Bu yöntem protein kimyası ve ilaç keşfinde hangi koşullar bir proteini stabilize eder gibi sorulara cevap verebilir? Hangi mutasyonlar bir enzimin termostabilitesini etkiler? Peki hangi ligandlar protein hedefine bağlanır?
Bu tekniğin en önemli avantajları, hızlı olması, standart bir laboratuvarda kolayca gerçekleştirilmesi ve orta ve yüksek üretim uygulamalarına mükemmel bir şekilde uygun olmasıdır. Protein numunesi transferini hazırlamak için bir stabilite ekranının her koşulundan 10 mikrolitrelik bir 96 kuyunun ilgili kuyusu içine zaman kazanmak için çok kanallı bir pipet kullanarak. Daha sonra uygun bir tampon sistemde mililitre başına yaklaşık bir miligram protein çözeltisi hazırlayın.
Termal vardiya tahlil yapıyorsa protein örneğine 20X'lik son konsantrasyona SYPRO turuncu boya ekleyin. Ya ters veya kısa bir girdap tarafından karıştırın. Şimdi protein çözeltisinin 10 mikrolitresini 96 kuyunun her kuyusu içine aktarın.
Protein numunesi ve ekran bileşeninin karıştırıldığından emin olmak için 96 kuyu plakasını 600 kez G'de iki dakika boyunca mühürleyin ve santrifüj edin. Stabilite ekranını derin kuyu bloğunu yeniden kapatın ve ekranı dört aya kadar dört derece santigrat derecede saklayın. TSA denemesini gerçekleştirmek için, çekmecenin sağ tarafındaki girintiyi sıkıca bastırarak örnek çekmeceyi açın.
96 kuyu tepsisini RTPCR sistemine sol a-one ile yerleştirin. TSA denemesini ayarlamaya başlamak için yeni deneme düğmesini tıklatın. Deneme Özellikleri sekmesinde, sorulduğunda Erime Eğrisi seçeneğini tıklatın, ne tür bir deneme ayarlamak istiyorsunuz?
Sonra sorulduğunda diğer seçeneği tıklatın, hedef sırasını algılamak için hangi reaktifleri kullanmak istiyorsunuz? Plaka Kurulumu'nda, Hedefleri ve Örnekleri Tanımlay sekmesinde, bir Hedef Adı girin ve ardından Reporter'ı ROX olarak ayarlayın. Ve Quencher yok olarak.
Plaka Kurulumu'nda, Hedefleri ve Örnekleri ata, pasif başvuru olarak kullanmak üzere boyayı Yok olarak ayarlayın. Aynı sekmede, 96 kuyu plakasının her kuyuyu bir önceki adımda girilen hedef ada atayın. Çalıştırma Yöntemi sekmesinde, toplam üç olana kadar adımları silin.
%100 rampa hızı ve beş saniyelik bir süre ile ilk adımı 25 santigrat dereceye ayarlayın. %1 rampa oranı ve bir dakikalık bir süre ile 95 santigrat derece ikinci adım ayarlayın. Son olarak, % 100 rampa oranı ve beş saniye lik bir süre ile 95 derece Santigrat üçüncü adımı ayarlayın.
Veri toplama menüsünü kullanarak veya veri toplama simgesini tıklatarak Veri Toplama'yı seçin. Kuyu başına reaksiyon hacmini 20 mikrolitreye ayarlayın. TSA denemesini başlatmak için Çalıştır düğmesini tıklatın.
NanoDSF, dışsal boyalar kullanılmadan protein termal stabilitesini araştırmak için kullanılabilir. Numuneler protokolde daha önce açıklandığı gibi 96 kuyu plakası içinde ancak herhangi bir SYPRO portakal boyası ekleilmeden hazırlanabilir. Çekmeceaç düğmesine basarak örnek çekmeceyi açın.
Numune rafına yakın toza özellikle dikkat çekerek ekipmanın temiz olduğundan emin olun. Sistem geri saçılma ayna varsa etanol ve tiftik serbest doku kullanarak temizleyin. Kılcal damarları, 96 kuyu plakasının her kuyudan yaklaşık 10 mikrolitre ile, kılcal damarın bir ucuna dokunarak çözeltiye yükleyin.
Ve sonra örnek raf ilgili kılcal tutucular içine kılcal yerleştirin. Bu deney boyunca floresan okumaları engelleyebilir gibi parmak izi ile kılcal damarların orta kontamine değil dikkatli olun. Bir manyetik sızdırmazlık şeridi ile kılcal damarları immobilize.
Discovery Scan sekmesindeki Başlat Discovery Scan düğmesine basarak her kapillerin konumunu ve yoğunluğunu algılamak için bir ön tbmm başlatın. Her kılcal damar tayini nin zirvesi 4, 000 ve 12,000 ünite arasında olana kadar olay uyarma gücünü %10'luk bir başlangıç gücünden artırın veya azaltın. Erime Tarama sekmesi nde, Sıcaklık Eğimi seçeneğini dakikada 7,0 dereceye ayarlayarak Eritme Tkişi.
Başlangıç Sıcaklığı 25 santigrat dereceye kadar. Ve Sıcaklığı 95 dereceye kadar düşürün. Ardından Erimeyi Başlat düğmesine basarak nanoDSF deneyini başlatın.
Örnekleri tam bir denemeye hazırlamak için bu adımları tekrarlayın. Denemenin tamamı ayarlandıktan sonra Erime Tarama sekmesine gidin ve Sıcaklık Eğimi seçeneğini dakikada 1,0 santigrat dereceye ayarlayarak Erime Tkişi'nı programlayın. Başlangıç Sıcaklığı 25 santigrat dereceye kadar.
Ve Sıcaklığı 95 dereceye kadar düşürün. Son olarak, Erimeyi Başlat düğmesine basarak nanoDSF deneyini başlatın. T m farklı koşulların elverişlilik karşılaştırmak için bir kriter protein termal istikrar nicel bir ölçü olarak kullanılır.
Burada gösterilen tuz ekranından örnek sonuçları, lysozyme doğru amonyum klorür termal stabilize özellikleri örnek. Lysozyme'nin T m değerlerinin pH ekranı ile karşılaştırılması, TSA ile nanoDSF arasındaki anlaşmanın genellikle iyi olduğunu, ancak nanoDSF'nin TSA'dan biraz daha büyük T m vardiyalarında biraz daha yüksek T m değerlerini belirleme eğilimini gösterdiğini ortaya koymaktadır. PH değerlerinin düşmesi ile kararlılığı artırmanın genel bir eğilimi vardır.
Aynı pH değerlerine sahip farklı tampon sistemleri kullanılarak elde edilen T m değerlerinin aralığı önemli olabilir. Her stabilite ekranından en yüksek TSA T m değerlerini veren koşulların lysozyme kombinasyonları sinerjik kombine etki için prob için test edilmiştir. Arabellek sisteminin daha fazla bileşeni eklendikçe T m değerlerinde genel bir artış vardır.
Bir arabelleğin tek tek bileşenleri optimize edildiğinde ve kararlılık ekranlarıyla birleştirildiğinde gözle görülür bir sinerjik etki oluşabilir. Bu tekniğin ardından bir proteinin üç boyutlu yapısını belirlemek ve ligand bağlanmasının moleküler temelini çözmek için kristalizasyon gibi başka yöntemler de kullanılabilir. Virus-X projesinin bir parçası olarak protein stabilitesi hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra, bu teknik çok çeşitli ilaç keşif ve geliştirme sistemleri için de geçerlidir.
