Bu işlemin genel amacı bıldırcın ve tavuk embriyolarından embriyonik dokuları izole etmek için optimize edilmiş deneysel bir yaklaşım sunmaktır. Bu teknikle gen ekspresyonu çalışmalarında ve fonksiyonel tahlillerde kullanılabilecek saf embriyonik dokular elde ediyoruz. Bıldırcın ve tavuk embriyolarından elde edilen dokular mikrocerrahi ile izole edilir ve biyolojik özelliklerini korurken in vitro enzimatik sindirime tabi tutulur.
İzolasyondan sonra, üç boyutlu korunmuş dokular yüksek çözünürlüklü topografik gen ekspresyon kalıpları analizi için kullanılabilir. Bu yaklaşım, geleneksel yöntemlerle erişilemeyen embriyonik bölgelerde situ gen ekspresyonunu detaylandırmak için özellikle yararlıdır. Buna ek olarak, transkripsiyon analizi yaklaşımları genetik belirteçler gerektirmeden izole dokularda da uygulanabilir, dokuya özgü yüksek iş artışı omik analizi sağlarken.
Alternatif olarak, her iki türün izole dokular bir in vitro organotipik tsay ilişkili olabilir 48 saat. Bıldırcın ve tavuk hücreleri farklı nükleer özellikler ve moleküler belirteçler tarafından ayrımcılığa uğrayabildiği için bu yaklaşım doku etkileşimlerinin incelenmesine olanak sağlar. Kültür dokularının organ oluşturma kapasitesi ovo testiile daha da test edilebilir.
Bu nedenle bu yöntem, son derece dinamik aralıklı modifikasyonlar ile gelişimsüreçlerinde karmaşık doku etkileşimlerini incelemek için yararlı bir araçtır ve aynı zamanda organların oluşumuna belirli embriyonik bölgelerin potansiyelini ortaya çıkarmak için yardımcı olabilir. Örnek olarak, burada izole embriyonik dokulardan bıldırcın-tavuk şimerik timus oluşumu açıklanmıştır. Birincisi, üçüncü ve dördüncü faringeal keselerin endodermi, prospektif timik ilkellik gelişme üç gün ile bıldırcın embriyolarının faringeal bölgeden izole edilir.
Sonra, Bu doku gelişimini destekleyen yeteneğine sahip bir mezenchyme ile ilişkilidir, somatopleura mezoderm. Son olarak, dokuların heterospesifik ilişkisi bir şeymerik timus oluşturmak için in vitro ve ovo kültürlü. Yatay laminar akış başlığı ve steril ize edilmiş alet ve malzemeleri kullanarak steril koşullarda tüm yumurta manipülasyon işlemlerini gerçekleştirin.
Döllenmiş bıldırcın yumurtaları hava odası yukarı bakacak şekilde kuluçkaya yatırıldı. Başlamak için, bıldırcın yumurtalarını kuvözden çıkarın. Soğuk PBS ile dolu büyük bir borosilikat cam kase hazırlayın.
Kavisli makas ile, dokunun ve kuluçka üç gün ile bir bıldırcın yumurtası kabuğunda dairesel bir delik kesti. Yumurtanın karşı tarafındaki deliği künt yapın ve sarısını soğuk PBS ile kaseye aktarın. Ekstraembriyonik damarlara dışarıdan vitellin membran keserek sarısı embriyo çıkarın.
İnce püskler yardımıyla, soğuk PBS ile dolu küçük bir kase embriyo transfer, sonra bir kaymaz ile siyah taban ile bir Petri kabına embriyo taşıyın. Önceki Jove SPA ligasyonunda açıklandığı gibi üçüncü ve dördüncü faringeal keseleri içeren faringeal bölgeyi çıkarın. Daha sonra, enzimatik sindirim için, buz üzerinde, bir saat boyunca soğuk pankreatin ve kuluçka ile dolu bir bardağa üçüncü ve dördüncü faringeal kemer bölge aktarın.
Enzimatik sindirimin kuluçka süresinin gelişim aşamasına bağlı olduğunu unutmayın. Stereo mikroskop altında cam çanak yerleştirin ve bir tutucu iki mikro-neşter kullanarak, üçüncü ve dördüncü faringeal kemer bölgeden endoderm izole. İlk dış yüzeyde endoderm ve ektoderm gösteren, dorsal tarafı ile faringeal bölge yerleştirin.
Nöral tüpün ektoderm, endoderm, mezenkim, kalp tüpü ve ventral kısmını gözlemleyin. Faringeal endoderm in dorsal yüzeyine bağlı nöral tüp ve mezoderm çıkarın. Farinks endoderm gözlemlemek, dördüncü ve üçüncü faringeal torbalar, ve kalp tüpü.
Dorsal tarafı yukarı ile, dikkatle ayırmak ve faringeal kemerler arasında mezenchyme kaldırmak ve faringeal torbalar ortaya çıkarmak. Bu yordamı faringeal bölgenin diğer tarafında gerçekleştirin. Endodermin en posterior kısmına iliştirilen mezenchyme çıkarın ve dördüncü faringeal kese gözlemlemek.
Arka tarafı yukarı, hem sol hem de sağ dördüncü faringeal torbalar gözlemleyin. Endodermin en arka kısmına ve ikinci kese bağlı mezenchyme kaldırarak devam edin. Kalp tüpünü ve iç keseleri çevreleyen mezenchyme çıkarın.
Ventral tarafı yukarı ile, farinks endoderm gözlemlemek, ve ikinci faringeal kemer sağ tarafında. Bu aşamada tiroid rudiment endoderm görünür olmalıdır. İkinci ve üçüncü faringeal kemerlerin ektoderm'ini ayırın ve kemerlerin mezenchyme'sini dikkatlice çıkarın.
Sağ tarafta ikinci faringeal kemer mezenchyme kaldırılması gözlemleyin. Dördüncü ve üçüncü poşetlerin ve tiroid ilkelerinin bulunduğu yere dikkat edin. Faringeal torbalara bağlı mezenkimal hücrelere kalıntıları çıkarın.
Sağ tarafın üçüncü ve dördüncü keselerini ve sol taraftan dördüncü keseyi gözlemleyin. Sol tarafın mezenchyme müfrezesini tekrarlayın. Şimdi sol tarafın üçüncü kesesini gözlemleyin.
Sol tarafta ikinci kemer mezenchyme müfreze gözlemleyin. Bu işlem sırasında tüm yüzeylerin ve çözeltilerin soğuk tutulması gerektiğini unutmayın. Dokuların kesilmesi uzun zaman alan durumda yeni bir soğuk pankreatin çözeltisi ve çanak değiştirin.
Son olarak, ikinci ve üçüncü faringeal torbalar arasında bir transversal kesim ikinci torbalar ve tiroid rudiment kaldırmak için olun. Bu noktada, izole endoderm üçüncü ve dördüncü faringeal torbalar ve farinks arka ucu oluşur. Kalıntıları iki mikro-neşter yardımıyla müstakil mezenchyme çıkarın.
İzole endodermi soğuk fetal sığır serumu ile dolu bir cam çanağa aktarın ve in vitro tahsin in hazırlanması sırasında buz üzerinde tutun. Yumurtalar yatay pozisyonda, üst tarafı ise kömür kullanmak için işaretlenmiştir. Başlamak için, kuvözden yumurtaları çıkarın.
Kavisli bir makasile, kabukta küçük bir delik açın, bir iğne yerleştirin ve 10 mililitrelik şırınga ile iki mililitre albümin aspire edin. Kabuğun işaretli bölgesinde dairesel bir delik açın ve ince forceps ile embriyo tutarken ekstra embriyonik damarlara dışvian membran kesti. Bir stereo mikroskop altında, soğuk PBS içeren siyah baz ile bir Petri kabına embriyo yerleştirin.
Embriyoyu tabağın dibine tutmak için dört böcek iğnesi kullanın. Pimleri kare şeklinde ki ekstraembriyonik bölgeye yerleştirin. 19 ve 24 kromozomlar arasında embriyo eksenine transversvesi arasında iki kesik yapın ve embriyoyu geçerek.
Marjinal embriyonik kenarları keserek bu bölümü bırakın. Lateral plaka, nöral tüp ve somites gözlemleyin. Aspire ve soğuk pankreatin dolu bir cam çanak dokuları aktarın.
Enzimatik sindirim için buz üzerinde 30 dakika kuluçka. Stereo mikroskop altında, tutucularda iki mikro-neşter kullanarak çevredeki dokulardan mezoderm izole. Somatopleura mezoderm, splanchnopleura, nöral tüp ve ektoderm gözlemleyin.
İlk olarak, yüzeydeki ektodermi çıkarın. Ektodermden ayrıştırılan somatopleura mezoderm'i gözlemleyin. Daha sonra, dikkatle somatopleura gelen ventrally bulunan splanchnopleura ayırmak.
Somatopleura sağ lateral mezoderm gözlemleyin. Nöral tüpe paralel bir hareketle keserek serbest bırakın. Bu işlem sırasında tüm yüzeylerin ve çözeltilerin soğuk tutulması gerektiğini unutmayın.
Dokuların kesilmesi uzun zaman alan durumda yeni bir soğuk pankreatin çözeltisi ve çanak değiştirin. Somatopleura sol lateral mezoderm gözlemlemek, somites, nöral tüp, ve ektoderm. Bu tarafın mezoderm salınımını tekrarlayın.
Mikro-neşter ile yavaş hareketler yapın. Maruz kalan ekstrasellüler matriks proteinleri doku ve aletler arasında oturup sıvı hareketlerini önlerler. Dikkatle nöral tüp paralel bir hareketle somatopleura kesti.
İzole mezodermi soğuk fetal büyükbaş serumu ile dolu bir cam çanağa aktarın ve in vitro tahsin in hazırlanması sırasında buz üzerinde tutun. Bir Petri kabına ince bir meshed metal rendeyerleştirin ve kültür ortamı ile doldurun. Orta yüzeyi ızgaranın üst kısmıyla eşitlemek için aşırı sıvıları çıkarın.
İnce pratisyen ler yardımıyla, bir membran filtresini kültür ortamına batırın ve onunla temas eden bir yüzeye sahip olmak için dikkatlice ızgaranın üstüne yerleştirin. Stereo mikroskop altında, spatula ve ince çerofma yardımı ile hafif çeşni ile membran filtreye izole endoderm aktarın. İzole mezoderm için bu yordamı tekrarlayın.
Bir mikro-neşter yardımıyla, bu dernek maksimize etmek için dokuları karıştırın. İlişkili dokuları 37 derecede nemlendirilmiş bir kuvözde 48 saat boyunca %5 CO2 ile dikkatlice yerleştirin. Kuluçka döneminden sonra kültür dokularını koriolan tipi membranüzerine aşılayın ve daha önce açıklandığı gibi organ oluşumunu tamamlamak için 10 gün daha oval olarak gelişmesini bekleyin.
Burada kuş embriyonik dokuların izolasyon uyrkunluğu farklı deneysel yaklaşımlarda kullanılmak üzere izin retiküler yöntemdir. Örnek olarak, faringeal keselerin oluşumunda rol aldığı bilinen genlerin ekspresyonu da embriyonik üçüncü günde tavuk embriyolarından ikinci, üçüncü ve dördüncü faringeal keseleri içeren izole edilmiş bir endoderm değerlendirildi. Sonic Kirpi ifadesi merkezi yutak endoderm tespit edildi ve torbalar dışında, BMP7 ikinci ve üçüncü faringeal torbalar endoderm ifade edildi ve merkezi yutak ve dördüncü yutak kese dışında.
İzole dokular da 48 saat boyunca özellikle in vitro ilişkili olabilir, koriolan tipi membran üzerine greft, ve daha fazla geliştirmek için izin 10 gün. Eksplorasyonlar konvansiyonel histoloji ve immünohistokimya ile analiz edilebilir. Tavuk somatopleura mezoderm ile üçüncü ve dördüncü faringeal torbalar bıldırcın endoderm ilişkisinin bazı temsili sonuçları aşağıdaki-Greftler qcpn ve tavuk lenfoid hücreleri için pozitif timik epitel hücreleri elde edilen bıldırcın türetilmiş tam biçimli bir şemerik timus gösterdi.
Ayrıca, sitokatin pozitif timik epitel normal morfolojik özellikler gösterdi, tipik bir retiküler mimari gösteren. Bu videoyu izledikten sonra, nasıl bıldırcın ve tavuk embriyonik dokular gen ekspresyonu çalışmalarında kullanılabilir izole etmek için iyi bir anlayışa sahip olmalı ve şemerik organlar oluşturarak da organ genetiğinin karmaşıklığını çözmeye yardımcı olabilir.
