Hücresel göç büyük ölçüde bir iyileşme yara nın sonucunu değiştirebilir kritik bir yara iyileşme sürecidir. Bu protokol araştırmacılar daha iyi yara iyileşmesi sırasında hücresel göç üzerinde çeşitli bileşiklerin etkisini anlamak için izin verir. Hangi sık sık klinik tıp için hedefli tedavi stratejileri yol açabilir.
Çizik testi, pahalı ve zaman yoğun in vivo testlerinden önce anlamlı yara iyileştirici verileri oluşturmak için uygun maliyetli ve yüksek iş yaratma yaklaşımıdır. Bir yöntem olarak çizik tsay özellikle yara iyileştirici uygulamalarda ilgilidir. Özellikle, deri.
Ancak, tsay gerçekten bir geçiş tsay ve hücrelerin geçiş ölçmek veya yakalamak için ilgi olduğu herhangi bir hücre türüne uygulanabilir. Klasik hücre ve doku kültürü, standart çalışma prosedürleri, eğitim, teknik ve uygulama, uygulama, uygulama benzer. Bunlar sıfırdan yapılan bir teşpile başarının anahtarıdır.
Prosedürü gösteren Nathan Cruz, bir yüksek lisans öğrencisi ve Oscar Lujan, bir lisans araştırmacısı olacaktır. Bu prosedürü başlatmak için, arka ve yan duvarlardan başlayarak ve taban plakasına kadar çalışan bir sanitasyon silme gerçekleştirmek için %70 izopropil sulu bir solüsyon kullanarak biyogüvenlik II kabinesini hazırlayın. Ayrıca dolap tasnİf in kullanılacak tüm malzemeleri silin.
Daha sonra, istenilen kriyokorunmuş hücre hattını içeren şişeler elde edin ve çözülmek için 37 santigrat derecede bir santimetre derinliğinde bir su banyosu yerleştirin. Bir T75 doku kültürü şişesiiçine% 10 FBS ile desteklenen orta 10 mililitre ekleyin. Hücre stoğunu içeren şişeyi açın ve çözeltiyi dikkatlice aspire edin.
Sonra hücreleri T75 şişesine aktarın. Şişeden bir mililitre lik ortamı çıkarın ve şişeye geri aktarın ve şişedeki hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için şişeye geri aktarın. Şişenin kapağını sıkın ve süspansiyondaki hücreleri tüm yüzeye eşit olarak dağıtmak için hafifçe sallayın.
Bundan sonra, burada gösterilen bilgilerle şişeyi etiketle ve 72 saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le nemlendirilmiş bir kuvöze yerleştirin. İlk olarak, doku kültürü şişesini kuvözden alın ve metin protokolünde belirtildiği gibi yapışan hücreleri gözlemleyin. Şişeden tüm ortam hacmini aspire edin ve bir atık kabına aktarın.
Şişeye beş mililitre dengeli tuz çözeltisi ekleyin ve fazla ortamları, ölü hücreleri veya atık ürünü durulamak için hafifçe sallayın. Daha sonra şişeden tuz çözeltisinin tüm hacmini çıkarın ve bir atık kabına atın. Sonra, şişeye iki mililitre tripsin ekleyin ve enzimi yapışan hücrelerin üzerine dağıtmak için hafifçe sallayın.
Yapışık yüzeyin tamamen doymuş olduğundan emin olun ve doku şişesini 2-3 dakika kuvöze yerleştirin. Bundan sonra, hücre ayrışmasını kolaylaştırmak için şişenin kenarına yavaşça 3-5 kez dokunun. Şişeyi %70 alkolle silin ve biyogüvenlik kabinesini yerleştirin.
Enzim substrat reaksiyonu durdurmak için doku şişesine beş mililitre stok ortam ekleyin. Şişedeki sıvının tüm hacmini aspire edin ve steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Santrifüj 200 kez g ve 25 santigrat derecede beş dakika.
Daha sonra peletli hücreleri içeren tüpü silmek ve biyogüvenlik kabininin içine yerleştirmek için %70 alkol kullanın. Pipet medya kapalı, hücre pelet ile sıvı yaklaşık 250 mikrolitre geride bırakarak. Hızlı bir titreşim oluşturmak ve hücre peletini rahatsız etmek ve yeniden askıya almak için konik tüpün altını mikrosantrifüj tüp rafının şişe yuvaları nda çalıştırın.
Doğru tamamlandığında, yeni hücre çözeltisi kalan pelet ile bulutlu bir karışım olarak görünür. Hücre nin yeniden askıya alınmasına iki mililitre ortam ekleyin. Pipet hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı tüp tarafında 20 kez herhangi bir kümeleri kırmak için.
Ve toplam hücre süspansiyon hacmini kaydedin. Daha sonra, 96 kuyulu bir plakanın boş bir kuyuya 20 mikrolitre trypan mavisi stok eklemek için steril bir pipet kullanın. Steril pipet ucu kullanarak, 15 mililitrelik tüpten 20 mikrolitre hücre stoğunu trypan mavisi solüsyonunu içeren kuyuya aktarın.
Pipet yavaşça içeriğini karıştırmak ve bir hemositometre üzerinde kapak kayma ve sayma odası arasında karışımın 10 mikrolitre transfer. Tanımlanan beş kare için hem toplam hücre sayısını hem de geçerli olmayan hücre sayısını ayrı ayrı sayarak yalnızca merkezdeki hücreleri ve dört köşe karesini sayın. Uygun hücre sayısını hesapladıktan sonra, görüntüleme sırasında referans işareti olarak hizmet vermek için 12 kuyulu bir plakanın alt kısmında yatay bir çizgi işaretleyin.
Hücre stoğunu medya ile mililitre başına 19.000 hücre yoğunluğuna seyreltin. Daha sonra seyreltilmiş hücre stokunun bir mililitre ile 12-iyi plaka her kuyu tohum, periyodik olarak tüm 12 kuyu boyunca bile hücre tohumlama sağlamak için hücre stoku karıştırma. Her plakayı burada gösterilen bilgilerle etiketlayın.
Ve hücreler %100 biraraya gelene kadar 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte bir kuvöze yerleştirin. Kuvözdeki hücrelerle birlikte 12 kuyulu bir plaka alın. 10x hedefi olan bir mikroskop kullanarak, hücreleri gözlemleyin ve her kuyunun birleşimini belirleyin.
Sonra, aspire ve her kuyudan büyüme medya bertaraf. 1-200 mikrolitre steril ucu ile bir P200 pipetter monte edin. Her kuyuda, pipet ucunu 12:00'den 6:00 konumuna kadar hücre yüzeyinde süzülerek sahte bir yara üretin.
Aşırı enkaz ve hücre kümeleri temizlemek için dengeli tuz çözeltisi bir mililitre ile her iyi durulayın. Yıkamayı kolaylaştırmak için tabağı bir taraftan diğer yana sallayın. Daha sonra dengeli tuz çözeltisini her kuyudan çıkarın ve atın.
1,000 mikrolitre ucu olan bir P1000 pipetter kullanarak, bir tedavi grubu ile rasgele atanmış kuyulara hazırlanan arsenik stoklarından 1.000 mikrolitre ekleyin. Her kuyu için yeni bir pipet ucu kullanın ve tedavilerin eklendiğinde zamanı kaydedin. Plakaları %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Plakaları görüntülemek için, 24 saatlik bir süre içinde her dört saatte bir 10x nesnel büyütme de her kuyunun görüntülerini yakalayın. Her zaman noktasında her kuyu içinde çizik boyunca aynı konumu görüntülemek için daha önce plakanın altına çizilen çizgiye başvurun. Bu çalışmada arseniğin hücre göçü üzerindeki etkilerini gözlemlemek için in vivo scratch testi testi kullanılmıştır.
Tüm tedavi gruplarında yaklaşık 0,8 milimetrelik ortalama çizilme genişliğine sahip tek tip çizikler gözlenmektedir. Kontrol hücreleri 20 saat sonra tamamen iyileşmiş bir çizik gösteriyor. İki arsenik grubu bu iyileşme düzeyini göstermez.
10 mikromolar tedavi ile tamamen 24 saat boyunca kapatma inhibe. Bu sonuçlar arsenik varlığının hücresel göçü yavaşlattığını göstermektedir. Test sırasında yakalanan ham görüntüler, yara genişliğini ölçmek, sonra yüzde kapanışı hesaplamak ve son olarak eğrinin altındaki alanı hesaplamak için otomatik yazılım kullanılarak analiz edilir.
10 mikromolar tedavi grubu, diğer tüm tedavi gruplarına göre insan neonatal dermal fibroblastlarının istatistiksel olarak yavaşladıgını göstermektedir. Hücreleri çizerken tutarlılığı artırmak için bu tekniği iyice uygulamak önemlidir. Tahliller arasındaki kasıtsız değişkenlik verileri çarpıtabilir ve sonuçları değiştirebilir.
Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ve enzime bağlı immünosorbent tahlilleri gibi diğer moleküler teknikler, tahlilde gözlenen hücre göçünde yapılan değişikliklere hedef olabilecek haberci sinyalleri ve proteinleri tanımlamak için sıfırdan sonra tahlil de kullanılabilir. Bu araştırma, araştırmacıların kanser metastazı, yeni ortaya çıkan kanser tedavileri, kök hücreler ve rejeneratif tıp ve diğer birçok bilimsel kilometre taşını anlamalarına katkıda bulunmuştur.
