Bu yöntem, RGD-Peptid etiketli Galyum 68'in hazırlanmasında anahtar soruların ve analoglarının biyolojik değerlendirilmesi yönteminin yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, yeni bir radyometal etiketli peptid gelişimi için basit bir sistemik protokol olmasıdır. Prosedürü gösteren Ki-Hye Jung, enstitümüzden bir post-doc olacak.
Radyoetiketli galyum germanyum jeneratöründen radyoetiketli galyum triklorür eute 0.5 azılı hidroklorik asit kullanarak başlayın. 80 santigrat derecede azot gazı ile beş mililitre reaksiyon şişesinde bileşiğin temizlenmesi. Kurutulmuş bileşik bir azı kaşığı sodyum asetat argd peptit arginin glisin asetat veya RGD peptit 100 mikrogram eklenmesi izledi.
Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğumadan önce 5 dakika boyunca 80 derecede ısıtın. Ham ürünü yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile arındırmak için, çözümü bir C18 sütununa ekleyin ve çözümü C18 ters fazlı kartuştan geçirin. Kartuşun iki mililitre salin ile yıkayın ve 0,7 mililitre %95 etanol ile radyoetiketli peptid'i aşındırın ve ardından çözücünün 80 derecede azot gazı altında 20 dakika boyunca çıkarılmasını bekleyin.
PBS'deki saflaştırılmış peptidin yeniden oluşturmasını ve radiolabeled ürünü steril 0,22 mikron steril süzgeçten filtrele. Peptiti bir mililitre steril salin çözeltisi içinde formüle edin ve bir mikrolitre peptit çözeltisini anında ince tabaka kromatografi plakasına yerleştirin. Daha sonra, radyo kimyasal verimi belirlemek için noktadan dokuz santimetre uzakta kadar sulu 0,1 molar sitrik asit içeren odada plaka geliştirmek.
Peptitin in vivo hücresel alımını değerlendirmek için, bir kez tedavi 10 altı iyi plakalar için altı iyi plakalar başına bir kez 10 radyoetiketli RGD-peptid 111 kilobecquerel ile iyi 37 derece santigrat 30, 60, 90 veya 120 dakika triplicate. Kuluçka sonunda, kuyuları yıkama başına iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri PBS'de %0,25 Tripsin ve %0,02 EDTA ile 37 derecede 37 derecede üç ila beş dakika kaplayın. Daha sonra, bir gama sayacı üzerinde radiolabeled peptid alımını ölçmek için 15 mililitrekonik tüpler içine her kuyudan hücreleri aktarın.
Radyoetiketli RGD-peptidin serum stabilitesini değerlendirmek için, 500 mikrolitre taze hazırlanmış fare serumu, 500 mikrolitre insan serumu ve 500 mikrolitre PBS ila 50 mikrolitre her numunenin 50 mikrolitresini ekleyin ve karışımları iki saate kadar 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra her numunenin bir ila iki mikrolitresini 30, 60, 90 ve 120 dakikalık kuluçkadan sonra bir anlık ince tabaka kromatografi plakasına yerleştirin ve plakaları gösterildiği gibi geliştirin. Peptidin lipophililinite belirlemek için, bir octanal PBS sistemine radiolabeled RGD-peptid 10 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika cömertçe şişeleri karıştırın.
Daha sonra bir gama sayacı ile ölçmek için her katmandan örnek 100 mikrolitre hasat ile peptid toplamak. Radyoetiketli tümör modelleri oluşturmak için, enjekte edilecek BALB / c çıplak fare başına 28 gauge iğne ile donatılmış yarım inç insülin şırınga içine PBS 100 mikrolitre altıncı insan glioblastoma hücrelerine beş kez 10 yük ve her alıcının sol kanadına deri altında tümör hücreleri teslim. Peptidin pozitron emisyon tomografisi veya PET ile in vivo nicelemesi için, kafaya tümör taşıyan, anestezili fareyi PET gantry'ye yerleştirin ve 200 mikrolitre PBS pbs pbs'de 7,4 megabecquerel satarak liste modunda pet satmayı yaparken kuyruk ven üzerinden her xenograftatif fare modeline uygulayın.
Ex vivo biyodistribution analizi için, xenografted, tümör taşıyan bir hayvanın kuyruk damarına 200 mikrolitre PBS radyoetiketli RGD-peptid 0.37 megabecquerel enjekte ve 30, 60, 90 ve 120 dakika enjeksiyon sonrası ilgi dokuları hasat. Sonra dokuları tartın ve radyoaktivitelerini bir gama sayacı ile ölçün. Şelasyondan sonra, reaksiyon kirleri başarıyla gösterildiği gibi yüksek performanslı sıvı kromatografi ile kaldırılabilir.
Radyoetiketli RGD peptidin %99'dan daha fazla radyokimyasal saflığı, nanometre başına 90 ile 130 megabecquerel arasında sentezin sonunda belirli bir aktivite ile elde edilebilir. PET analizi karaciğer, böbrek, kalp, kas gibi büyük organlarda ilk yüksek alımı gösterir, yanı sıra tümör içinde. Analizin ilerleyen aşamalarında tümör bölgesi, peptidin kinetik stabilitesini gösteren, kas oranının değişmeden kalmasıyla tümör le açıkça görüntülenebilir.
Ex vivo biyodistribution analizi, in vivo PET bulgularından beklendiği gibi tümörde birikmiş radyoaktivitenin zaman içinde azaldığını ortaya koymaktadır. Bu prosedürü denerken, metodolojimizin hassas biyolojik değerlendirme sürecinin yerini alamasa da, geleneksel ilaç geliştirme uygulamalarının zamanını ve maliyetini önemli ölçüde kullanmak için kullanılabileceğini unutmamak gerekir. Radyoaktif maddelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve kişisel bir dosimetre ve termolüminesans dosimetre gibi uygun koruyucu ekipmanların kullanılması gibi önlemlerin her zaman bu işlemleri gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.
