Detrusor düz kas hücreleri sonuçta idrar voiding ve depolama kolaylaştırır idrar mesane duvarı oluşturur. Protokolümüz tek düz kas hücrelerinin taze izolasyon için doğrulanmış ve güvenilir bir yöntem sağlar. Taze izole insan detrusor düz kas hücreleri tek hücre düzeyinde elektrofizyolojik ve moleküler incelemeler için bir fırsat sağlar.
Tek detrusor düz kas hücrelerini kontrol, normal ve hastalıklı insan idrar kesesi lerden inceleyerek, iyon kanalları gibi farmakolojik hedefleri doğrulama fırsatına sahibiz. Tek insan detrusor düz kas hücreleri yama-kelepçe elektrofizyolojisi gibi elektrofizyolojik deneyler için idealdir. Burada, nonselektif katyon kanalı olan geçici reseptör potansiyeli melastatin dört kanal olan TRPM4 adlı tek bir iyon kanalının incelenmesine bir örnek sunacağız.
Acemiler, taze izole DSM hücreleri elde etmek için kritik önemli adımları tanımak da dahil olmak üzere verimlilik ve aşinalık gerektiren diseksiyon ve enzimatik tedavi adımları ile mücadele edebilir. Bu insan mesane histolojisi aşina olmak önemlidir, tek hücreleri izole etmek için protokol adımları esnek kalır, ve başlangıçta bu protokolü kullanarak suboptimal hücreleri almak için bekliyoruz. Tüm kalınlıkidrar kesesi numunesi inceleyerek başlayın.
Numuneyi, mukozayı yukarı bakacak şekilde sabitleyip, buz gibi soğuk DS ile doldurulmuş silikon enantiomer kaplı 150 mm yuvarlak tabağa sabitleyip keskin bir diseksiyon la tüm mukozayı dikkatlice çıkarın. Birkaç mukozasız detrusor düz kas veya DSM parçaları kesip. Papain ve dithiothreitol veya DS-P içeren önceden ısıtılmış DS bir ila iki mililitre ile bir tüp içine üç ila altı DSM adet yerleştirin.
37 derecede 30-45 dakika kuluçkaya yatarak tüpü 10-15 dakikada bir sallayın. Kuluçkadan sonra DS-P'yi tüpten çıkarın ve DSM parçalarını kısa bir süre buz gibi DS ile yıkayın. DSM parçalarıyla DSM'yi yeni bir tüpe aktarın ve DSM parçalarını tüpün alt kısmında bırakarak DSM'yi çıkarın. Tüpe kollajenaz tip II veya DS-C içeren bir ila iki mililitre DS ekleyin.
Ve 37 derecede, ara sıra sallayarak kuluçkaya yat. DS-C'yi atın ve enzimle tedavi edilen DSM parçalarını buz gibi ds ile 5-10 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra DS'yi tüpün içine bırakın ve tek DSM hücrelerini serbest bırakmak için parçaları ateşte cilalı Pasteur pipetiyle hafifçe triturate edin. Pipet 0.25 ila bir mililitre hücre süspansiyonu ters bir mikroskop un sahne üzerinde oturan cam bir alt hazneüzerine ve hücrelerin yapışmasını sağlamak için en az 45 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, banyodan DS'yi çıkarın ve süper füzyon yoluyla E çözeltisi ile değiştirin. Birden fazla yama elektrotları çekin, elektrot ipuçlarını ateş cilalayın ve gerekirse diş balmumu ipuçlarını katlayın. Çözeltideki elektrotun üzerine kısa bir süre daldırarak, bir yama elektrotucunu amphotericin-B olmadan pipet çözeltisi ile doldurun.
Yama kıskaç elektrofizyolojisinin başarısı DSM hücre kalitesine ve amphotericin-B solubilizasyonuna bağlıdır. Elektrot, amfisericin-B içeren aynı pipet çözeltisi ile doldurun ve elektrotun bir yama kelepçesi amplifikatör baş aşamasına bağlı bir tutucuüzerine monte edin. Elektrotun uç kısmı sadece batırılmış böylece ekstrasellüler çözelti yüzeyinin hemen altına elektrot yerleştirmek için bir mikromanipülatör kullanın.
Daha sonra, ticari satın alma yazılımının membran test penceresi işlevini kullanarak elektrot direncini belirleyin ve elektrotun ilgi hücresine doğru ilerletin. Elektrot ile hücre yüzeyine dokunduğumda, boru ile elektrota hafif hızlı negatif basınç uygulayarak giga-seal oluşturur. Bu, elektrotun ucundaki negatif basınçla sonuçlanır ve membran testi ile doğrulanan başarılı bir giga-seal elde eve gelir.
Amphotericin-B'nin pipetten aşağı yayılması ve plazma zarına sokulması için 30 ila 60 dakika bekleyin, öncelikle monovalent katyonlar için seçici gözenekleri oluşturan. Membran test fonksiyonu ile giga-contasını izlemeye devam edin. Yama perforasyonu en uygun olduğunda, amplifikatördeki hücre kapasitansve seri direnci için kadranları ayarlayarak kapasitans geçicilerini iptal edin.
Kararlı voltaj-adım katyon akımları gözlendikten sonra, el yazmasında açıklandığı gibi yönlendirme gerilim-adım protokolü ile akımları kaydedin. Bir bileşik veya fizyolojik test koşulu superfusion tarafından test etmek ve kontrol ve test koşulları yanı sıra yıkama için yanıtları kaydedin uygulayın. Bu protokol fonksiyonel ve moleküler çalışmalar için sağlıklı, taze DSM hücrelerini izole etmek için kullanılabilir.
Sağlıklı tek DSM hücreleri mil şekilli morfolojisi, keskin iyi tanımlanmış kenarlar, hücre etrafında iyi tanımlanmış bir hale ve mikroskop altında bakıldığında yarı kontraktil görünüm ile karakterizedir. Ayrıca, taze izole DSM hücreleri mekanik stimülasyon ve karbachol yanıt. Sonraki yama-kıskaç deneylerinde hücre parçaları ve canlı olmayan veya aşırı sindirilmiş hücrelerden kaçınılmalıdır.
İzole hücreler amhotericin-B delikli yama-kıskaç deneylerinde tüm hücre akımlarının üç farklı insan DSM hücresinde gerilim adımı veya rampa protokolü ile ölçüldüğü deneylerde kullanılmıştır. Deneyler 9-phenanthrol, bir TRPM4 kanal inhibitörü, etkili ve geri insan DSM katyon akımları inhibe ortaya koymuştur. 9-fenanthrol duyarlı akım bileşeni pozitif voltaj ve dışa doğru düzeltme güçlü bir inhibisyon göstermektedir.
Enzimomatik tedavi adımları, adımlar 2.2 ve 2.3, sıcaklık, enzim tedavileri süresi, enzim lot kaynakları ve DSM hücrelerinin kalitesi de dahil olmak üzere, yüksek kaliteli insan DSM hücreleri elde etmek için önemli belirleyicileri vardır. İnsan DSM hücreleri de ideal kalsiyum ve siklik AMP de dahil olmak üzere hücre içi ikinci haberci düzeylerini değerlendirmek için uygundur, immünositokimya ile protein ifadeleri tespit, ve ko-ifade in situ proksimal dava tsay, ve RT-PCR tarafından mRNA ifade, qRT-PCR, mikrodiziler, ve yeni nesil sıralama. İnsan DSM hücreleri idrar kesesi BK, kalsiyum, TRPM4 kanallarının rollerini anlayışımızı ilerlettir.
Gelecekteki gelişmeler özellikle elektrofizyolojik veya farmakolojik özellikleri transkripsiyon veya proteom profilleri ile bağlantı sağlayacaktır.
