Bitkilerde rekombinant protein üretimi için farklı stratejiler arasında, deconstructed bitki tabanlı VERS ifadesi üstün performans sağlar, göreceli bir kısa zaman dilimi içinde yüksek verim yol. Bir oral aşı üretimi için bu teknolojinin çoğaltılması yakın gelecekte konvansiyonel aşılar için bir alternatif olmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Lyophilized kırmızı pancar geçici olarak dönüştürülmüş yaprakları tip bir diyabet önleme oral tolerans indüksiyon için uygun fotoğraf antijenleri bir miktar birikir.
Bu deneysel protokol, rekombinant protein birikiminin tek tek değerlendirilmesine göre birçok farklı yenilebilir türe genişletilebilir. Prosedürü gösteren Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo ve Roberta Zampieri olacaktır. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi bir büyüme odasında kırmızı pancar ve ıspanak bitkileri büyümek.
Tohum çimlenme sonra, litre başına bir gram konsantrasyonda ticari olarak kullanılabilir gübre bir çözüm ile haftada iki kez bitkileri döllemek. Tarımsal filtrasyon için, beş haftalık ıspanak ve altı haftalık kırmızı pancar bitkileri kullanın. Bitki ekspresyonu vektörlerini yaptıktan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi mililitre başına 50 mikrogram ve vektöre özgü antibiyotikler içeren 50 mililitre LB ortamına ait üç A.tumefaciens transformantını aşılamak.
28 santigrat derece bir gecede sallayarak büyüyün. Ertesi gün, 20 dakika boyunca 4500 kez G santrifüj ederek bakteri kültürleri pelet. 10 milimolar MES ve 10 milimolar magnezyum sülfat içeren 100 mililitre infiltrasyon tamponunda peleti yeniden askıya alın.
Süspansiyonları oda sıcaklığında üç saat kuluçkaya yatırın. Burada gösterilen modüllerden birini içeren bakteriyel süspansiyonun eşit hacmini beş asal modül ve integrase modülüile karıştırın. İğnesiz bir şırınga kullanarak, süspansiyon karışımı beş mililitre çıkarmak.
Şırınganın ucunu bitki yaprağının alt tarafına bastırırken yaprağın diğer tarafına hafifçe karşı basınç uygulayın. Her bitki için, tepe başlayarak, ilk üç tamamen genişletilmiş yaprakları, sızın. Tarıma sızmış yaprakları yaprak sapındaki kağıt etiketiyle etiketleyin.
Daha sonra standart koşullar altında büyüme odasına bitkiler dönün. Enfeksiyon sonrası 4 ila 14 gün içinde, tarıma sızmış yaprakları toplayın ve sıvı nitrojenle dondurun. Bu bitki dokusunu eksi 80 derecede saklayın.
İlk olarak, ayrı ayrı mililitre başına 50 mikrolitre konsantrasyonda rifampisin içeren LB orta 50 mililitre üç A.tumefaciens transformantlar büyümek, ve uygun vektöre özgü antibiyotikler 28 santigrat derece gecede sallayarak. Ertesi gün, 20 dakika boyunca 4500 kez G santrifüj ederek bakteri kültürleri pelet. Peletin 1 litrelik infiltrasyon tamponundan 0,35'lik bir OD600'e geri uzaklaştırın ve süspansiyonları oda sıcaklığında üç saat kuluçkaya yatırın.
Daha sonra her süspansiyona deterjanın %0,01'ini ekleyin. Burada gösterilen modüllerden birini içeren bakteriyel süspansiyonun eşit hacmini beş asal modül ve integrase modülüile karıştırın. Tutucuiçine bir altı haftalık kırmızı pancar bitkisi yerleştirin.
Tutucuyu ters çevirin ve sızma süspansiyon yaprakları batırmak için bir sızma banyosu iki litre içeren bir kabın üstüne yerleştirin. Bundan sonra, batık bitki ile infiltrasyon banyo susızma odasına aktarın ve kapatın. Vakum pompasını açın ve sızma odasındaki vakum alım valfini açın.
Odadaki basınç 90 milibara düştükten sonra vakumu üç dakika koruyun. Sonra vakum 45 saniye bırakın. Oda atmosfer basıncına geri döndüğünde, odayı açın ve sızan bitkiyi bakteri banyosundan çıkarın.
Bitkiyi büyüme odasına geri getirin. Maksimum ifade gününde, sızmış yaprakları hasat ve daha önce açıklandığı gibi sıvı nitrojen onları dondurmak. İlk olarak, vakum agroinfiltrated delta hasat 87 GAD65mut ifade zirvesinde kırmızı pancar yaprakları ifade, ve sıvı azot onları dondurmak.
Donmuş yaprakları eksi 50 santigrat derecede ve 0.04 milibar'da 72 saat boyunca lyophilize edin. Sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın. Devam etmeye hazır olduğunda, ince bir toz yaprakları eziyet ve nem hariç silika jel ile kapalı bir kapta oda sıcaklığında saklamak.
Mide sindirim simülasyonu için, ince zemin dondurma kurutulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 miligram tartmak ve PBS altı mililitre resuspend. Örnek pH'ı ikiye ayarlamak için altı azı kaşığı hidroklorik asit kullanın. Domuz mide mukozasından mililitre pepsin başına dört miligram ekleyin, ve 10 milimolar hidroklorik asit, mililitre başına bir miligram son pepsin konsantrasyonu elde etmek için.
Örneği 37 derecede 120 dakika sallayın. Daha sonra, numune pH'ını sekize ayarlamak ve pepsin'i inaktive etmek için sodyum hidroksit kullanın. Her numunenin 750 mikrolitre aliquot'ünü mikrosantrifüj tüplere aktarın ve 20, 000 kez G ve 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca aliquotları santrifüj edin.
Her supernatant'ı ayrı ayrı toplayın ve her peleti bir süpernatant yükleme arabelleği hacminde yeniden askıya alın. Daha sonra batı leke analizi ile hem supernatant hem de resuspended pelet analiz edin. Hücre bütünlüğü analizi için, ince zemin dondurulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 miligram iki örnek hazırlamak ve PBS altı mililitre hem de resuspend.
Bir numunenin pH'ını ikiye ayarlamak için altı azı kaşığı hidroklorik asit kullanın. Her iki numuneyi de 37 derecede 120 dakika sallayın. Sonra microcentrifuge tüpler için her örnek 750 mikrolitre aliquot.
20, 000 kez G ve 20 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj. Her supernatant'ı ayrı ayrı toplayın ve her peleti bir süpernatant yükleme arabelleği hacminde yeniden askıya alın. Daha sonra batı leke analizi ile hem supernatant hem de resuspended pelet analiz edin.
İlk olarak, ince zemin dondurulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 miligram tartın ve steril PBS sekiz mililitre yeniden askıya. Bir dakikalığına girdap. Hazırlanan beş seçici LB medyadan birinde, dondurulmuş kurutulmuş yaprağın bir mililitresini homojen olarak yerleştirin.
Plakaları 28 derecede üç gün kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, her plaka üzerinde yetiştirilen agrobacterium kolonileri saymak ve dondurulmuş kurutulmuş yaprak homojen mililitre başına koloni oluşturan birimlerin sayısı olarak artık bakteri yükü hesaplamak. Bu çalışmada yenilebilir bitki dokusunda oral aşı geliştirilmiştir.
Kırmızı pancar ve ıspanak bitkileri el ile EGFP rekombinant ekspresyon vektörleri taşıyan A.tumefaciens süspansiyonlar ile tarıma sızmış ve floresan protein ekspresyonu Batı leke analizi ile görselleştirilmiş ve UV ışığı altında ölçülür. Kırmızı pancar sistemi daha yüksek bir EGFP ekspresyonu ile karakterizedir, dokuz gün sonrası enfeksiyon taze yaprak ağırlığı gram başına yaklaşık 544 mikrogram ulaşan, ıspanak sadece 11 gün sonrası taze yaprak ağırlığı gram başına yaklaşık 113,4 mikrogram maksimum seviyeye ulaştı. Bu nedenle, kırmızı pancar sonraki tüm deneyler için ifade ana bilgisayar olarak seçilir.
Bitkiler daha sonra vakum bir A.tumefaciens süspansiyon ile sızmış. Agroinfiltrasyon yapraklarından TSP ekstraksiyonundan sonra, numuneler Batı lekeleri ile analiz edilir ve rekombinant protein densitometri analizi ile nispeten ölçülür. Son olarak, potansiyel bir oral aşı gelişimi için parametreler değerlendirilir.
Burada görüldüğü gibi, hedef proteinliyofilizizasyon işleminden sonra stabil olarak görülmektedir. Mide sindirimi, dondurma da kurutulmuş maddeye domuz mide enzimi pepsin ekleyerek simüle edilir, ya mililitre başına bir miligram nihai konsantrasyon, ya da bir-20 oranı, TSP. Her iki sindirim tedavi koşulları rekombinant protein bozulmasıile sonuçlanır.
Pepsin sindirimi nden sonra pelet örneklerinde belirli bir sinyalin bulunmaması, dondurulduktan-kuruduktan sonra bitki hücrelerinin bütünlüğünü kaybettiğini ve bunun da hedef protein yıkımına yol açtığını göstermektedir. Bu prosedür, vakum infiltrasyonu açısından bitki türlerine ve zaman ders analiziaçısından hedef rekombinant proteine dikkatle uyarlanmalıdır. Gösterme prosedürü aynı zamanda aşı ve antikorlar gibi oral doğum için tasarlanmış biyofarmasötik üretimi için de kullanılabilir.
