Bu yöntem, duyusal iletim, nosiseptif regülasyon ve kronik ağrı veya ağrı gelişimi altında yatan spinal mekanizmaları nnetilmesine yardımcı olabilir Bu tekniğin ana avantajı ideal nöronal korunmasına izin verebilir ve belirli bir ölçüde in-vivo koşulları taklit edebilirsiniz. Bir kılcal puller kullanarak borosilikat cam mikrokapiller kayıt elektrotları çekerek başlayın. Daha sonra, 2,0 santimetre agar blok tarafından 1,5 santimetre 1,2 santimetre hazırlamak için erimiş agar ile bir kalıp doldurun.
Enine bölümler planlıyorsanız, bloğu merkezi bir kanala sahip olacak şekilde kırpın. Ya da parasagittal kesitler için bloğun kenarı ile bir kanal eti. Transkardiyal profüzyon ve omurilik ekstraksiyonundan önce 500 mililitre sakaroz bazlı ACSF hazırlayın.
Çözeltiyi buz soğuğuna soğutun ve %95 O2 ve %5 CO2 ile dengeleyin. Buz üzerindeki tüm diseksiyon araçlarını soğutun. Kaudal'dan rostral'a kadar arka deride beş santimetrelik uzunlamasına bir kesi yapın.
Sonra, her iki tarafta omurga ve kaburga arasında göğüs kafesi ile kesti. Omurganın kaudal ucunda bir kesim yapmak için makas kullanın. Sonra çevreleyen dokuları kesip hızlı bir şekilde omurganın lumbosacral segmenti izole.
Lumbosakral segmenti buz gibi sakaroz bazlı ACSF içeren cam bir tabağa aktarın. Ventral tarafı yukarı doğru ile, vertebral pedikül ile iki taraflı kesmek ve dikkatle omurilik maruz ince makas kullanın. Lumbosakral genişleme ile omuriliğin iki santimetre uzunluğundaki bölümünü izole edin ve omurilik bölümünü soğuk sakaroz ACSF ile dolu başka bir cam tabağa aktarın.
Menenjler ve pia araknoid membran kaldırmak için bir diseksiyon mikroskop altında çalışın. Mümkün olduğunca çabuk uzak tüm ventral ve dorsal kökleri kesin. Menenjler ve omurilik kökleri çıkarırken omurilik, özellikle dorsal boynuz yaralanmasını önlemek için özen gösterin.
Daha önce kesilmiş agar blok üzerinde omurilik yerleştirin. Enine dilimler hazırlamak için, omuriliğin ventral tarafını sırt tarafı ile agar'a saplayın. Parasagittal dilimler hazırlamak için, ventral tarafı süper yapıştırıcı ile agar'a dikey yönde takın.
Sonra, superglue ile bir vibratom bir platforma agar blok monte. Ve saniyede 0,025 milimetre ve titreşim frekansı 80 Hertz gelişmiş bir hız ile 300 ila 500 mikron enine veya parasagittal dilimler hazırlayın. Omurilik dorso-ventrally dilimlenmiş olmalıdır.
En iyi sonuçlar için dilim 15-20 dakika içinde hazırlanmalıdır. Omurilik kalınlığı hücre görünürlüğünü karşılamak için en fazla 600 mikron olmalıdır. Dilimleri 32 santigrat derecede sürekli oksijenli ACSF içeren bir depolama odasında naylon kafesüzerine aktarmak için plastik kesilmiş pipet kullanın.
Substantia jelatinosa veya SG nöronlardan tam hücre yama kıskaç kayıtları yapmak için, sadece inhibitör post-sinaptik akımların kaydı için sezyum katyon bazlı çözelti uygularken kayıt için potasyum iyon bazlı hücre içi solüsyonlar kullanın. Omurilik dilimini yavaşça kayıt odasına taşıyın. Ve sonra optimum dilim stabilitesi için naylon iplikleri ile U şeklinde platin tel ile sıkıca stabilize.
Oda sıcaklığında kabarcıklı ACSF ile sürekli bol dilim ve yeterli oksijenasyon elde etmek için dakikada 2-4 mililitre profüzyon oranı ayarlayın. Daha sonra, düşük çözünürlüklü mikroskop lens kullanarak, yarı saydam bir bant olarak SG nöronların bölge belirlemek. Yüksek çözünürlüklü hedefi kullanarak hedef hücre olarak parlak ve pürüzsüz bir membran ile üç boyutlu bir şekil ile karakterize sağlıklı bir nöron seçin ve video monitör ekranın ortasına ayarlayın.
Bir mikro pipeti uygun miktarda potasyum iyon bazlı veya sezyum iyon bazlı hücre içi solüsyonile doldurun. Daha sonra mikro pipeti elektrot tutucuya takın ve hücre içi çözeltinin tutucunun içindeki gümüş telle temas ettiğinden emin olun. Mikro pipeti odak haline getirin ve mikromanipülörü kullanarak ACSF'ye daldırın.
Herhangi bir kir ve enkaz uzak zorlamak için hafif bir pozitif basınç uygulayın. Yavaş yavaş hedeflenen nörona doğru mikro pipet hareket ettirin. Pipet nörona yaklaştıktan sonra nöronal membranda çok küçük bir gamze oluşur, bir gigaseal oluşturmak için pozitif basınç bırakın.
Bir hücrenin fizyolojik istirahat membran potansiyeline yakın eksi 70 milivolt, tutma potansiyelini değiştirin. Daha sonra, membran yırtmak ve iyi bir bütün hücre yapılandırmaoluşturmak için mikro pipet geçici ve nazik emme uygulayın. Her bir nöronun ateşleme paternini, istirahat membran potansiyelinde 25 pikoamp artışlı 25 ila 150 pikoamptan oluşan bir dizi ikinci bir depolarize akım darbeserisiyle mevcut kıskaçta test ederek atış özelliklerini kaydedin.
Somatik alt eşik akımlarını kaydetmek için membran potansiyelini voltaj kelepçesi modunda eksi 50 milivolt olarak tutun ve ardından eksi 60 milivolttan eksi 120 milivolta kadar bir saniyelik hiperpolarize voltaj darbeleri uygulayın. Eksi 70 milivolt tutma potansiyelinde voltaj kelepçesi modunda potasyum iyon bazlı hücre içi çözeltiile uyarıcı post-sinaptik akımları kaydedin. IPSC'nin sezyum iyon bazlı hücre içi solüsyonu kullanarak IPSC'leri kaydedin.
Membran potansiyelini eksi 70 milivoltta yaklaşık beş dakika tuttuktan sonra, yavaş yavaş tutma potansiyelini sıfır milivolta çevirin. Sabitleme için birkaç dakika bekleyin ve ardından IPSC olaylarını kaydetmeye başlayın. Dinlenme membran potansiyelinde bir SG nörona bir dizi saniyelik depolarize akım darbeleri enjekte edilerek belirlenen ateşleme desenleri tonik ateşleme, gecikmeli-ateşleme, boşluk atışı, ilk patlama, phasik patlama, tek ani ve isteksiz-ateş olarak sınıflandırılabilir.
Bu resim, voltaj kıskacındaki eşik altı akımlar için çağrıştıran protokolü gösterir. Bu temsili izler, IH, IA ve BT olarak sınıflandırılan hiperpolarize akım enjeksiyonuna verilen yanıtı göstermektedir. Bu SEPSC'nin SG nöronlarından eksi 70 milivoltluk 50 mikromolar APV ve 20 mikromolar CNQX varlığında kaydedilmiş temsilcisi bir izdir. Bu izleme, genişletilmiş bir zaman ölçeğinde APV ve CNQX eklenmesinden önce kaydedilen SEPC'leri gösterir.
Bu prosedürü takiben eşleştirilmiş yama kıskaç kayıtları veya optogenetik gibi yöntemler substantia jelatinosa belirli nöronal mikrodevreler karakterize gibi ek sorulara cevap olarak yapılabilir.
