Perivasküler yağ dokusu kan damarlarını çevreler ve kardiyovasküler fizyolojiyi düzenler. Bu protokol, vasküler mikroortamda insan yağlayıcı atalarının işlevi ile ilgili anahtar soruları cevaplamak için kullanılır. Yağ ata hücreleri anatomik konumlarına göre değişir.
Multipotent atapopülasyonunun kardiyovasküler hastalığı olan hastalardan perivasküler yağ dokusundan başarıyla elde edilebilmektedir. Prosedürü gösteren Spencer Scott, benim laboratuvarımdan bir tıp öğrencisi olacak. Metin protokolünde açıklandığı gibi ameliyathaneden 500 miligramlık bir Insan Perivasküler Yağ Dokusu veya PVAT parçası alın.
Taze insan PVAT'ını DMEM'den 25 mililitre antibiyotik solüsyonu içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. 4 santigrat derecede 20 dakika sallayarak kuluçka. PVAT antibiyotik çözeltisi iken, 37 santigrat derece de dissociation tampon bir aliquot çözülme.
Beş mililitre dissosyasyon tamponuna 50 mikrolitre 100x antibiyotik/antimikotik solüsyon ekleyin ve 0,22 mikron şırınga filtresi kullanarak sterilize edin. 24 kuyulu bir plakanın bir kuyuya bir mililitre jelatin çözeltisi ekleyin. Bir laminar akış kaputunda, pvat'ı antibiyotik çözeltisinden steril petri kabına aktarmak için steril forseps ler ve makaslar kullanın.
Dokuya önceden ısıtılmış dissociation tampon bir mililitre ekleyin. Steril forceps ve diseksiyonu makasları kullanarak tüm dokuyu bir bulamaç içine ince ince doğrama. Bir mililitrelik bulamacı dört mililitre lik dissosilasyon tamponuna aktarın.
Bir saat boyunca 200 rpm önceden ısıtılmış 37 santigrat derece orbital shaker kendi tarafında tüp kuluçka. Bir saat sonra görünür doku parçaları bulunmamalı ve çözelti bulutlu bir hücre süspansiyonu olarak görünmelidir. 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine ayarlanmış 70 mikron hücreli süzgeçten çözeltiyi filtreleyin.
Mümkün olduğunca çok hücre yakalamak için ek bir 10 mililitre antibiyotik çözeltisi ile süzgeç durulayın. Süzgeci sıkmayın. Şimdi bir sallanan kova santrifüj içinde 300 kez g 12 dakika boyunca hücreleri pelet.
Santrifüjden sonra tüp, adipositlerin yağlı bir üst tabakası, bir interfaz ve bir pelet olarak ayrılacaktır. Pelet endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, kan hücreleri ve ata hücreleri içeren stromal vasküler fraksiyonudur. Peleti 10 mililitre HBSS ve santrifüjde 300 kez 5 dakika süreyle yeniden askıya alın.
HBSS'de toplam iki yıkama için bu adımı tekrarlayın. Şimdi jelatini 24 kuyulu bir tabaktan aspire edin. Bağlanmamış jelatini çıkarmak için kuyuyu HBSS ile bir kez hafifçe yıkayın.
Büyüme orta bir mililitre bozulmamış kırmızı kan hücreleri ile stromal vasküler fraksiyonpelet resuspend ve jelatin kaplı iyi üzerine tohum. Sonra kültür orta mililitre başına 25 nanogram son konsantrasyona insan FGF2 ekleyin. %5 CO2 ile 37 santigrat derecede 24 saat kuluçka.
Hücreleri 24 saat büyüttükten sonra, büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri HBSS ile beş kez yıkayın. Bu yıkama adımı kırmızı kan hücreleri ve ölü hücreleri kaldırır. Sonra her iyi için mililitre FGF2 başına 25 nanogram ile desteklenen taze büyüme medya bir mililitre ekleyin.
Her 48 saatte bir, her seferinde mililitre taze FGF2 başına 25 nanogram ile takviye emin olmak için medya değiştirin. Geçiş hücreleri %100'e ulaştıktan sonra ekstrandan 7 ila 10 gün sonra biraraya ulaşırlar. Bunu yapmak için, büyüme ortamı aspire ve bir mililitre HBSS ile iki kez monolayer yıkayın.
Kuyulardan tüm HBSS aspire ve hücre bölünmesi çözeltisi birkaç damla ekleyin. Dokunun ve plaka birkaç kez girdap ve hücreleri kaldırmak için 5% CO2 ile 37 santigrat derecede kuluçka. Sonra müstakil hücrelere taze kültür orta yaklaşık bir mililitre ekleyin.
Müstakil hücrelerin 500 mikrolitresini, her biri 500 mikrolitre büyüme ortamı ve 25 nanogram FGF2 içeren 24 kuyuluk iki kuyuya dağıtın. Ayrıca, kültür insan kemik iliği Mezenkimal Kök Hücreler veya MSC kolonileri olarak metin protokolünde açıklandığı gibi. 12 kuyuluk bir plakanın kuyubaşına uygun sayıda kemik iliği ve PVAT'tan türetilmiş hücre plakası koyun.
Adipojenik ve osteojenik durumlar için, plaka yaklaşık 200, 000 için 225, iyi başına 000 hücreleri. Kondrojenik koşullar için ise, plaka 150, 000-175, 000 iyi başına hücreler. Daha sonra hücreleri hem insan PVAT progenitor hücre popülasyonundan hem de insan kemik iliği MSC popülasyonundan hücre ayırma solüsyonu ekleyerek ayırın.
Ayırma çözeltisindeki hücreleri 37 santigrat derece ve %5 CO2'de beş dakika kuluçkaya yatırın. Popülasyonları ayrı 15 mililitrelik konik şişelere çekin. Hücreleri peletlemek için şişeleri 500 kez g'de yedi dakika boyunca aşağı çevirin.
Sonra PBS bir mililitre hücreleri resuspend ve hücre numarasını tahmin etmek için bir hemositometre kullanın. Hücreleri daha önce olduğu gibi 12-iyi tabaklarda tabaklayın. İndüklenen ve indüklenen olmayan adipojenik ve osteojenik durumlar için ayrı yemekler sağlayın.
Ve indüklenen durumun her kuyuya 1.5 mililitre adipojenik ve osteojenik iletim ortamı ekleyin. Daha sonra indüklenen olmayan durumun her kuyuya 1,5 mililitre adipojenik ve osteojenik non-indüksiyon ortamı ekleyin. Adipojenik ve osteojenik indüklenen ve indüklenen hücre popülasyonlarının kuluçkaya 37 santigrat derece ve %5 CO2'de başlamasına başlanması.
İnsan PVAT progenitor hücrelerinin ve insan kemik iliği MSC'lerinin kalan hacmini 500 kez g'de yedi dakika boyunca aşağı doğru çevirin. 10 mikrolitrede 100,000 hücre yoğunluğu elde etmek için kalan kemik iliği ve PVAT kaynaklı hücre peletlerini yeniden askıya almak için gereken hacmi belirleyin. Daha sonra kondrojenik soy indüksiyonu için MSC büyüme ortamının hesaplanan hacmindeki peletleri yeniden askıya alın.
Homojen bir dağılım sağlamak için pipet kullanarak hücrelerin hacmini yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin. Şimdi pipet 100, 000 hücreden oluşan bir mikro kütle oluşturmak için her kuyunun merkezine konsantre hücre çözeltisinin 10 mikrolitrelik damlacık. Buharlaşmayı önlemek için bitişik kuyuya bir mililitre steril su yerleştirin.
Mikro kütlenin biraraya gelip toplamasına izin vermek için mikro kütle kültürlerini 37 santigrat derece ve %5 CO2'de iki saat kuluçkaya yatırın. İki saat sonra, dikkatle indüklenen durum kuyularının her birine mililitre insan TGF-beta-bir başına 10 nanogram ile çivili kondrojenik farklılaşma ortamı ekleyin. Şimdi dikkatle indüklenen olmayan durum kuyuları için indüksiyon olmayan medya 1,5 mililitre ekleyin.
Metin protokolünde açıklandığı gibi numuneyi susuz leştirmek, gömmek ve lekelemek için indüklenen kondrojenik durumdaki mikro kütleyi bir kasete kazıyın veya dökün. Adipojenik farklılaşma çalışmaları insan kemik iliği kaynaklı MSC ve PVAT kaynaklı progenitor hücrelere paralel olarak yapılmıştır. Non-indüklenen durumda, hiçbir lipid birikimi belirgindir.
Bu, nötr lipidlerin Yağ Kırmızı O.'su ile boyanmasının ardından gösterilen indüklenen durumun aksine, insan aortPvat türetilmiş hücrelerdeki farklılaşma derecesi daha sağlam iken, her iki insan hücre kaynağı da adipojenik soy için ayırt etme yeteneğini sergilemiştir. Osteojenik farklılaşma protokolü insan kemik iliği kaynaklı MSC'ler ve PVAT kaynaklı hücreler için kullanılmıştır. Indüklenen olmayan hücreler Alizarin Kırmızı ile leke vermedi.
Osteojenik farklılaşma protokolünden sonra, insan MSC'leri Alizarin Kırmızısı ile boyanmış kalsifiye nodüller geliştirirken, insan aort PVAT hücreleri gelişmemiştir. Hem insan kemik iliği MSC'lerinden hem de insan PVAT'ından elde edilen hücreler, mikro kütlede bol kollajen birikimi ile kondrojenik farklılaşmanın karakteristik özellikleridir. Mikro kütle insan kemik iliği MSCs oluşur ve aort PVAT türetilmiş hücreler de Alcian Mavi boyama ile belirtildiği gibi glikozaminoglikanların bol birikimi gösterdi.
Morfolojik olarak, lakunabenzer yapılar kollajen birikimi ile çevrili boşluklarda oturan hücrelerle tespit edildi. Enzimatik ayrışma öncesinde perivasküler yağ dokusunu ince doğramak ve her soy farklılaşması tahsini için uygun hücre yoğunluklarının kaplanması için önemlidir. Bu prosedürü takiben, perifvasküler yağ ve kemik iliği kaynaklarından farklılaştırılmış ataların soya özgü belirteçlerini karakterize etmek için batı leke ve akış sitometrisi ile birlikte kantitatif PCR kullanılmalıdır.
Bu teknikle, obezite sırasında perivasküler yağ dokusu genişlemesi ve disfonksiyonu düzenleyen mekanizmaları ve progenitor hücrelerinin vasküler fonksiyon ve kardiyovasküler hastalık üzerindeki etkilerini anlamaya başlayabiliriz.
