Bu protokol, deri mantarı, Malassezia ve in vivo memeli derisi ile etkileşimi incelemek için yeni bir fare modelinin kurulmasını açıklar. In vitro yaklaşımların aksine, Bu enfeksiyon modeli tam karmaşıklık ve doku ya da doku ya da tam bir şekilde Malassezia karşı doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık mekanizmalarının çalışma sağlar. Malassezia atopik dermatit gibi çeşitli cilt bozuklukları ile ilişkilidir.
Mantar bağışıklık yanıtı anlamak gibi sık ve kronik inflamatuar cilt hastalıkları nın tedavisinde yeni stratejiler sağlayabilir. Malassezia ile deneysel deri enfeksiyonu cilt kommensal mantarlar bağışıklık sistemini modüle ve böyle çeşitli cilt bozukluklarının ders ve şiddetini nasıl etkilediğini incelemek için uzun zamandır beklenen bir model sağlar. Bir Malassezia inoculum hazırlamak için bir mDixon agar plaka bir steril 100 mililitre Erlenmeyer şişesi için sıvı mDixon orta ve üç ila beş bireysel Malassezia kolonileri 10 mililitre ekleyin.
Daha sonra şişeyi 30 santigrat derecede ve dakikada 180 dönüşle 48 ila 96 saat boyunca yerleştirin. Kültür krem renkli ve bulanık olduğunda, steril bir iki mililitre mikrosantrifüj tüp içine kültürün iki mililitre aktarın ve santrifüj ile maya tortu. Peletin bir mililitrePBS'ini ikinci bir santrifüj için yeniden askıya alın ve ardından bir mililitre taze PBS'de güçlü pipetleme ile yeniden askıya alın.
Okuma0.1 ve bir arasında olduğundan emin olmak için Malassezia süspansiyon seyreltmek 20-50 kez PBS ve bir spektrometre üzerinde OD 600 ölçmek. Aliquot PBS bir OD karşılık gelir Malassezia süspansiyon hacmi 600 dört bir steril iki mililitre tüp içine hayvan başına enfekte olmak ve santrifüj ile maya tortu. Sonra yerli zeytinyağı 200 mikrolitre pelet resuspend.
Bir Malassezia enfeksiyonu başlatmak için, bir anestezi altı ila sekiz haftalık kadın C57 Black6 fare pedal refleks yanıt eksikliği onaylamak ve hayvanın gözlerine merhem uygulayın. Kulak başına ortalama kalınlığın hesaplanmasına izin vermek için her iki kulağın iki farklı alanının kalınlığını ölçmek için kaliper kullanın. Daha sonra her seferinde yeni bir bant parçasını kullanarak bandı kulak derisinden beş kez çıkarmadan önce bir kulağın derisine küçük bir bant uygulayın.
Sıyırma sonra, her kulağın dorsal tarafına Malassezia zeytinyağı süspansiyon 100 mikrolitre uygulamak için steril bir pipet kullanın ve steril 200 mikrolitre enjekte, metabolizma ve rehidrasyon desteklemek için nuchal foldorously içine% 2 glukoz çözeltisi subkutan. Daha sonra farenin hayvanı kafesine geri döndürmeden önce izleme ile 30 dakika boyunca bir ısıtma yastığıüzerinde toparlanmasına izin verin. Uygun deneysel zaman noktalarında, her fare kulağının iki farklı alanını ölçmek için bir kaliper kullanın ve kulak başına ortalama kalınlığın hesaplanmasına izin verin.
Enfekte ciltteki mantar yükünü ölçmek için, distile suya 500 mikrolitre steril %0.05 NP40 ve kulak başına bir mililitrelik mikrocentrifuge tüpe otoklavlanmış beş mililitre çapında çelik top ekleyin ve her tüpü dengede tartırın. Daha sonra, tabanında her hayvanın kulakları hasat ve NP40 bireysel tüpler içine dokuları yerleştirin. 25 Hertz'de kulak dokularını altı dakika homojenize etmeden önce her kulak örneğinin ağırlığını belirlemek için her tüpü dengede tartın.
Daha sonra her numunenin 100 mikrolitresini mDixon agar plakalarına dağıtın ve süspansiyonları baş aşağı kuluçkadan önce agar boyunca homojen bir şekilde 30 santigrat derecede dağıtın. Burada malassezia sympodialis'in sıvı mDixon ortamında ve mDixon agar'da büyümeye yönelik temsili görüntüler gösterilmiştir. Malassezia furfur uygulamasından sonra yabani tip C57 Black6 farelerinin tedirgin derisine göre bariyer bozulan cilde kulak kalınlığında artış görülebilir.
Nitekim, zaman içinde kulak kalınlığı ndaki artışın nicelikselleştirilmesi, kalınlıktaki değişimin araç tedavi edilen cilde göre önemli olduğunu ortaya koymaktadır. Ayrıca, Malassezia pachydermatis enfeksiyonu sonrası ikinci gün kulak derisinde mantar yükü algılama sınırının 100 ila 1000 kat üzerindedir. Malassezia agregalar oluşturmak eğilimindedir ve kolayca askıya değildir.
Bu nedenle, geniş girdap tarafından yağ mantar süspansiyon homojenizasyon sağlamak. Ek okumalar içerebilir, histoloji cilt patolojisi ve deriden bağışıklık hücrelerinin izolasyon ve antifungal bağışıklık yanıtı araştırmak için lenf düğümleri drenaj belirlemek için. Bu model Malassezia karşı bağışıklık yanıtı çalışma ve çeşitli cilt bozuklukları bağlamında bir kommensal olarak mantar rolünü araştırmak için fırsatlar açar.
Malassezia türleri bazı ülkelerde BSL-2 organizmaları olarak sınıflandırılır. Yerel yetkililerin yönetmeliğine uyun ve uygun güvenlik önlemlerini kullandığınızdan emin olun.
