enfeksiyon ortamına 10 mikromolar spautin-1 veya bir mikromolar bafilomisin A1 ekleyerek otofazomal lisozomal bozulma yolunu inhibe edin.
İşlenmemiş kontrol için DMSO ekleyin ve 300 RPM sallayarak 37 santigrat derece bir ısıtma bloğu üzerinde hücreleri kuluçka. Enfeksiyon çalışmaları için, iki enfeksiyon çokluğu hsv-1 virions ile hücreleri aşılamak. Sahte bir kontrol olarak MNT tampon ilgili hacmi ekleyin ve sallayarak bir saat boyunca 37 santigrat derece bir ısıtma bloğu üzerinde hücreleri kuluçka.
Enfeksiyondan bir saat sonra, 3, 390 kez g 1-1/2 dakika santrifüj yoluyla hücreleri toplamak, sonra yavaşça inoculum aspire ve DC ortamda hücreleri resuspend. Tohum sahte tedavi ve HSV-1 altı iyi plaka içine mililitre başına bir milyon hücrenin son konsantrasyonunda enfekte hücreleri. 16 ila 24 saat enfeksiyon sonrası, bir hücre kazıyıcı veya mm'ler kullanarak iCD'ler hasat durulama, 1,5 mililitrelik güvenli kilit tüpü içine hücreleri aktarın ve 3, 390 kez g 1-1/2 dakika için santrifüj yoluyla toplamak.
Kuyularda kalan hücrelerle hasat ve santrifüjtekrar edin, sonra peleti bir mililitre PBS ile bir kez yıkayın ve lysis karışımındaki hücreleri şiddetle yeniden askıya alın. Örnekleri 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın ve sonra 10 dakika boyunca 95 santigrat dereceye ısıtın. LC3B1 ve LC3B2, P62, ICP0 ve ICP5 ve GAPDH protein düzeylerini doğrulamak için SDS sayfası ve batı leke analizini gerçekleştirin.
Gün 3.5 sonrası bağlılık, 50 mililitrelik tüp içine 12 milyon iDC aktarın, beş dakika için 300 kez g santrifüj, ve sonra supernatant atın. Buna paralel olarak, olgunlaşma durumunu izlemek için akış sitometrik analizi gerçekleştirin. IDC'leri beş mililitre Opti-MEM'de fenol kırmızısı olmadan hafifçe yıkayın ve 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin.
Süpernatant atın ve 100 mikrolitre başına altı milyon hücre için hücre konsantrasyonu ayarlayarak Opti-MEM 200 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Dört milimetrelik elektrocuvettes veya FIP200 özgül veya şifreli siRNA 75 picomoles ekleyin ve ilgili cuvette içine hücre süspansiyon 100 mikrolitre aktarın. Doğrudan bir elektroporasyon cihazı kullanarak iDC'ler darbe.
Elektroporasyondan sonra, iDC'leri taze önceden ısıtılmış DC ortamıyla altı kuyulu plakalara aktarın, hücreleri mililitre başına bir milyon hücrenin son konsantrasyonuna yerleştirin ve kuvöze yerleştirin. 48 saat sonra, elektrohaplı iDC'lerin morfolojisini mikroskobik olarak inceleyin, sonra hücreleri kazıyıcı ile hasat edin ve 15 mililitrelik tüplere aktarın. %0,1 EDTA ile desteklenen bir mililitre PBS ile kuyuları durulayın ve çözümü ilgili tüplere aktarın.
Daha sonra el yazmasında açıklandığı gibi her siRNA koşulu için hücreleri bölün. Olgunlaşma durumunu ve hücre canlılığını değerlendirmek için 500,000 hücre kullanın, FIP200 spesifik nakavt verimliliğini doğrulamak için batı leke analizi için bir milyon hücre kullanın ve kalan hücreleri HSV-1 enfeksiyon deneyleri için kullanın. Oluşturulan iDC'ler ve mDC'ler, diğer hücre tipleri ile kontaminasyonu dışlamak ve olgunlaşma durumlarını doğrulamak için akış sitometrisi tarafından fenotipik olarak analiz edildi.
Hücreler sırasıyla T-hücre ve monosit kontaminasyonunu dışlamak için CD3 ve CD14 antikorları ile boyandı. Hücreler CD11c için boyanmış olan DC'ler için yüksek ifade genel marker olarak hizmet vermektedir. Olgunlaşma durumunu değerlendirmek için CD80, CCR7, CD83 ve MHCII antikorları kullanıldı çünkü bu moleküller olgun DC'lerde yüksek oranda ifade edilir.
Flüoresans mikroskobu ve akış sitometrisi HSV-1'i ifade eden EGFP enfeksiyonu belirlemek için kullanıldı. Güçlü GFP sinyalleri, iDC ve mDC'lerin neredeyse tamamen enfeksiyona bulaşmasını gösterir. Batı leke analizi, Spautin-1 veya bafilomisin A1'in HSV-1 enfekte hücrelerinde otofalastik akı inhibe edip etmediklerini belirlemek için kullanıldı.
IDC'lerde, otophagic akı spautin-1 ve bafilomisin A1 yokluğunda P62 ve LC3B ekspresyonunun azalması ile gösterilmiştir. Buna karşılık, spautin-1 yokluğunda mCD'lerin HSV-1 enfeksiyonu P62 ekspresyonunu etkilemezken, spautin-1 ve BA1 tedavisi otofaji indüksiyonunu yansıtan lc3B-II birikimini tetiklerken, mCD'lerde otophagic ciro başarısızlığı. SiRNA elektroporasyonu ile FIP200 protein düzeylerini azaltmak da HSV-1 enfekte iDC'lerde otophagic akı güçlü bir azalmaya neden olur.
Otofaji inhibisyonu için bu siRNA tabanlı elektroporasyon protokolü hücre canlılığını etkilemez, görüntü fenotip veya IDC'lerde HSV-1 protein ekspresyonu kurulması. Elektroporasyon protokollerimiz farklı DNA veya RNA türlerini hastalık ve diğer birincil hücre türlerine ulaştırma fırsatı sunmaktadır. Daha sonra çeşitli moleküler, fonksiyonel ve enfeksiyon analizleri yapılabilir.
Hastalıkta ifade susturma için siRNA tabanlı strateji, aynı zamanda sonraki fonksiyonel tahliller ile birlikte, ilgi herhangi bir proteinin işlevini keşfetmek için yol açar.
