Bu yöntem, kimyasal biyoloji ve ilaç keşfi nde anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Mesela, bileşiğiniz hedef proteine bağlanır mı? Bu tekniğin başlıca avantajları, yapışık hücrelerin ayrılmasına gerek olmamasıdır.
Ve mekansal lokalizasyon görüntüleme ile belirlenebilir. Bu yöntemi hücre hatlarında uygulamış olsak da, bu yöntemi birincil kültürler ve kokültürler gibi diğer hücre sistemlerine de uygulamak mümkündür. Hücreleri tohumlamadan önce, bir doku kültürü kaputuna siyah 384 kuyulu görüntüleme test plakaları yerleştirin ve her plakanın her iki ucunda üç adet 3,5 milimetre çapında delik açmak için standart bir matkap kullanmadan önce plakaları alüminyum folyo ile kaplayın.
Plakalar hazır olduğunda, 5 ila 10 mililitre PBS ile A-431 hücre kültürünü yıkamak için aseptik tekniği kullanın. Ve hücreler ayrışana kadar hücreleri 37 derecede iki mililitre tripsin ile kuluçkaya yatırın. Sayma sonra, 5 kez 10 kültür orta mililitre başına 4 hücreleri hücreleri seyreltmek ve her bir deneme plakaher bir kuyuya hücrelerin 40 mikrolitre tohum.
Yavaşça iyi dipleri arasında hücrelerin homojen bir dağılımını sağlamak için tohumlama sonra yan yana her plaka sallayarak. Plaka kenarı etkilerini en aza indirmek için, hücrelerin 37 santigrat derece ve % 5 karbondioksit iki ila üç gün boyunca özel bir nemlendirilmiş odaya plakaları yerleştirmeden önce laminar akış kaputunun arka oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hakemlik plakaları altında yerleşmek için izin verin. Deney günü, her kuyudan orta aspire etmek için bir tabak yıkama kullanın.
Ve uygun deneysel kuyulara uygun deneysel konsantrasyonda 30 mikrolitre lik ilgi bileşiğinde ekleyin. Bileşik işlenmiş istinat plakalarını nefes alabilen plaka mühürleriyle kapatın. Ve plakaları 30 dakika lığına hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin.
Hücreleri bir ısı sorununa maruz bırakmak için, önce su banyosunu uygun deneysel sıcaklığa ayarlayın ve kuyuların içindeki sıcaklığı izlemek için bir termokupl termometre ile birlikte, her biri orta ve aynı hacimde aynı hacimde bir kalıp plakası içeren mühürsüz bir kukla plakayı banyoya yerleştirin. Uygun deneysel sıcaklığa ulaşıldığında, her bir deney plakasından nefes alabilen mührü çıkarın ve su banyosunda sonraki ısıtma sırasında kuyulara su sızmamasını sağlamak için plakaları sıkı yapışkan alüminyum folyo ile yeniden kapatın. Plaka çerçevesi içinde delinmiş delikleri erişilebilir tutmak.
Plakaların altından kalan havayı zorlamak için su yüzeyine doğru açılı plakaların dipleri ile, banyoya yeni bir kukla plaka ve banyo yerleştirin ve yeni kukla plaka sıcaklığını izlemeye başlayın. Plakanın eşit bir şekilde ısıtılması, istinat performansı için çok önemlidir. Altında sıkışmış hiçbir hava kabarcıkları vardır su banyosu nda plaka yerleştirmek için dikkat edin.
Üç dakika sonra, hemen kendi analiz önce beş dakika boyunca oda sıcaklığında su ikinci bir su banyosunda plakaları soğutun. Hücreleri görüntülemek için, ilk oda sıcaklığında 20 dakikalık bir kuluçka için doğrudan deneme plakaları için% 16 paraformaldehit 10 mikrolitre ekleyin. Fiksasyon döneminin sonunda hücreleri plaka yıkayucuüzerinde 300 mikrolitre PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka için %0,1 NP40'lık 20 mikrolitre ekleyin.
Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi hücreleri yıkayın. Ve oda sıcaklığında bir saat için% 1 sığır serum albumin veya BSA 15 mikrolitre ile hücreleri bloke. Daha sonra, bloke serum aspire için plaka yıkayıcını kullanın ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için uygun kuyulara ilgi birincil antikor 10 mikrolitre ekleyin.
Kuluçka sonunda, her kuyuyu 300 mikrolitre PBS ile yıkayın ve hücreleri ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikordan 10 mikrolitre ile etiketlayın. Hücrelerin nükleer boyama için, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca her kuyuya uygun bir nükleer boya 10 mikrolitre ekleyin. Ve pbs hücreleri gösterildiği gibi yıkayın.
Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her kuyuda 10 mikrolitre hücre maskesi ile etiketleyin. Ardından PBS ile son bir yıkama. Sonra her kuyuya 60 mikrolitre taze PBS dağıtın ve plakaları görüntülemeye kadar alüminyum folyo ile kapatın.
Hücreleri görüntülemek için, otomatik lazer otofokus kullanarak 10 kat hedefi altında uygun floresan kanalları kullanarak yüksek içerikli görüntüleyicide her biri için dört görüntü yakalayın ve satın alma sırasında binning uygulayın. Ardından görüntüleri meta verilerle birlikte 16 bit gri tonlama nokta-tiff dosyaları olarak saklayın. Hedef proteinde ligand bağlanması ile indüklenebilecek konformasyonel değişikliklerle antikor tanıma sı bozulmamalıdır.
Örneğin, BIRB796 uzun bir kapalı oranı vardır ve hedef nişan quantification sadece bir antijen alma adımı uygulayarak mümkündür. Pozitif ve negatif kontrol bileşikleri ile tedavi hücreler için bu temsili termal toplama eğrisi deneyi çeşitli sıcaklıklarda bileşikler ile hücrelerin tedavisinden sonra tipik protein stabilizasyon aralıkları göstermektedir. Burada tipik bir izomal doz-yanıt parmak izi deneydeneysel bileşik farklı dozlarda yanıt olarak protein stabilizasyonu temsili aralıkları göstermek için gösterilmiştir.
Hedef proteinin yeni bağlayıcılarını belirlemek için bileşik tarama için izotermal ısı zorluklarının uygulanması, hedef protein stabilizasyonunu doğrulamak için isabetlerin izotermal doz yanıtı parmak izi öncesinde, tek bir konsantrasyonda çok sayıda bileşiğin analizini sağlar. Bu prosedürü denerken, ısı mücadelesinin uzunluğu ve sıcaklığı gibi tam deneysel koşulların bileşiklerin gözlenen gücünü etkilediğini unutmamak önemlidir. Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.
Ve bu prosedürü uygularken kurumsal güvenlik yönergelerine uymak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.
