Mevcut işleri Sağlık (NIH) hibe HD043680, MH106392, DA013137 ve NS100624 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklendi. Kısmi Fonu Biyomedikal davranış bilimleri NIH T32 eğitim grant tarafından sağlandı.

Deneysel protokol hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) University of South Carolina tarafından kabul edildi (federal güvence numarası: A3049-01).
1. taze donmuş beyin bölümleri hazırlanması
<ol><li>F344/N sıçan zorlanma kullanın: her seks üç fareler 13 ay-in yaş, vücut ağırlığı yaklaşık 320 g.</li>
	<li>Sevoflurane konsantrasyonu % 5 (sevoflurane dozda) için ayarlayın. Sevoflurane maruz kalma durur bir dakika için nefes sonra devam.</li>
	<li>Fareyi başını kesmek ve beyin kaldırın.</li>
	<li>Sıçan beyin 15 için sıvı azot daldırın doku hasat 5 dk içinde s.</li>
	<li>-20 ° C'de 1 h için cryostat beyne equilibrate.</li>
	<li>30 µm bölümleri kesilmiş ve ( Tablo malzemelerigörmek) slaytlar aktarın.</li>
	<li>Nucleus accumbens bölgesinden yaklaşık 2,76 mm Bregma14anterior 2.28 mm bölümleri tercih.</li>
	<li>Sürekli dilim olfaktör ampul nucleus accumbens bölgeye göre fare stereotaksik beyin yapısı ile fare beyninden.</li>
	<li>Örnek slaytlar üzerine monte. -20 ° c kuru için 10 dakika için bölümleri tutmak.</li>
	<li>Hemen bırakın önceden soğutulmuş %4 paraformaldehyde 4 ° C'de 1 h için slaytları</li>
	<li>Oda sıcaklığında (RT) artan bir etanol degrade slaytlar yer: % 50 alkol 5 dakika; % 70 alkol 5 dakika; ve %100 5 min için alkol.</li>
	<li>Taze %100 ile tekrar alkol.</li>
	<li>Slaytlar emici kağıt üzerine yerleştirin ve kuru hava.</li>
	<li>Bir bariyer her bölümün bariyer kalemle çizin ( Tablo malzemelerigörmek). 1 dk. tamamen kuru bariyer izin.</li>
</ol>2. ön beyin bölümleri
<ol><li>Fırını ve 40 ° c sıcaklık ayarla</li>
	<li>3 damla (90 µL) Önarıtma 4 reaktif ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) her beyin bölümünde (slayt başına bir bölüm).</li>
	<li>30 dk RT. az için bölümleri kuluçkaya</li>
	<li>1 x PBS RT. tekrar ediyorum, 1 dk. için taze 1 x PBS ile slaytları daldırın. Not: 1 x PBS 15dk daha uzun süre içinde slayt kalmamalıdır.</li>
</ol>3. RNA In Situ hibridizasyon floresan Multiplex tahlil
<ol><li>Hedef sonda bir su banyosunda 40 ° C'de 10 dakika sıcak ve sonra RT için cool</li>
	<li>RNA reaktif yerleştirin (örneğin, Amp 1-4 FL), RT.</li>
	<li>Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>3 damla (90 µL) örnek dilim üzerinde Drd1α inceleyebilirsek (C1) ekleyin. 40 ° C'de 2 h için kuluçkaya</li>
	<li>Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.</li>
	<li>Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Amp 1-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Taze 1wash arabellek ile RT. tekrar 2 min için 1 yıkama tampon içindeki slaytları daldırın.</li>
	<li>Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Amp 2-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
	<li>Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.</li>
	<li>Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Amp 3-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Taze 1 yıkama arabellek x ile yıkama arabellek RT. tekrar 2 min için x 1 içindeki slaytları daldırın.</li>
	<li>Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Amp 4-FL-Alt A örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
	<li>Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.</li>
	<li>Aşırı sıvı slaytlardan kaldırmak ve hemen montaj reaktif 2 damla yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) her bölüme.</li>
	<li>22 mm 22 mm coverslip yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) her beyin bölümü üzerinde.</li>
	<li>Slaytları 2-8 ° C'de karanlık kadar kuru depolama.</li>
	<li>Confocal mikroskobunun açmak ve bir 60 X amaç için geçiş.</li>
	<li>Z-yığın görüntü confocal mikroskopla elde. Tamamlayıcı video confocal görüntüleme ayrıntılı yordam için bkz.</li>
	<li>Nucleus accumbens bölgedeki hücreler etiketli Drd1α görüntüleri (uyarma: 488 nm; Emisyon: 515/30 nm). Not: beyin bölümleri arasında kuluçka adımları kurumasına izin vermeyin.</li>
</ol>4. veri analizi
<ol><li>Boyama desen yarı kantitatif analiz: "ayrık noktalar".<ol>
<li>Görüntü tek hücre tanımlamak için DAPI nükleer bir işareti olarak boyama gerçekleştirmek. Ancak, birden çok türde hücre çekirdeği ve/veya hücreler düzensiz şekli ile olduğundan beyin doku bazı kısımlarını çözümlemek hala zordur. Burada, iki deneyimli araştırmacılar hücre bölgesi tanımlamak için görüntülerden her hücre ayrı olarak atayın.</li>
		<li>Görsel olarak her hücre içinde belirli bir ölçüte uyan (şekil 1B) kullanarak hücre başına nokta sayısını temel alan temsilcisi confocal görüntüleri puan.</li>
		<li>Her kategoride toplam cep numarasını belirlemek ve tüm doku bölümlerin (şekil 2A) hem kadın ve erkek için her kategori içindeki hücreleri yüzde frekans görüntüleyen göreli sıklığı grafikler oluşturmak için toplam hücresini sayı x100 bölmek ayrı ayrı (şekil 2E).</li>
		<li>Tüm önceden kategoriler içinde hücrelerin toplamı ayrı ayrı hücreleri tüm doku bölümlerin (şekil 2B) ve kadın ve erkek için toplu sıklığını belirlemek için toplam hücresini sayıya x100 bölme (şekil 2F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>"Ayrık noktalar desen (isteğe bağlı) boyama" istatistiksel analiz.<ol>
<li>Sıralı (Yani, her rütbe en düşük hücre ifade (1) yüksek hücre ifadesi (9) kategoriye dahil hücre sayısı) doğada kategorik bir değişken sağlamak için hücre başına nokta sayısını inceleyin daha da İstatistiksel analizler için.</li>
		<li>Tanımlayıcı istatistik muayene sonrasında, üç ana yaklaşım kullanın: bir şömine-Haenszel istatistik, Mann-Whitney U testi ve Kruskal-Wallis testi. Kesin istatistiksel yaklaşım üzerine bağlı olacaktır, ancak faiz, istatistiksel karar ağacı (şekil 4) deneysel tasarım ve araştırma sorusu bir analitik yaklaşım ile ilgili kararların alınmasında yardımcı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desen boyama için sinyal şiddeti faiz (ROI) bölgesinde ölçmek: "kümeler".<ol>
<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak her görüntü sinyali yoğunluğunu hesaplamak: Sinyal şiddeti toplam yatırım Getirisi görüntü - (ortalama arka plan yoğunluğu × Toplam görüntü alanını) yoğunluğu =</li>
		<li>Toplam hücre başına yaklaşık sinyal ifade hesaplamak için yatırım Getirisi görüntü içindeki hücreleri saymak. Sinyal şiddeti/resim hem de hücreleri/resim sayısı grup farklılıkları sinyal ifade/hücrede görülen grup farklılıklara katkıda bulunabilir mekanizmaları dikkate ilgi olabilir (şekil 3B-3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>"Desen (isteğe bağlı) Boyama kümeleri" istatistiksel analiz.<ol>
<li>Daha fazla istatistiksel analiz için bir sürekli değişken sağlamak için sinyal ifade/hücre inceleyin. Kullanım tasarımında bir bağımsız örnek t-Testi ve konular arasındaki faktörler sayısına göre Varyans analizi (ANOVA), dahil olmak üzere iki yaklaşım dahil. İstatistiksel karar ağacı (şekil 4) en uygun istatistiksel yaklaşım ile ilgili kararların alınmasında yardımcı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia:+insights+for+cognitive+dysfunction.">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li><li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology,+signaling,+and+pharmacology+of+dopamine+receptors.">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li><li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance.">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li><li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting.">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li><li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia.">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li><li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition:+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex.">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li><li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance.">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li><li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats.">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li><li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia.">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li><li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice.">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).</li></ol>

Hiçbir bildirmek için çıkar çatışması vardır.

Bu protokol için in situ hibridizasyon nucleus accumbens (NAc) Drd1α reseptör ifade ve tirozin hidroksilaz (TH) ifade gözlemliyorum nigra (SNR) bölgesinde değerlendirmek için taze donmuş beyin dilimler için roman tekniği tarif. Ayrıca farklı boyama desenleri için veri analizi yöntemleri sağlar: "ayrı nokta" veya "kümeler".
Başarılı multiplex Floresans RNA in situ hibridizasyon tahlil için kritik adımlar dahil edilir. Don sıçan decapitating ve beyin, ka...

Disfonksiyon striatal dopamin sisteminin birden çok nörobilişsel hastalıklarda gözlenen klinik belirtiler ilerlemesini ilgilenmektedir. Dopamin D1 reseptörleri prefrontal korteks (PFC) ve beynin striatal bölgeler varsa ve Bilişsel süreçler1bellek, zamansal işleme ve lokomotif davranış2,3 çalışmak dahil olmak üzere, ağır etkisi , 4 , 5 , 6 , 7. önceki çalışmalar aydınlatılmamıştır değişiklikleri reseptörlerinin dopamin D1 ilerlemesini dikkat eksikliği-hiperaktivite bozukluğu (DEHB)8, şizofreni9, nörobilişsel belirtiler ile ilişkili bulunmuştur 10 ve stres duyarlılık11. Özellikle, şizofreni, Pozitron emisyon tomografisi (PET) çalışmalar dopamin D1 reseptörleri prefrontal cortices bağlama yeteneği son derece bilişsel açıkları ve negatif belirtiler11varlığı ile ilgili belirtti. D1 dopamin reseptör tarafından düzenlenir prefrontal korteks eksitatör nöronlar dendritik büyüme stres duyarlılık azaltır. Ayrıca, D1 reseptör medial prefrontal kortikal (mPFC) nöronlar içinde nakavt sosyal yenilgi sosyal kaçınma stres kaynaklı12geliştirmek.
Burada, tek RNA molekülleri ile taze donmuş doku örneklerini bir hücre görselleştirmek için RNA in situ hibridizasyon roman tekniği tanıtmak. Mevcut teknik içinde geçerli edebiyat mevcut yöntemleri üzerinde birden çok avantajları vardır. İlk olarak, geçerli yordam doku kayma ve morfolojik bağlamında korur ve böylece taze gerektiren diğer yordamlar, gömülü olmayan doku geçerli yöntemleri ile kombine taze donmuş doku örnekleri üzerinde gerçekleştirildi. Formalin sabit ve parafin gömülü dokularda benzer yordamlar tek transkripsiyon çözünürlük bir RNA in situ hibridizasyon tekniği13kullanılarak elde edilebilir gösterildiği. RNA tek transkripsiyon düzeyinde algılanması üstün hassasiyet düşük kopya numara ifadesi hem de diğer nükleik asit algılama yöntemlerle elde tek tek hücre düzeyinde gen ekspresyonu karşılaştırmak için fırsat sağlar, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknikleri gibi. Ayrıca, geçerli yöntem için tek hedef RNA transkript melezleşmiştir ve sıralı olarak algılama sinyali amplifikasyon molekülleri bir çağlayan ile bağlı çok özel RNA probları ile imge ile yüksek sinyal gürültü oranı korur sistem. Son olarak, günümüz teknolojisi soruşturmamız için yalnızca bir sınıf sistemi ile ilgili işaretleri tarafından protein algılaması gibi sınırlama yerine onun hedef özgü özel probları ile birden çok biyolojik sistemleri değerlendirmek için fırsat sağlar immünhistokimya yöntemleri.
Bizim çalışmada, biz bu roman RNA in situ hibridizasyon nucleus accumbens (NAc) Drd1α reseptör ifade ve gözlemliyorum nigra (SNR) tirozin hidroksilaz (TH) ifadesinde değerlendirmek için her ikisi erkek ve dişi F344/N fareler kullandık. Yenilikçi RNA in situ hibridizasyon DA alımı ve DA yayın aynı anda etkileyen, striatal DA sistemin karmaşıklığı anlayışımızı geliştirmek mekanizmaları incelemek için bize etkin. Taze donmuş beyin dilimler ve veri analiz yöntemleri farklı boyama desenleri için sağlamak için burada, biz açıklayınız: "ayrı nokta" veya "kümeler".

<table><tbody><tr><td>HybEZ Oven system</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>310010</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Probe - Rn-Drd1a</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>317031</td><td>Color channel 1, Green</td></tr><tr><td>RNAscope Probe - Rn-Th-C2</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>314651-C2</td><td>Color channel 2, Orange</td></tr><tr><td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek vertical 24 slide rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek staining dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>Precision General Purpose Baths</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>Pretreatment 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>ProLong Gold anti-fade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Amp 1-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 2-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 3-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 4-FL-Alt A</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>EZ-C1 software package</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>version 3.81b</td></tr><tr><td>SAS/STAT Software</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td><td>version 9.4</td></tr></tbody></table>

identification of dopamine d1-alpha receptor within rodent nucleus accumbens by an innovative rna in situ detection technology

Merkezi sinir sistemi nöronal büyüme ve gelişme düzenlenmesinde önemli bir rol oynar en bol (DA) dopamin reseptör D1-Alfa alt türü reseptör (Drd1α) olduğunu. Ancak, davranışsal yanıt arabuluculuk ve çalışma bellek işlevi modülasyonlu Drd1α reseptör anormallikler temel mekanizmaları hala pek açık değildir. Bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil kullanarak, geçerli çalışma Drd1α dopamin reseptör ve tirozin hidroksilaz (TH) RNA ifadeden DA ilgili devre nucleus accumbens (NAc) alan ve gözlemliyorum nigra bölgesinde (SNR), tespit anılan sıraya göre. Kak Drd1α ifadede "ayrı nokta deseni boyama" gösterir. Drd1α ifade açık cinsiyet farklılıkları tespit edildi. Buna ek olarak, TH "kümelenmiş" boyama desen gösterir. TH ifade ile ilgili dişi rats erkek hayvanlar göreli hücre başına daha yüksek bir sinyal ifadesi görüntülenir. Burada sunulan yöntemleri bir roman situ hibridizasyon Teknik Merkezi sinir sistemi hastalıkları ilerleme sırasında dopamin sistem disfonksiyon değişimler soruşturma için sağlar.

Çalışmada "(şekil 1A) F344/N Sıçanlarda NAC desen dopamin D1-Alfa reseptörleri (Drd1α) RNA ifade için boyama bir ayrık noktalar" görülmektedir. Bireysel Floresans sinyalleri kolayca tespit edilmiştir ve görülebilir tek "nokta," her biri tek bir RNA transkript hücre içinde temsil eder. "Ayrık noktalar desen boyama" ekran görüntüleri için Kak, ifade yarı kantitatif analiz (şekil 1A, şek...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology at JoVE.com

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Dopamin D1-Alfa reseptör kemirgen Nucleus Accumbens bir yenilikçi RNA Situ içinde hafiye teknoloji tarafından içinde tanımlaması

Dopamin D1-Alfa reseptör nucleus accumbens tanımlaması D1 reseptör disfonksiyonu bir merkezi sinir sistemi hastalığı sırasında açıklığa kavuşturulması için önemlidir. Biz bir belirli beyin bölgesinde tek RNA molekülleri görselleştirmek için bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil yapılır.

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

identification-dopamine-d1-alpha-receptor-within-rodent-nucleus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

8.5K Görüntüleme.  University of South Carolina. Dopamin D1-Alfa reseptör nucleus accumbens tanımlaması D1 reseptör disfonksiyonu bir merkezi sinir sistemi hastalığı sırasında açıklığa kavuşturulması için önemlidir. Biz bir belirli beyin bölgesinde tek RNA molekülleri görselleştirmek için bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil yapılır.

Video: Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Substantia nigra ve ventral Tegmental Bölgesi Dopamin Yönetmelik Kapsamlı Profilleme

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Nörobilim

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Çabuk<em&gt; In Situ</emSerotonin Sendromu ile Ratlarda Paraformaldehyde-öneki Beyin oligonükleotid Problar kullanarak&gt; Melezleme

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased stereological counting is the standard for quantification of these cells, but it remains a laborious and time-consuming process, which may not be feasible for all projects. Here, we describe the use of an image analysis platform, which can accurately estimate the quantity of labeled cells in a pre-defined region of interest. We describe a step-by-step protocol for this method of analysis in rat brain and demonstrate it can identify a significant reduction in tyrosine hydroxylase positive neurons due to expression of mutant &#945;-synuclein in the substantia nigra. We validated this methodology by comparing with results obtained by unbiased stereology. Taken together, this method provides a time-efficient and accurate process for detecting changes in dopaminergic neuron number, and thus is suitable for efficient determination of the effect of interventions on cell survival.

Here we present an automated method for semi-quantitative determination of dopaminergic neuron number in the rat substantia nigra pars compacta.

Otomatik Görüntü Analizi Kullanılarak Kemirgen Modellerinin Substantia Nigra'sında Dopaminerjik Nöron Yoğunluğunun Yarı Nicel Belirlenmesi

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Biyoloji

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Monitoring Dopamine Release in a Rat Model with VTA Dopaminergic Neuron Receptor Manipulation

Source: Wickham, R. J., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60886">Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates the implantation of electrodes and cannulas in an anesthetized rat to measure dopamine release in the nucleus accumbens using a potentiostat and the infusion of drugs to modulate dopaminergic activity in the ventral tegmental area.

VTA Dopaminerjik Nöron Reseptör Manipülasyonu ile Bir Sıçan Modelinde Dopamin Salınımının İzlenmesi

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Dopamin D1-Alfa reseptör kemirgen Nucleus Accumbens bir yenilikçi RNA Situ içinde hafiye teknoloji tarafından içinde tanımlaması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler