Melodi Neely, Jon Allen, Basel Abuaita ve Donna Runft zebra balığı model geliştirmek için yardım çabaları için teşekkür. Rapor burada araştırma Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numaraları R21AI095520 ve R01AI127390 (için Jeffrey H. Withey) altında tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Wayne State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Bu yöntem ilk Runft vd. tarif 12
1. bağırsak kolonizasyon düzeylerinin belirlenmesi
Not: çeşitli V. cholerae suşlarının göreli fitness veya mutasyonlar gen bastırmayı veya renk çakışmalarını etkileri karşılaştırmak için kullanılabilir gibi bağırsak kolonizasyon en yararlı zebra balığı modelindeki ölçümdür.
<ol><li>Zebra balığı daldırma tarafından aşı Not: Maruz kalma anlamına gelir enfeksiyon doğal seyri benzer.<ol>
<li>V. cholerae hazırlanması
		<ol>
<li>Lysogeny suyu (LB) bir izole V. cholerae ile 5 mL aşılamak bir LB koloni plaka ve 6 – 8 h (gecede kültür) 37 ° C'de (180 rpm) sallayarak ile kuluçkaya.</li>
			<li>Taze autoclaved LB ortamda 250 mL konik şişesi 25 mL 50 µL yukarıdaki gecede kültür ile aşılamak. 16-18 h 37 ° C'de (150 devir/dakika) sallayarak ile için kuluçkaya.</li>
			<li>600 optik yoğunluk okumak nm 1/10 seyreltme mL başına bakteri sayısını tahmin etmek için gecede Kültür (OD600) (OD600 = 1 ~ 109 CFU/mL'dir.)</li>
			<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü 10 dk. Kaldır için 6000 g de medya bir pipet ile hasat veya dezenfektan bir çözümde dök. 1 x 107 1 x 10 ml PBS10 arasında genellikle istenen konsantrasyonu steril PBS hücrelerde resuspend. Not: Burada, autoclaved ters ozmoz su 60 mg/L deniz tuzları içeren steril enfeksiyon su biz bakın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Aşılama ve kuluçka
		<ol>
<li>Dört ya da beş zebra balığı 200 mL steril enfeksiyon su içeren bir 400 mL kabı yerleştirin.</li>
			<li>V. cholerae 1 mL (adımından 1.1.1.4.) istenen enfeksiyon konsantrasyonu (genellikle 5 x 104 5 x 107 CFU/mL) 200 mL enfeksiyon su almak için ekleyin.</li>
			<li>Balık dışarı atlama önlemek için bir delikli kapaklı ölçek kabı kapak; 200 µL ipucu kutusunun üstünde de bunun için çalışıyor.</li>
			<li>Her kabı etiket ve 28 ° C'de deneme süresi için ayarla bir cam-ön kuluçka makinesi içine koyun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Yordam geçici maruz kalma Not: inoculating bakteri kaldırma tarafından takip V. cholerae (genellikle 6 h) geçici maruz iletimi eğitim ve atılan bakterilerin daha doğru miktar için yararlıdır.<ol>
<li>Maruz kalma 6 h sonra balık toplamak için bir ağ yoluyla ölçek su dökmek. Virüslü su V. choleraeöldürmek için çamaşır suyu bir konteyner içine atın.</li>
			<li>Kaldırılan balık 200 mL steril enfeksiyon su kabı içinde yerleştirin. Balık balık yüzey bakteri kaldırmak 5 min için bu temiz suda yüzmek için izin.</li>
			<li>(Adım 1.2.2) net yordamı yineleyin ve 200 mL steril enfeksiyon su yeni bir ölçek içinde balık yer. Balık deneme süresi için bu kabı içinde tutun.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Ötenazi
	<ol>
<li>Deneme istenen bitim ulaştığında enfeksiyon örneğini su alın (15 mL genellikle yeterlidir) atılan bakteriyel sayar ve ishal (müsin tahlil, protein içeriği, ve/veya gibi OD), ölçümü için Eğer izin vermek için (Bölüm 2) isteniyorsa.</li>
		<li>Su (balık toplamak için) bir ağ üzerinden geri kalanı kapalı su V. cholerae öldürmek için çamaşır suyu içine dökün.</li>
		<li>Balık enfeksiyon su artı 336 µg/mL etil 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) içeren bir kabı yerleştirin ve bu tricaine çözüm için 20 dk RT. az balıkta kuluçkaya Not: File çorap % 10 çamaşır suyu çözüm ile sterilize.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseksiyon
	<ol>
<li>Balık hazırlanması<ol>
<li>Tek kullanımlık plastik kaşıkla tricaine çözüm çıkmış bir balık kepçe ve parçalanmış bir yüzeye yerleştirin.</li>
			<li>Pozisyon balık ventral tarafı yukarı bakacak şekilde ve PIN PIN künt sonu ile alt çene içinden vücudun merkezinden açılı. Başka bir PIN Ayrıca uzak vücut açılı anüs, sadece arka yerleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bağırsak pozlama<ol>
<li>Pamuklu çubuk hav bırakmayan bir bezle balık ventral yüzeyinde % 70 etanol daldırma.</li>
			<li>Bir neşter ve kenasen makas % 70 etanol daldırma ve onları yanan sterilize.</li>
			<li>Küçük bir insizyon attım sadece derinin altında Karnında boyuna ölçekler delici ve neşteri kullanarak olun. Bağırsak deri altında bulunan gibi çok derin kesmemeye dikkat et.</li>
			<li>Makas kullanarak, belgili tanımlık kesme dikkatlice deri seviyesinden daha derin kesme ve anüs kaçınarak vücut uzunluğu boyunca uzanır.</li>
			<li>Belgili tanımlık kesme bir açılmasına izin balık başkanı doğru makasla iki yan kesim yapmak.</li>
			<li>PIN deri vücuttan dışarı, pins olta balıkçılığı diseksiyon yüzeye yanal insizyon her tarafında. Not: Bu pimlerden hiçbirinin ipuçları daha önce alkol ile yanan tarafından sterilize.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Bağırsak Temizleme Not: Bağırsak üstünde tepe-in diğer organlara soluk, çok ince bir tüp olarak görünür olmalıdır.<ol>
<li>Forseps alev sterilize etmek ve onları tüm bağırsak (genellikle 12-15 mm uzunluğunda) kaldırmak için kullanın. Bağırsak (bkz. Adım 1.4.1–1.4.2) cam boncuk ve 1 mL 1 x PBS veya LB, buz üzerinde içeren bir homojenizasyon tüp içine koyun.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Homojenizasyon
	<ol>
<li>Homojenizasyon tüpler 2 mL 1 mm cam boncuk dökme ~1.5 g tarafından önceden vidalı kapak tüpler (yaklaşık yarım doldurun) hazır olun ve sonra onları tarafından ısıyla sterilize.</li>
		<li>1 mL steril LB veya 1 x PBS ekleyin.</li>
		<li>Bir kez zebra balığı bağırsak eklendi (adıma 1.3.3.1) tüpler, vidalı kapaklar çok sıkı olmuştur ve sonra girdap homogenizer tüplerde güvenli.</li>
		<li>Homojenize örnekleri için maksimum ayar 1 dk sonra serin buz 1-2 dakika süreyle üzerlerine bu homojenizasyon döngü bir kez daha tam bir homojenizasyon için yineleyin. Not: Homojenizasyon için birkaç alternatif yöntem de aynı işi görür.</li>
	</ol></li>
	<li>Bağırsak kolonizasyon düzeyleri miktarının
	<ol>
<li>Tüpler (küçük cam test tüpleri veya 1.5 mL microcentrifuge tüpler) her tüpün LB veya 1 x PBS 900 µL ekleyerek homogenate seri seyreltme için hazır olun. Her balık için 5-6 tüpler hazırlamak ve bağırsak homogenate 10 kat seri dilutions ilk Tüp, homogenate 100 µL ekleyerek bu duruma vortexing mix ve sonra 100 µL ilk tüp sizden ikinci tüp ekleyerek için.</li>
		<li>Tüm dilutions hazırlanan kadar bu yordamı yineleyin.</li>
		<li>100-200 µL her seyreltme 100 µg/mL streptomisin (streptomisin dirençli suşların kullanıyorsanız) ve X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 40 µg/mL içeren LB agar plakaları, plaka. 16-18 h 30 ° C'de plakaları kuluçkaya.</li>
		<li>Gecede kuluçka sonra V. cholerae kolonileri tabaklarda, bir otomatik koloni sayaç kullanarak veya el ile kolonilerin sayımı saymak; bir marker ucu ile sayılan kolonileri işaretlemek yararlıdır.</li>
		<li>Balık bağırsak başına CFU kaplama hacmi dikkate alarak süspansiyon, seyreltme faktörü tarafından plaka sayısı çarpılarak belirler.</li>
	</ol></li>
</ol>2. balık ishal ölçümü
Not: Balık ishal değerlendirmek için dört farklı ölçümleri kullanılmıştır: su, su, OD600 su ve V. cholerae CFU su13' te genel atılan protein düzeyleri müsin seviyelerinde. İshal normalde görsel olarak belirgin olur yaklaşık 6 h zebra balığı yukarıda açıklandığı gibi V. cholerae maruz kaldıktan sonra.
<ol><li>
Müsin düzeylerini belirlemek Not: Müsin salgılanmasını V. cholerae kolonizasyon sırasında indüklenen ve atılımı düzeylerinin, özellikle erken enfeksiyon13iyi bir ölçüsüdür. Müsin tahlil microtiter periyodik asit Schiff tahlil19bir çeşididir.<ol>
<li>Aşağıdaki belgeleri hazırlamak: % 50 (w/v) hisse senedi çözüm periyodik asit ve % 0.1 periyodik asit çalışma çözüm (5 mL % 7 asetik asitin eklendi % 50 periyodik asit stokunun 10 µL — hemen yaptıktan sonra kullanın), müsin standartları, 96-de microtiter plakaları, Schiff'ın reaktif.<ol>
<li>Müsin (üzerinden bir domuz mide tip III) aşağıdaki miktarda sodyum asetat arabellekte (100 mM sodyum asetat, 5 mM EDTA, pH 5.5 buzul asetik asit ile) askıya tarafından müsin standartları hazırlamak: 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL ve 10 µg/mL. Plaka enfeksiyon 100 µL ekleyerek su assay olarak aşağıdaki gibi kullanılacak olan her şey için hazır olun: 1 x PBS; boş Yukarıda açıklandığı gibi müsin standartlar, ya da--dan balık hastalık su örneği. Her örnekte nüsha yapmak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her bir çok kanallı pipet ile iyi ve yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından karıştırarak için taze % 0,1 periyodik asit çözüm 50 µL ekleyin.</li>
		<li>Plaka sıkıca plastik wrap sarın ve 37 ° c için 1-1.5 saat kuluçkaya.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 5-10 dk. eklemek 100 µL Fuchsin çözüm (Schiff'ın reaktif) her şey ve damlalıklı yukarı ve aşağı karıştırmak için aşağı plaka ne yapıyorsun?</li>
		<li>Plaka plastik wrap sarın ve renk geliştirdiği kadar oda sıcaklığında sallanan bir platform üzerinde kuluçkaya; rengi genellikle 20 dk. 560 absorbans okumak içinde geliştirilen bir plaka okuyucu kullanarak nm.</li>
		<li>Müsin standart eğri (OD560vs µg/mL müsin standart) arsa. Her bilinmeyen OD560 standart eğri üzerinde düştüğü belirlenmesi ve bu değeri karşılık gelen müsin konsantrasyona okuma bilinmeyenli müsin düzeylerini belirlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protein düzeyleri belirlemek Not: müsin yanı sıra, genel protein düzeyleri suda balık tarafından üretilen ishal (bulutlu, sıvı dışkı) düzeyleri için başka bir proxy vardır. Bu yordamı bir standart Bradford tahlil protein düzeyleri hesaplamak için kullanır. Protein düzeyleri bir sığır serum albumin (BSA) standart eğri dayanarak tahmin edilir.<ol>
<li>(Aşağıdaki nota bakın) BSA standartları birinin 100 µL veya enfeksiyon su (suyu kabı virüslü balık içeren) 100 µL Bradford 900 µL ile tahlil reaktif (Pierce protein tahlil reaktif de bunun için çalışır) tek kullanımlık bir küvet içinde karıştırın. Tüm örnekleri, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya. Not: Aşağıdaki BSA standartları kullanılmıştır: 1.800 µg/mL, 1000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 50 µg/mL ve 25 µg/mL. BSA standartları autoclaved distile suda seyreltilmiş.</li>
		<li>Her standart OD660 okuma veya bir spektrofotometre kullanarak örnek.</li>
		<li>BSA standart eğri (OD660vs µg/mL) arsa. Burada her bilinmeyen OD660 BSA standart eğri üzerinde düşüyor ve bu değeri karşılık gelen müsin konsantrasyona okumak tanımlayan tarafından bilinmeyen protein düzeyleri belirler.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ölçü OD600 Not: sonra birkaç h ve basit OD600 kararlılık bu ölçmek için kullanılabilir olup olmadığını diyare (bulutlu, sıvı dışkı) gözle görülür belirgindir.<ol>
<li>Eşit içeriği dağıtmak için birkaç kez enfeksiyon su içeren tüp tersine çevirin. Su örneği 1 mL tek kullanımlık bir küvet için ekleyin. 1 mL steril enfeksiyon su negatif kontrol kullanın.</li>
		<li>"Boş" bir ölçüm spektrofotometre 600 kullanarak gerçekleştirmek negatif denetimi örneğini kullanarak nm. Her su örneği 600 nm ve kayıt okumak sonuçları.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Belirlenmesi V. cholerae CFU/mL enfeksiyon sonra atılır. Not: Zebra balığı tarafından üretilen ishal önemli bir bileşeni atılır V. cholerae. CFU/mL belirlenmesi bakteriyel çoğaltma balık bağırsak ve bulaşıcı bir doz iletim deneylerde bir ölçüsü olarak tahmin etme gibi amaçlar için kullanılabilir. Geçici bir enfeksiyon gerçekleştiğinde bu ölçü en iyi yapılır. 24 h enfeksiyon kullandıysanız, bu tahlil kombine inoculum artı atılan V. choleraeölçecektir.<ol>
<li>Su örneği istenen saat noktada al ve seri olarak daha önce açıklandığı gibi sulandırmak.</li>
		<li>Seçmeli medya (streptomisin veya başka bir uygun antibiyotik veya DLC'ler içeren LB agar) seri dilutions plaka ve onları 24 h 30 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Kolonilerin sayımı. CFU mL su başına 1.5 adımda anlatıldığı gibi hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera.">Cholera.</a> The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).</li><li>Dutta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+non-O1,+non-O139+serogroups+and+cholera-like+diarrhea,+Kolkata,+India.">Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).</li><li>Huq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+relationships+between+Vibrio+cholerae+and+planktonic+crustacean+copepods.">Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).</li><li>Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturable+and+VBNC+Vibrio+cholerae:+interactions+with+chironomid+egg+masses+and+their+bacterial+population.">Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population.</a> Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).</li><li>Broza, M., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+reservoirs.+Chironomid+egg+masses+and+Vibrio+cholerae.">Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae.</a> Nature. 412 (6842), 40 (2001).</li><li>Halpern, M., Izhaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+as+hosts+of+Vibrio+cholerae.">Fish as hosts of Vibrio cholerae.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).</li><li>Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+as+reservoirs+and+vectors+of+Vibrio+cholerae.">Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).</li><li>Traore, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Vibrio+cholerae+in+fish+and+water+from+a+reservoir+and+a+neighboring+channel+in+Ouagadougou,+Burkina+Faso.">Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso.</a> The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).</li><li>Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Vibrio+cholerae+non-01+from+a+Somerset+farmworker+and+his+tropical+fish+tank.">Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank.</a> Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).</li><li>Torres-Vitela, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+Vibrio+cholerae+in+fresh+fish+and+ceviche+in+Guadalajara,+Mexico.">Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico.</a> Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).</li><li>Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+zoonotic+aquatic+pathogens.">Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).</li><li>Runft, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+natural+host+model+for+Vibrio+cholerae+colonization+and+transmission.">Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).</li><li>Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Vibrio+cholerae+enterotoxicity+in+a+zebrafish+infection+model.">Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Klose, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suckling+mouse+model+of+cholera.">The suckling mouse model of cholera.</a> Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).</li><li>Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn, H., Sprinz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+with+Vibrio+cholerae+in+the+ligated+loop+of+the+rabbit+intestine.">Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine.</a> British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).</li><li>Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diarrhea+and+accumulation+of+intestinal+fluid+in+infant+rabbits+infected+with+Vibrio+cholerae+in+an+isolated+jejunal+segment.">Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment.</a> The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).</li><li>Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+adult+rabbit+model+for+Vibrio+cholerae+and+enterotoxigenic+Escherichia+coli+diarrhea.">Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea.</a> Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).</li><li>Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+studying+cholera+pathogenesis+using+infant+rabbits.">Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li><li>Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+acid-Schiff's+reagent+assay+for+carbohydrates+in+a+microtiter+plate+format.">Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).</li><li>Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+non+O1,+non+O139+Vibrios+isolated+from+fresh+water+bodies+in+Vellore,+south+India.">Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India.</a> Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).</li><li>Hasan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontoxigenic+Vibrio+cholerae+non-O1/O139+isolate+from+a+case+of+human+gastroenteritis+in+the+U.S.+Gulf+Coast.">Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Zebra balığı V. cholerae çalışmak için nispeten yeni bir model ama V. cholerae biyoloji Patogenez11,12,ve13 önceden bilinmeyen yönlerini gelecekteki keşfi için fazla söz sahibidir . Yetişkin zebra balığı modeli her iki doğal olmanın avantajı vardır sağlam, Olgun bağırsak microbiota ve çevresel bir modeli içeren V. cholerae ana bilgisayar. Dezavantajları modelinin iki önemli i...

Vibrio cholerae insan hastalık kolera gibi sporadik ishal1,2neden olan su, gram-negatif bir bakteridir. V. cholerae dünyanın çoğu diğer Sucul organizmalar ile ilgili birçok alanda ortamda bulunur. Bu ilişkilendirirken organizmaların plankton, böcek Yumurta kitleler, kabuklu deniz ürünleri ve omurgalı balık tür3,4,5,6,7içerir. Çeşitli çalışmalarda V. cholerae bağırsak yolları balık farklı coğrafi bölgelerin7,8,9,10' dan izole ettim. V. cholerae huzurunda balık balık bir çevre su deposu olarak hareket edebilir gösterir. Balık aynı zamanda insanlar için hastalık verici ve V. cholerae suşları6/ coğrafi yayılmasında karıştığı.
V. cholerae balık ile nasıl etkileşim kurduğu daha iyi anlamak için Danio rerio, daha çok bilinen adıyla zebra balığı, Kolera V.e11eğitim için bir model sistem olarak geliştirilmiştir. Zebra balığı V. choleraeerken rezervuarı düşünülmektedir Bengal Körfezi bölgesi dahil olmak üzere Güney Asya'ya yerli vardır. Kolera salgını başlayan ilk önce 1817 yılında, kolera şimdi Hindistan ve Bangladeş ne dışında bildirildi değil. Bu nedenle, zebra balığı ve V. cholerae neredeyse kesin birbirleriyle evrimsel zaman ölçekler üzerinde düşündüren o zebra balığı doğal çevre12 V. cholerae konukçuda ilişkili.
V. cholerae zebra balığı model yürütmek basit ve patojenik tüm çalışma için kullanılan V. cholerae yaşam döngüsü. Balık V. cholerae için V. cholerae, bilinen bir dizi ile aşılanmış su yıkanan tarafından sunulur. Bir kaç saat içinde bağırsak kolonizasyon gerçekleşir, ishal üretim tarafından takip. İshal müsin, proteinler, atılan bakteri ve diğer bağırsak içeriği oluşur. İshal derecesini birkaç basit ölçüler13kullanarak sayılabilir. Atılır tarafından enfekte balık V. cholerae sonra saf balık, bulaştırmak için bulaşıcı döngüsü tamamlanıyor devam edebilirsiniz. Bu nedenle, zebra balığı modeli V. cholerae insan hastalık süreci12,14beyannamedir.
En sık kullanılan V. cholerae hayvan modelleri tarihsel olarak fare ve tavşan14,15,16,17,18olmuştur. Bu modeller V. cholerae patogenezi bilgimizi ekleme vesile olmuştur. Ancak, fare ve tavşan doğal V. cholerae olmadığı için ana bilgisayarlar, V. cholerae yaşam döngüsü ne yönlerini okudu sınırlamalar vardır. Fare ve tavşan V. cholerae kolonizasyon genellikle bağırsak microbiota ya da bağırsak microbiota zarar antibiyotiklerle Önarıtma gerektirir. Her iki model de sonda ile besleme bakteriler sindirim için tanıtmak ya da doğrudan bakterilerin bağırsak enjekte etmek için cerrahi işleme gerektirir. Zebra balığı bir avantajımız yetişkin balık ile sağlam bir bağırsak microbiota kolayca kolonize ve bulaşıcı süreç doğal olarak, gerekli herhangi bir manipülasyon olur.
Mevcut çalışma zebra balığı kullanımı model V. cholerae enfeksiyon olarak gösterir. Enfeksiyon, diseksiyon, sömürgeleşme V. choleraenumaralandırılmasına ve V. cholerae tarafından neden olduğu ishal miktar açıklanan12,13olacaktır. Bu model V. cholerae hastalık süreci ve V. cholerae çevre yaşam tarzı ilgilenen bilim adamları için yararlı olması muhtemeldir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td><td>Excella E25</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>NUAIRE, Plymouth, MN</td><td>Auto Flow</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>Geaesys 6</td><td></td></tr><tr><td>Vortex homogenizer</td><td>Minibeadbeater24</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Machine</td><td>Ohaus, Columbia, MD</td><td>Adventurer Pro</td><td></td></tr><tr><td>Heat Stirer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Burner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated colony counter</td><td>REVSCI</td><td>120417B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>400 ml glass beakers</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perforated lids</td><td>Microtip holder with holes from tip box</td><td></td><td></td></tr><tr><td>disposable plastic spoons</td><td>Office Depot, Boca Raton, FL</td><td>D15-25-7008</td><td></td></tr><tr><td>Fish Tank System</td><td>Aquaneering, San Diego, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RO Water Purifier</td><td>Aqua FX</td><td>TK001</td><td></td></tr><tr><td>Fish net</td><td>Marina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fish food</td><td>Tetra fin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brine Shrimp</td><td>Red jungle brand</td><td>O.S.I. pro 80</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>10000-10</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>15000-11</td><td></td></tr><tr><td>2 ml screw cap tubes</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>02-681-375</td><td></td></tr><tr><td>1 mm glass beads</td><td>Bio Spec</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads for spreading</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>18406-500G</td><td></td></tr><tr><td>Petri plate</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml centrifuge tube</td><td>Midsci, Valley Park, MO</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tube</td><td>Corning Falcon, Corning, NY</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Test tubes</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pipette</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>13675K</td><td></td></tr><tr><td>Micro pipettes</td><td>Sartorius Biohit, G&amp;ouml;ttingen, Germany</td><td>m1000/m200/m20</td><td></td></tr><tr><td>Tips</td><td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td><td>24-150RS/24-412</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>VWR Life Science, Radnor, PA</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>10651745001</td><td></td></tr><tr><td>Schiff&amp;rsquo;s reagent</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>84655-250 mL</td><td></td></tr><tr><td>periodic acid</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>10450-60-9</td><td></td></tr><tr><td>Mucin from porcine stomach</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>M2378-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>9046-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660nm Protein Assay Reagent</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LB medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Teast Extract</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NACL</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>TCBS Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>265020</td><td></td></tr><tr><td>DCLS Agar</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>70135-500gm</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft office</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying vibrio cholerae colonization and diarrhea in the adult zebrafish model

Vibrio cholerae koleraya insan hastalığı bulaşıcı ajan olarak tanınmaktadır. İnsan konukçu dışında V. cholerae nerede yüksek sucul türler çeşitli ile etkileşim su ortamında öncelikle bulunmaktadır. Omurgalı balık çevresel bir ev sahibi olmak bilinir ve bir potansiyel V. cholerae rezervuar doğada bulunur. V. cholerae ve zebra balığı bilinen teleost balık türlerinin Danio rerio, Hindistan, sucul ortamlarda uzun zamandır devam eden bir etkileşim düşündüren kaynaklanır. Zebra balığı biyoloji, bulaşıcı hastalıklar da dahil olmak üzere birçok açıdan eğitim için ideal modeli organizma vardır. Zebra balığı kolayca ve hızla V. cholerae tarafından suya maruz kaldıktan sonra kolonize. V. cholerae tarafından bağırsak kolonizasyon ishal üretimi ve çoğaltılmış V. choleraeatılımı yol açar. Bunlar bakteri can atılır sonra yeni balık ana kolonize etmek devam. Burada, biz V. choleraedeğerlendirmek nasıl göstermek-zebra balığı ve nasıl V. choleraeölçmek için bağırsak kolonizasyon-zebra balığı ishal indüklenen. Kolonizasyon modeli olup olmadığını genler ilgi için ana bilgisayar kolonizasyon ve/veya çevresel hayatta kalmak için önemli olabilir okuyan araştırmacılar için yararlı olmalıdır. Zebra balığı ishal miktar zebra balığı bir modeli sistem olarak keşfetmek ilgilenen herhangi bir bağırsak patojen eğitim araştırmacılar için yararlı olmalıdır.

V. cholerae kolonizasyon in zebra balığı bağırsak arazi
Örnek olarak biz gözlemlemek tipik kolonizasyon düzeyleri sağlamak için 5 x 106 200 mL su birkaç zebra balığı içeren bir ölçek içinde pandemi EL Tor V. cholerae zorlanma N16961 CFU aşılandı. Enfeksiyon 6 h sonra balık tatlı suda yıkanmış ve 200 mL iletişim kuralında tanımlandığı gibi autoclaved enfeksiyon su kabı i?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model at JoVE.com

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebra balığı vardır doğal Vibrio cholerae ev sahipliği ve özetlemek ve iletim tüm bulaşıcı döngüsüne kolonizasyon üzerinden çalışma için kullanılabilir. Burada, V. cholerae kolonizasyon düzeylerini değerlendirmek ve ishal içinde zebra balığı ölçmek nasıl gösterir.

Vibrio cholerae kolonizasyon ve ishal yetişkin zebra balığı modelindeki miktarının

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

8.3K Görüntüleme.  Wayne State University School of Medicine. Zebra balığı vardır doğal Vibrio cholerae ev sahipliği ve özetlemek ve iletim tüm bulaşıcı döngüsüne kolonizasyon üzerinden çalışma için kullanılabilir. Burada, V. cholerae kolonizasyon düzeylerini değerlendirmek ve ishal içinde zebra balığı ölçmek nasıl gösterir.

Video: Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

Clostridioides difficile için Larva Zebrabalığı Enfeksiyon Modeli nin Geliştirilmesi

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Gelişim Biyolojisi

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

GF Zebra Balığı Modellerinin Optimize Edilmesi: Üretim, Bakım ve Mikrobiyal Çalışmalar

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

Yazar Spotlight: Mikrobiyota-Konak İlişkisi Çalışmaları için Mikropsuz Zebra Balığı Oluşturma

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water environment. Developing effective methods for oral delivery of immunostimulants or vaccines, which activate the immune system against infectious diseases, is highly desirable. In devising prophylactic tools, good experimental models are needed to test their performance. Here, we show a method for oral intubation of adult zebrafish and a set of procedures to dissect and prepare the intestine for cytometry, confocal microscopy and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis. With this protocol, we can precisely administer volumes up to 50 &#181;L to fish weighing approximately 1 g simply and quickly, without harming the animals. This method allows us to explore the direct in vivo uptake of fluorescently labelled compounds by the intestinal mucosa and the immunomodulatory capacity of such biologics at the local site after intubation. By combining downstream methods such as flow cytometry, histology, qPCR and confocal microscopy of the intestinal tissue, we can understand how immunostimulants or vaccines are able to cross the intestinal mucosal barriers, pass through the lamina propria, and reach the muscle, exerting an effect on the intestinal mucosal immune system. The model could be used to test candidate oral prophylactics and delivery systems or the local effect of any orally administered bioactive compound.

The protocol describes intubating adult zebrafish with a biologic; then dissecting and preparing the intestine for cytometry, confocal microscopy and qPCR. This method allows administration of bioactive compounds to monitor intestinal uptake and the local immune stimulus evoked. It&#160;is relevant for testing the intestinal dynamics of oral prophylactics.

Vibrio cholerae kolonizasyon ve ishal yetişkin zebra balığı modelindeki miktarının

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kullanımı

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve

Clostridioides difficile için Larva Zebrabalığı Enfeksiyon Modeli nin Geliştirilmesi

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Yetişkin zebra balığı sözlü entübasyon: bağırsak alımını biyoaktif bileşiklerin değerlendirmek için bir Model