Yeni mikroskopi teknikleri, incelenen biyolojik süreçlerin doğru kavrayışı için yeterli araçların geliştirilmesini gerektirir. Bu protokol, tek moleküllü izleme için gerekli olan görüntü işleme adımlarını açıklar, buna yanal difüzyon parametrelerinin tahmini ve hücre zarındaki tüm yörüngesi üzerinde nokta boyutunun ölçülmesi de dahildir. Bu protokol, ImageJ, MATLAB ve uTrack gibi çeşitli yazılım parçalarının yanı sıra bu protokol için özel olarak geliştirilmiş bazı proteinlerin kullanımını birleştirir.
Bu yöntem, ışık mikroskobu altında membran reseptörlerinin takibi ile gösterilmiştir, ancak yörüngeleri zaman içinde bir video dizisinde izlenebilen parçacık benzeri herhangi bir yapıya uygulanabilir. Bu teknik temel araştırmalarla ilgilidir ve klinik ortamda doğrudan bir uygulaması yoktur. Ancak, hem farklı hastalıklarda biyolojik olayların karakterizasyonuna hem de yeni tedavi hedeflerinin belirlenmesinde yardımcı olmak için kullanılabilir.
Bu protokol, bu videoda gösterildiği gibi, hücresel membranlarda parçacıkların izlenmesi için ilgilidir, ama aynı zamanda tam hücre, bakteri, bir sıvı nano tanecikleri, ya da merkezi iyi tespit edilebilir başka bir nesnenin izlenmesi için uygulanabilir. Bu protokol kullanıcı dostudur ve sadece hücre kültürü ve mikroskopi teknikleri hakkında bilgi gerektirir. Bu protokolde kullanılan farklı teknikler ve bilişim araçları yeni bir kullanıcının gözünü korkutabilir.
Görsel gösteri bir güven ile bu tekniği kullanmak için yardımcı olur. Başlamak için, Jurkat hücreleri büyümek, monomerik GFP etiketli kemokin reseptör vektörü ile transfect, ve etiketli vektör düşük ifade düzeyleri ile hücreleri seçin, eşlik eden metin protokolü açıklandığı gibi. Fibronektin ile kaplanmış her fibronektin kaplı 35 milimetrelik cam alt mikrowell yemeklerine CXCL12 ligand veya kontrol ortamı içeren ortam ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın.
Ardından, her çanağa sıralanmış hücreler ekleyin ve hücreleri görüntülemeden önce 20 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücrelerin ilk çanak bir TIRF mikroskop aşamasına aktarın ve 100x yağ daldırma hedefiaçın. Fotobeyaztma etkilerini en aza indirmek için parlak alan kullanarak hücreleri bulun ve odaklanın.
Ardından TIRF moduna geçin ve düşük lazer yoğunluğu kullanarak hassas odaklama ayarı yapın. Kareler arasındaki zaman aralığını en aza indirerek yaklaşık 50 saniye uzunluğunda filmler edinin. Her deneysel durum video dosyası için, bu videonun metin protokolünde açıklanan dosya yapısı yönergelerini izleyen yeni bir klasör oluşturun.
Dosyayı Fiji menü çubuğuna sürükleyip bırakarak videoyu Fiji veya ImageJ ile açın ve LIF dosyasını biyobiçimler kullanarak almak için Tamam'a tıklayın. Bir maske tasarlamak için, ilgili çok kanallı görüntüyü de içe aktarın. Ardından, önce maskenin tasarımı için yararlı kanallarla tek bir görüntü oluşturarak bir maske oluşturun.
Çubuk menüsünde Resim'i seçin ve farklı kanalları ayrı görüntüler olarak göstermek için Renkleri ve ardından Split Kanalları'nı tıklatın. Çubuk menüsünde Görüntü'yü seçerek, Renk'e giderek ve Kanalları Birleştir'i seçerek üç kanalı tek bir görüntüde yeniden birleştirin. Uygun kanalları seçtiğinizden ve daha sonra yeni bir istiflenmeyen görüntü oluşturmak için Tamam tuşuna bastığından emin olun.
Çubuk menüsüne giderek, Çözümle'yi seçerek ve ardından Araçlar'a giderek ve Windows Eşitle'yi seçerek iki pencereyi eşitleyin. Senkronize görüntü olasılıkları içeren yeni bir pencere gösterilir. Şimdi, iki pencere senkronize ile, her iki pencerede aynı bölge kırpılmış olabilir.
Çubuk menüsündeki Resim'e gidin ve Kırpma'yı seçin. Dikdörtgen seçim aracı ile ilgi bölgesini çizin. Kırpılan iki görüntü tek tek gösterecektir.
Ardından, her iki pencereyi de eşitlemeden çıkarın. Maske oluşturulmadıysa, seçim aracı ve kırpma ile ilgi bölgesini çizin. Bundan sonra, video klibi videosek dizininde görüntü dizisi olarak kaydedin.
Ardından çok kanallı görüntüyü seçin, menüdeki Eklentiler'e gidin ve segmentasyon düzenleyicisi eklentisini açmak için Segmentasyon Düzenleyicisi'ni seçin. Serbest seçim aracını seçin ve yeşil bir etiket seçmek ve en dıştaki maskeyi tasarlamak için kullanın. Tasarlandıktan sonra, bileşik pencerenin seçim seçeneğinde Plus düğmesine basın ve seçili maske görüntüleyicide görüntülenir.
Tüm etiketler için bu adımı yineleyin. Tüm maskeler tasarlandıktan sonra maskeyi videoyla aynı dosya adı ile kaydedin ve adı:mask.tif. MATLAB'ı açın ve Yol Ayarla'ya giderek ve Ekle'yi seçerek uTrack dizinini yola ekleyin.
Ardından, çözümlenecek diziyi içeren Çalışma Dizini'ni diziolarak değiştirin. Konsolda Movie Selector GUI yazıp Enter tuşuna basarak uTrack'i çağırın. Bu, film seçim penceresinin açılmasına neden olur.
Yeni Film düğmesine basın ve Film Ekleme penceresinin görünmesini bekleyin. Videoyla birlikte dizini seçmek ve film bilgileri parametrelerini doldurmak için Kanal Ekle'ye basın. uTrack to Results sonuçları için çıktı dizini ayarlayın, ardından Gelişmiş Kanal Ayarları'na basın, satın almayla ilgili parametreleri doldurun ve kaydedin.
Filmi oluşturduktan sonra film seçimi penceresinde Devam et'e basın. Burada, uTrack analiz edilecek nesnenin türü hakkında soru soracaktır. Tek Parçacıklar'ı seçin ve ardından denetim masası penceresi görüntülenir.
Ardından, ilk adım olan Adım 1:Algılama'yı seçin ve Ayar'ı tıklatın. Ayar Gaussian Karışım Modeli Montaj penceresi görüntülenir. Burada gösterildiği gibi ayarları girin ve sonra Uygula tuşuna basın.
Denetim panelinde, algılama adımını çalıştırmak için Çalıştır'ı tıklatın. Birkaç dakika sonra Sonuç düğmesine basarak sonuçları kontrol edin. Film, algılanan parçacıklar üzerinde kırmızı daireler gösterir.
Kırmızı daire gösterilmezse, bu adım doğru çalışmamıştır ve yeniden denemelisiniz. Şimdi, az önce burada gösterildiği gibi parametreleri ayarlayarak birden fazla kareyi kapsayan parçalarhalinde tespit edilen parçacıkları birleştirin. Ardından kontrol panelinde Çalıştır'a basın.
Ardından, Parça Analizi'ni gerçekleştirin. Burada gösterildiği gibi ayarları tanımlayın ve uygula ve çalıştır'a basın. Sonuçları önce Sonuç düğmesine basarak doğrulayın, ardından film seçenekleri penceresinin Parça Numarasını Göster'e tıklayın ve her parçanın doğru şekilde tanımlandığını kare kare kontrol edin, gerçek parçacıklar olmayan parçacıkları el ile işaretleyin.
MATLAB'da, burada gösterildiği gibi komutu girin. Bu komut, programın tüm yörüngeleri okumasına ve difüzyon katsayılarını hesaplamasına neden olur. Ardından, dışlayabilmek için noktalar listesini vererek yanlış tanımlanmış noktalara veya yörüngelere karşılık gelen yörüngeleri hariç tut.
Bu hücrenin her bir parçası için anlık difüzyon katsayılarını, eşlik eden metin protokolünü takip ederek hesaplayın. Bu durumda, diffüzyon katsayısını bir zaman gecikmesi için hesaplayın 4 ile 4 arasında d1 olarak adlandırılır. Bittiğinde, kısa ve uzun yörüngeler halinde yörüngeleri ayrıştırın.
Uzun yörüngeleri analiz etmek için, hareket türünü moment ölçekleme spektrumu boyunca sınıflandırmak için burada gösterildiği komutu yazın. Her parçacığın yörüngeleri boyunca yoğunluğunu analiz edin. Bu temel davranışı, eşlik eden metin iletişim kuralını takip ederek çok farklı şekillerde yapılandırın.
Sonra, tüm yörüngeler için difüzyon ve yoğunluk bilgilerini toplamak. Kısa yörüngeler için yalnızca difüzyon ve yoğunluk bilgilerini toplayın. Son olarak, daha önce kullanılan sonek uzun olan aşağıdakileri yazarak moment spektrumu ölçeklemesini ve yoğunluk bilgilerini toplayın.
Bu protokolde tanımlanan tekniklerin kullanılması, floresan mikroskopi filmlerinde tespit edilen parçacıkların otomatik olarak izlenmesine ve dinamik özelliklerinin analizine olanak sağlar. Bu analizden, uyaranların varyasyonlarına göre farklı özellikler elde edilebilir. Buna, dört farklı uyaranlara dayalı hareketsiz noktaların yüzdesi, 50'den büyük kareler uzun yörüngelerin yüzdesi ve yönlendirilmiş, özgür veya sınırlı hareketler tarafından parçalanmış olarak yörüngeler boyunca hareket türleri içerir.
Buna ek olarak, difüzyon katsayısı, ortalama nokta yoğunlukları ve parçacık başına reseptör sayısı belirlenebilir. Bu, farklı uyaranlara yanıt olarak her nokta için kısa difüzyon katsayısı değerlerinin dağılımını gösterir. Kırmızı çizgi ortanca değeri temsil eder, bu benzer grafik aynı uyaranlara yanıt olarak ilk 20 kare boyunca her nokta için ortalama nokta yoğunlukları gösterir.
Yine, kırmızı çizgi ortalama yoğunluk değerini temsil eder. Bir noktanın ortalama düzeltilmiş yoğunluğu bu noktada bulunan floresan protein sayısı ile ilişkili olduğundan, burada gösterildiği gibi, parçacık başına reseptör sayısını doğrudan hesaplayabilirsiniz. MATLAB büyük/küçük harf duyarlı bir programlama dilidir.
Değişken adlarını bu protokolde açıklananlara göre değiştirebilirsiniz, ancak adlandırmanızda tutarlı olduğundan emin olun. Işlevlerin adları değiştirilemez ve doğru bir sözdizimi için virgüller, üst üste ve yarı iki nokta üst üste ler önemlidir. Tek moleküllü mikroskopi, tek tek membran proteinlerinin benzeri görülmemiş spatio-temporal çözünürlüğe sahip görselleştirilmesine olanak sağlar ve hücre biyolojisinin beklenmeyen yönlerini ortaya çıkarmak için eşsiz fırsatlar sunar.
Bu protokoller hücrelerde ve moleküler biyolojide mikroskopi videolarının kantitatif analizi için yeni kapılar açılmaktadır.
