Bu protokol insanda Crohn fibrozisinin karşılaştırılabilir patofizyolojisini sergiler ve aynı zamanda bağırsak fibrozisi üzerindeki rapamisin aracılı inhibitör etkilerini tartışır. Bu protokolün en büyük avantajı, bağırsak fibrozisgelişimini dört ila sekiz hafta arasında değişen çok kısa bir sürede tanımlamasıdır, bu da bize doku onarımı ve doku rejenerasyonu üzerinde çalışma fırsatı verir. Bu protokol fibrozis mekanizması almak için acele araştırmacılar için yararlı olacaktır, ve Crohn ilişkili bağırsak fibrozis için müdahale tahmin etmek için daha iyi bir teknoloji bulma yardımcı olur.
Bu prosedüre başlamak için, dermal maruziyet yoluyla TNBS'ye önceden duyarlı hale getirmek için yetişkin fareleri boyun bölgesinin etrafında tıraş edin. Sonra TNBS ile bir coton bezi ıslatın ve farenin boynunun tıraş lı alana uygulayın. Sekiz gün post-sensitizasyon, intrarektal yönetim tarafından haftada bir kez kolit neden, altı hafta boyunca.
Bunu yapmak için, bir mililitre şırınga çelik gavaj iğne bağlı bir mililitre şırınga ile 100 mikrolitre enema kullanarak% 25 etanol TNBS dört miligram uygulayın. Kontrol fareleri sadece% 25 etanol 100 mikrolitre verin. Fareleranestezi sonra, intraperitoneally ya rapamisin günde kilogram başına iki miligram enjekte, ya da bir araç, ya da her ikisi, her hafta içi üç ila altı hafta boyunca hem kontrol ve TNBS tedavi fareler.
Bundan sonra, ekstrasellüler tahlilleri analiz etmek için altı haftalık TNBS tedavi sonrası fare bağırsakları kullanın. İlk olarak, buz soğuk HBSS kolon uzunlamasına açın ve HBSS kolon yıkayın. Steril makas kullanarak, HBSS yaklaşık beş santimetre olan küçük parçalar halinde kolon kesti.
Küçük kolon doku parçalarını 10 mililitre lik sindirim öncesi tampon içeren 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Tüpü 100 RPM'de 37 derecede bir kuvözde 20 dakika sallayın. Daha sonra, 40 mikrometre hücresüz aracılığıyla süspansiyon geçmek ve bağlı kolon epitel atın.
Süzgeçten kalan doku toplamak ve 100 RPM sallayarak sırasında 37 santigrat derecede bir kuvözde 20 dakika için% 5 FBS ile 1X HBSS kollajenaz Tip IV ve DNASE1 içeren sindirim tampon onları daha fazla sindirmek. Bundan sonra, yaklaşık 20 saniye boyunca sindirilmiş dokular girdap ve lamina propria fraksiyonları elde etmek için 40 mikrometre hücresüz ile geçmek. Hücreleri aşağı pelet için 700 kez G ve dört derece santigrat lamina propria fraksiyonları santrifüj.
Ardından, hem %30 hem de %70 yoğunlukgradient ortam çözümlerinin 100 mililitresini yapın. Elde edilen hücreleri %30 çözeltinin 10 mililitresinde yeniden askıya alın ve bunu 15 mililitrelik bir tüpteki %70 çözeltinin beş mililitresinin üzerine yerleştirin. 1,000 kez G ve oda sıcaklığında bir mola serbest durumda degrade santrifüj.
Lamina propria lenfositler içeren beyaz halka faz toplamak, hangi arasında olacak 30%ve 70% gradyan katmanları. Elde edilen hücreleri buz gibi HBSS'de yeniden sulandırarak ve 500 kez G ve 10 santigrat derecede 10 dakika santrifüj ederek yıkayın. Ardından, FACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın.
Antikor boyama dan önce, ilk 15 dakika buz üzerinde 32FC bloker tarafından anti-fare CD16 ile kuluçka yada layarak lamina propria hücrelerinin hücre yüzeyini bloke. Sonraki anti-CX3CR1 PE antikorları ile birlikte anti-PE mikroboncuklar ile birlikte 30 dakika boyunca bağlı hücreleri yakalamak için hücreleri kuluçka, sonra FACS tampon ile hücreleri yıkayın. Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için antikor ve boncuk la bağlı hücreleri manyetik bir alandaki manyetik aktif hücre sıralama sütunundan geçirin.
Hücreleri FACS arabelleği ile üç kez yıkayın. Bundan sonra, sütunu manyetik alandan çıkarın ve boncuk la kaplı hücreleri vermek için sütundaki pistonu itin. İlk olarak, anti-fare CD16 ile lamina propria hücrelerini buz üzerinde 32FC bloker tarafından engelleyin.
Anti-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C ve MHC Sınıf II antikorları ile kuluçka yayan hücreleri süzün Sonra metin protokolünde belirtildiği gibi bir FACS akış sitometresi kullanarak hücreleri sıralayın. Toplam RNA hazırlığı için sıralanmış hücreleri lyse ve sitokin ve fibrotik belirteçleri tespit. Manyetik arıtmadan izole tek hücreli süspansiyonlardan fibrotik belirteçlerin ve inflamatuar sitokin analizinin mRNA ekspresyonunu analiz edin.
Hücre yüzeyi boyama ve analizine başlamak için, FACS tampon 15 mililitre 500, 000 ve 1 milyon izole lamina propria hücreleri arasında resuspend. Hücreleri anti-CD16 ile 32 antikor ile 1ila 50 arasında bir seyreltme ile 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka. Bundan sonra, bağlanmamış antikorları temizlemek için hücreleri 500 mikrolitre buz gibi facs tamponuile yıkayın.
Yüzey lekesi kolon tek hücreli süspansiyonlar floresan etiketli antikorlar ile 30 dakika boyunca buz üzerinde 1 ila 100 seyreltme. Her yıkama için 500 mikrolitre buz gibi FACS tamponu kullanarak bağlı olmayan antikorları çıkarmak için etiketli hücreleri iki kez yıkayın. Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi akış sitometre ile etiketli mononükleer hücreleri analiz edin.
Hücre içi sitokin boyama ve analizine başlamak için, yüzey lekeli hücreleri üreticinin talimatlarına göre sabitlemek ve permeabilize etmek için bir fiksasyon permeabilizasyon çözüm kiti kullanın. IL-1 beta sitokin hücre içi düzeyini tespit etmek için metin protokolünde belirtildiği gibi lamina propria hücreleri kapısı. Daha sonra, fazla fiksatif arabelleği kaldırmak için hücreleri 200 kez G ve dört santigrat derece beş dakika boyunca FACS arabelleği ve santrifüj ekleyerek yıkayın.
Bu yıkamayı bir kez tekrarlayın. Alfa düz kas aktin düzeyini belirlemek için, ilk fiksasyon permeabilizasyon çözüm kiti ile hücreleri permeabilize. Hücreleri anti-alfa SMA Alexa Fluor 488 antikorları ile 30 dakika boyunca buzüzerinde 1 ila 1000 arasında seyreltme ile kuluçkaya yatırın.
Sonra facs tampon ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın 200 kez G ve dört derece santigrat beş dakika aşırı fiksatif tampon kaldırmak için. Bu yıkamayı bir kez tekrarlayın. FACS çözümlemesi gerçekleştirin ve metin protokolünde belirtildiği gibi hücreleri geçit.
Bu çalışmada TNBS kolit fare modeli bağırsak fibrozisinin altta yatan mekanizmalarını incelemek ve açıklamak için benimsenmiştir. Altı haftalık Tüberküloz tedavisinden sonra, kontrol grubunda yaklaşık beş santimetreden TNBS grubunda yaklaşık üç santimetreye kadar kolon uzunluğunun TNBS tedavisi süresince kademeli olarak kısaldığı görülebilir. TNBS Crohn hastalığı modeli insan Crohn fibrozis modeli ile karşılaştırılabilir ve metodoloji ile ilgili bir artifakı olmadığından emin olmak için, fibrotik belirteçleri ayrıntılı bir zaman kursu çalışmada birden fazla düzeyde analiz edilir.
Alfa düz kas aktinin pozitif hücrelerinin birikimi ve submukozal tabakalarda kollajen birikimi fibrozis insidansının çoğunda bildirilmiştir ve fibrotik olaylar için bir işaret olarak kabul edilir Crohn ilişkili fibrozis ile TNBS fibrozis karşılaştırmak için, fibrozis belirteçleri ve sitokinlerin ekspresyonu aktif CD veya remisyon altında hastaların ileum taze doku biyopsisi analiz edilir. Dikkat çekici, belirgin indüksiyon aktif CD bölümlerinde alfa düz kas aktin pozitif tabakaların kalınlaşma ve artmış kollajen birikimi görülür. Aktif CD örneklerinde alfa düz kas aktin ekspresyonunun indüksiyonuna doğru batı leke analizi yapılır.
Ayrıca qPCR analizi ile fibrozis belirteçlerinin önemli indüksiyonu saptanır. Rapamisin etkileri, M4 aktivitesinin farmakolojik inhibitörü daha sonra TNBS fibrozis sınırlamak için bir mekanizma belirlemek için değerlendirilir. Fareler hem TNBS hem de rapamisin ile tedavi edilir ve kolon histolojisinde alfa düz kas aktin ve kollajen düzeyleri analiz edilir.
Her fareye aynı miktarda TNBS aşılamayı ve hücre kaybını önlemek ve hücre canlılığını korumak için izole lamina propria hücrelerini mümkün olan en kısa sürede işlemekoymayı unutmamak önemlidir. TNBS fibrozis ve fibrozis remisyon ve fibrozis oluşumunda rapamisin inhibitör faktörü ile ilgili protokol detaylarımız. Diğer araştırmacı fibrozis ve kolon kanseri için daha iyi bir ilaç hedefi bulmak için bu tekniği kullanarak ilginizi çekebilir.
TNBS'nin cildi tahriş eden bir cilt olduğunu ve cilt temasını önlemek için kullanım sırasında laboratuvar önlüklerinin takılması gerektiğini lütfen unutmayın.
