Biz Paul O'Brien, Marizel Mina ve Isabella Freedman hayvan deneyleri için Jacquie Gonzalez ve Danielle Weiner NIH/NIAID dan önce lazer yakalama mikrodiseksiyon ve Jansy Sarathy tavşan doku el yazması için gama ışınlama ile yardım için teşekkür düşünce ve tavsiye. Bu eser Bill'den fon tarafından desteklendi ve Melinda Gates Vakfı (OPP1174780) ve paylaşılan NIH araçları 1S10OD018072 verin. Eliseo A. Eugenin Leica LMD 6500 mikroskop erişim sağlayan ve uzmanlık ve tavsiye paylaşımı için teşekkür ederiz. Satın alma ve devam eden desteğiyle LMD 6500 Ulusal Enstitüsü ruh sağlığı grant, MH096625, sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur, NS105584, PHRI (E.A.E) finansman ve GSK katkılar (E.A.E) tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan çalışmaları doğrultusunda Kılavuzu bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri ile kurumsal hayvan bakım onayını ve kullanım Komitesi, NIAID (NIH), Bethesda, MD için yapılmıştır
1. hayvan deneyleri ve doku koleksiyonu
Bu bölümde Protokolü'nün hayvan yordamlar ve örnek koleksiyon Biyogüvenlik seviye 3 (BSL3) koşullar altında açıklanmaktadır. Protokol tavşanların Mycobacterium tüberküloz aerosol enfeksiyon yordam ve İlaç İdaresi detaylı iletişim kuralları daha önce açıklanan11,12.
<ol><li>Yeni Zelanda beyaz tavşan (erkek ve kadın, 4-5 aylık) M. tuberculosis HN878 ile enfekte bir salt burun aerosol sistemi kullanarak, daha önce açıklanan11.</li>
	<li>Seçilen ilaçlar (burada sunulan örnekte etambutol) tercih edilen rota yönetmek ve hayvanlar 2, 6 ve 24 h yönetim takip ötenazi. İlk olarak, tavşan tarafından ketamin 5 mg/kg kas içi enjeksiyon 35 mg/kg ve Xylazine anestezi. 10 dakika bekleyin ve doğru anesthetization kuyruk pinching ve yavaşça göz dokunmadan onaylayın. Herhangi bir tepki ise, Fentobarbital ve fenitoin ( Tablo malzemelerigörmek) intravenöz yönetimi tarafından 1 mL/4.5 kg 2 mL steril serum fizyolojik içinde ötenazi. Not: Bu timepoints farmakokinetik profil etambutol için karşılamak için en iyi durumda ve ayarlama/diğer çalışma uyuşturucu için en iyi duruma getirme gerektirebilir.</li>
	<li>Pens, makas ve/veya skalpel kullanarak, akciğerler göğüs boşluğundan Kaldır, akciğer biyopsisi (3daha önce açıklandığı gibi) ilişki kurmadan Akciğer doku çevreleyen gömülü büyük nekrotik granülomlar içeren çıkarabileceğim. Nekrotik granülomlar görünür içinde bej renk ve genellikle biraz çıkıntı çevreleyen kırmızı/pembe renkli akciğer. Kolay cryosectioning kolaylaştırmak için biyopsiler 2 x 1.5 x 1,5 cm büyük olduğundan emin olun.</li>
	<li>Forseps kullanarak, önceden etiketli cryomold tepsi istenen kesme yüzeyi üzerine biyopsi tepsiyi Bankası ile doğrudan temas yerleştirin. Sonra dondurma, bu hangi cryosections keserim düz bir yüzey sağlar.</li>
	<li>Sıvı azot buharı biyopsiyi durdur. Bir styrofoam konteyner 2 inç derinliğe kadar sıvı azot ile doldurun ve bir metal tel tüp rafa yerleştirin. Raf düz bir yüzey üzerinde doku tepsiler yerleştirilir sağlayan sıvı azot yüzeyi üzerinde çıkıntı. Kapağı geri styrofoam konteyner üzerinde yerleştirin ve dokuları tam olarak dondurmak 10 dakika bırakın.</li>
	<li>Doku tepsileri kaldırın, hızlı bir şekilde alüminyum filmde sarın ve tek tek resealable plastik torbalar ve mühür etiketli yerleştirin. -80 ° C dondurucu depolama için transfer. Not: Adımlar 1.1-1.6 (tüm hayvan iş de dahil olmak üzere ve hastalıklı organ ve dokulara işleme) BSL3 koşullarda gerçekleştirilir. Gama ışınlatayım BSL3 kapsama dışında işlemeyi etkinleştirmek IÇIN 3 Megarads, akciğer biyopsisi. Lazer yakalama mikrodiseksiyon unsterilized doku üzerinde güvenlik protokollerini onaylandığı takdirde tesis kilometresi BLS3 içinde gerçekleştirilebilir. Ancak, bu iletişim kuralını kalan BSL-2 tesiste aşağı akım işleme açıklar.</li>
</ol>2. doku kesit
<ol><li>Cryostat istenen kesme sıcaklık ayarlayın. Gama radyasyona maruz akciğer biyopsisi için cryostat-80 ° C depolama ortamından aktarmak ve doku sıcaklık equilibrate 30 dakika bekletin. Not:-22 ° C-20-TB Lezyondan biyopsi için en uygunudur.</li>
	<li>Cımbız kullanarak, Chuck doku Bankası bağlı kalmak için en uygun kesme sıcaklık yapıştırıcı (OCT) küçük bir miktar kullanarak cryostat Chuck biyopsi düzeltmek. Doku (yani cryomold Bankası ile temas oldu) düz yüzey kesme maruz yüzeydir gelecek şekilde yönlendirin. Bu sonraki kütle spektrometresi analizi ile girişime neden olabilir gibi OKT doku yüzeyi kontamine değil emin olun.</li>
	<li>Üç doku bölüm 25 µm kalınlık, kesme ve evde beslenen hayvan membran slaytlar monte. Yavaşça membran doku bölümüne dokunma ve kaldırın. Çok fazla baskı uygulanırsa, ince zar gözyaşı.<ol>
<li>Bu şarj edilmiş ve zavallı yapışma doku bölümlerin olma evde beslenen hayvan membran yol açar gibi montaj öncesinde slaytlar aşırı kullanımı önlemek. Membran slayt tezcan-montaj ve başarılı yapışma doku membran için etkinleştirmek için oda sıcaklığında tutulur emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slayt cryostat kaldırmak ve 3 dakika kurumasını bekleyin. LCM-LC/MS/MS hemen gerçekleştirilmez, slayt küçük hava geçirmez yapışmalı çanta ve diseksiyon için gerekli kadar-80 ° C depolama birimine transfer kapatın.</li>
	<li>10-12 µm ve tezcan-mount Hematoksilen ve Eozin (H & E) Boyama ve referans için standart cam slayt üzerindeki bitişik bir bölüm kesmek. Ek bölümler (Mycobacterium tüberküloz (MTB) görüntülenmesi için Ziehl-Niellsen gibi) diğer istenen histochemistry lekeler için şu anda kesebilir.</li>
</ol>3. mikrodiseksiyon
<ol><li>-80 ° C depolama slayt içeren mühürlü torba kaldırmak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ulaşmak için izin verir. Not: soğuk slayt hemen laboratuvar atmosfer yararlanılır, doku yoğunlaşma ile kaplı olmak ve ilaç kayma bütünlüğünü tehlikeye olabilir.</li>
	<li>Mikroskop ve lazer açın (kesme başlamak önce lazer 5-10 dakika kadar sıcak gerektirir). Düz-cap 0.20 mL PCR tüpleri yuvasına yükleyin.</li>
	<li>Slayt çantasından çıkarın ve Düz Yataklı Tarayıcı kullanarak evde beslenen hayvan slayt üzerinde doku bölümünün bir optik görüntü al.</li>
	<li>Slayt Slayt tutucusuna (doku yüzü aşağı bakacak şekilde) koyun ve ayrı toplama tüpler istimal mikroskop bilgisayar yazılımı ilgi belirli Granülom bölgelerine atayabilirsiniz. Genellikle, bunlar-ecek var olmak 'ilişki kurmadan akciğer,' 'hücresel Granülomu,' ve 'caseum' (nekrotik Merkez), ama olabilir Granülom/biyopsi belirli patoloji bağlı olarak değişir.</li>
	<li>5 X mikroskop objektif kullanarak doku odaklanmak. Bu büyütme dokusu hem hücresel ve nekrotik Granülom alanları içeren iyi bir bakış sağlamak. Yazılımda konum'un altında doku içine taşımak için 'caseum' belirlenmiş tüp seçin.</li>
	<li>İstenen diseksiyon parametrelerini girin. Lazer güç 30, hız 15 ve diyafram 35 (rasgele adet) 25 µm kalınlığında akciğer bölüm için tipik ayarlarıdır. Ancak, bunlar kullanılan mikroskop ve güç lazer yaş nedeniyle azalan potansiyel bağlı olarak farklı olacaktır.</li>
	<li>'Ücretsiz-beraberlik' aracını seçin ve bir fare veya dokunmatik ekran kalemi kullanarak, istenilen bölge diseksiyon için anahat. Bölgesinin yüzey alanı-ecek var olmak göstermek içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı. Seçili bölgeler daha kolay diseksiyon kolaylaştırmak için 500.000 µm2 (0,5 mm2) altında tutun. Tüp şapkalı toplam 3 milyon µm2 (3 mm2) toplanan kadar diseksiyon yineleyin.<ol>
<li>Bazı durumlarda, disseke bölge (örneğin statik cazibe) nedeniyle çevredeki membran için takılıp kalır ve koleksiyon kap düşmek değil. Bu bölgeler seçerek ve el ile kaldırma yazılım içinde toplu yüzey alanındaki toplam silin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cap 'hücresel lezyon' için seçin ve 3 milyon µm2 adım 3.7 belirtildiği gibi aynı işlem kullanılarak doku toplamak.</li>
	<li>Cap 'ilişki kurmadan akciğer' için seçin ve 3 milyon µm2 adım 3.7 belirtildiği gibi aynı işlem kullanılarak doku toplamak. İlişki kurmadan Akciğer doku birçok bronchioles ve alveoler alanlarda içerdiğini unutmayın. Bunlar diseksiyon için tanımlanmış doku bölgelerden dışlamak için dikkat.</li>
	<li>Kapak Tutucu kaldırmak ve dikkatle Açıl, mühür ve her tüpün etiket. Hava bozuklukları (gibi) hava akışı kesintileri bir açılış kapıdan itibaren çevreleyen disseke doku korumak. Disseke dokularda hemen, analiz veya-80 ° C'de depolayın ve önceden işleme ve LCMS analiz çözülme.</li>
</ol>4. çıkarma ve LCMS analizi
<ol><li>1:1 Asetonitril/metanol etambutol d-10 dahili standart içeren ayıklama çözüm hazırlamak. Bir iç standart seçerken, kullanım analit uyuşturucu etiketli formun kararlı bir izotop önlemek için yeterli yığın shift ile (döteryum etiketli EMB Bu gösteride kullanılan gibi) çapraz konuşma analit uyuşturucu ve standart (genellikle en az 4 Dalton) arasında . Not: çünkü çok sınırlı denetim doku homogenate standartları oluşturmak için ilgili doku türlerinin homogenate içinde standartları oluşturmak zordur. Standartları bir çivili homogenate örnek yapma alternatif olarak, bir standart boş doku ve test bileşik birlikte ve açılan ekleyerek oluşturulabilir. Hedef birimin çalışma örnek doku bölümler eşleştirir bir homogenate kontrol doku hacmi doğrudan verilen bir konsantrasyon mevcut olurdu test bileşik bir miktar ile birleştirilmiştir.</li>
	<li>Yüzey alanı ve doku bölümü kalınlığına göre hedeflenen doku hacmi hesaplamak ve standart ve QC örnekleri-ecek var olmak mülhak homogenate hacmi kullanarak homogenate için gerekli seyreltme faktörü belirlemek. Hesaplamalar aşağıda 3 milyon µm2 (3 mm2) disseke hedef alanı için bir 25 µm kalınlık ve homogenate hacmi 2 µL ile gösterilmiştir. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>1 g/mL, doku yoğunluğu varsayarak hazırlamak homogenate stok kontrol doku 50 mg ağırlığında ve sulandırmak için PBS arabellek ekleme (26.67 homogenate seyreltme faktörü kullanılarak hesaplanır adım 4.2, eritici 1.283 mL). Boncuk boncuk homogenizer 1750 devirde 5 dakika akciğer dokusu ve PBS arabellek yenerek tarafından lunaparkçı. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>1 mg/mL ilaç stokları konsantrasyonu 1:1 Asetonitril/su çözümleri spiking standart eğri oluşturmak için sulandırmak. Spike birim ve hedef doku birimi temel standart konsantrasyonları spiking belirlemek. Bir 100 ng/mL için bir 10 µL spike birim için standart resimli örnektir. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>-80 ° C depolama microdissected dokulardan içeren tüpler kaldırın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ulaşmak için izin.</li>
	<li>1:1 Asetonitril/su çözüm 10 µL ve PBS arabelleğinin 2 µL microdissected doku içeren tüpler ekleyin.</li>
	<li>Standart eğri ve kalite kontrol tüpleri için eriyik-e doğru kontrol akciğer homogenate 2 µL spiking 10 µL ekleyin.</li>
	<li>Ayıklama çözüm 50 µL her tüp için ekleyin.</li>
	<li>Girdap her tüpün 5 dakika, 5 dakika için solüsyon içeren temizleyicide ve Pelet film ve her tüpün doku oluşturmak için 5000 devirde 5 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>96-şey derin-şey plakasına süpernatant ile 50 µL aktarmak ve bir ek 50 µL her şey deiyonize su ile sulandırmak.</li>
	<li>Etambutol ve etambutol-d10 iç standart (daha önce ayrıntılı12' açıklandığı gibi) için en iyi duruma getirilmiş enstrüman parametrelerini kullanarak LC/MS/MS çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
	<li>Seyreltme faktörü her örnek için disseke doku miktarı için düzeltmek için kullanın. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. yöntemi doğrulama
<ol><li>Bir homogenate 1 Bölüm akciğer, 2 parça PBS ve 3-4 çelik boncuk birleştirerek denetim akciğer dokusunda oluşturun. Akciğer dokusu ve PBS arabellek 1750 devirde boncuk homogenizer kullanarak 5 dakika yendi.</li>
	<li>Homogenate 10.000 ng/mL (10 mg/mL) ve girdap son konsantrasyon 1 dakika oluşturmak için 990 µL homogenate içine 1 mg/ml etambutol DMSO hisse senedi 10 µL ekleyerek spike.</li>
	<li>Tarafından homogenate bir cryomold dökme ve hızla 5 dakika kuru buza buz gibi donmuş homogenate Bloğu Oluştur.</li>
	<li>2.1-2,5 adımlarda açıklandığı gibi homogenate blok 25 µm kalınlığında bölümleri hazırlayın.</li>
	<li>Hedef doku alan adımları 3.2-3.10 belirtildiği gibi incelemek.</li>
	<li>10 µL 1:1 Asetonitril/su ve 2 µL PBS arabelleği microdissected doku içeren tüpler ekleyin.</li>
	<li>Ayıklama çözüm 50 µL her tüp için ekleyin. Standart bir eğri oluşturmak ve doku homogenate blok içinde ilaç konsantrasyonu belirlemek için 4,9-4.12 adımları izleyin.</li>
	<li>Ayıklama verimliliği aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections.">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li><li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies.">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li><li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging,+laser+capture+microdissection,+and+LC-MS/MS+of+the+same+tissue+section.">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li><li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis.">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+A+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).</li><li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy.">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li><li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Dağınık şekilde çözülmüş miktar akciğer TB lezyonlar içinde ilaçların ilaç pozlama sterilize konsantrasyonları bakteriyel nüfus farklı lezyon bölmeleri içinde ikamet eden ulaşır olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Burada açıklanan LCM-LC/MS yöntemi kullanarak yalnızca 1-3 doku bölümleri toplam bakteri açısından zengin caseum de dahil olmak üzere bütün lezyon bölümler içinde anti-TB ilaçların mutlak miktar sağlar. Geleneksel doku homojenizasyon ve LC/MS yaklaşımlar iç...

Dağınık şekilde çözme ve ilaç düzeyleri ölçmek özelliğini Anti-tüberküloz ilaçlar bakteriyel altgrupları konsantrasyonları1sterilize, akciğer lezyonları içinde ulaşmak olup olmadığını belirlemek için çok önemli bir gereksinimdir. Belirli önemi uyuşturucu penetrasyon (caseum denir) lezyon genellikle basiller en yüksek sayısını içerir ve ilaçlara vaskülarizasyon yokluğu nedeniyle erişilebilir olabilir nekrotik çekirdek içine belirliyor.
Homojenizasyon eksize pulmoner lezyonların dahil lezyon penetrasyon, değerlendirmek için geleneksel yöntemleri ardından solvent ekstraksiyon ve sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LC/MS) analizi, son derece hassas ve uyuşturucu için seçici faiz. Ancak, bu yöntemleri özgün homojenize doku boyutunu sınırlı yoksul mekansal bilgi sunuyoruz. Kütle spektrometresi tabanlı görüntüleme yaklaşımlar, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonlaşma (maldı)2,3gibi electrospray iyonlaşma (DESI)4 ya da yüzey çıkarma sıvı gelişmiş5desorption, 6 teklif görüntüleme yetenekleri son derece dağınık şekilde çözüldü, ama doğrudan miktar son derece zor ya da imkansız heterojen iyon bastırma etkileri ve çeşitli hücreden analit farklı ayıklama verimliliği nedeniyle olabilir veya doku7türleri. Ayrıca, en doğrudan doku MS görüntüleme yaklaşımlar doğal olarak daha az LC/MS iyonlaşma ve uyuşturucu dokusundan daha düşük solvent ekstraksiyon verimliliği için rekabet endojen türlerin Kromatografik ayırma eksikliği nedeniyle daha duyarlıdır.
LC/MS analizi ile kombine lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yalıtmak ve proteomik8,9 çalışmalar için farklı doku bölgeleri karakterize için rutin olarak uygulanan ve son zamanlarda uyuşturucu miktar için kullanılan içinde ilaç hayvan doku10. Burada en iyi duruma getirilmiş bir protokol farklı Granülom bölmeleri içinde anti-TB uyuşturucu ölçmek için LCM LC/MS (LCM-LC/MS) analizi ile birlikte uygulama mevcut. Lazer yakalama mikrodiseksiyon işlemi bir UV lazer ile mikroskop objektif keser ve kullanıcı tarafından tanımlanan bir yolu takip ederek istenilen doku alan izole doku bölümü üzerine odaklanmıştır. Yerçekimi destekli LCM için (Bu araştırma için kullanılan teknik), doku bölümü (PET veya kalem) bir ince polimer membran slayt monte edilir ve doku slayt oturtulmuş bir koleksiyon tüp şapkalı yakalanır. Uyuşturucu eksize dokudan ayıklanır ve standart LC/MS yaklaşımları kullanarak sayılabilir. Doku toplanması için gerekli miktarı sonuçta dokuda mevcut uyuşturucu beklenen konsantrasyonu ve LC/MS yöntemi duyarlılık belirlenir. Terapötik düzeyde ilaç ve bir rutin triple quadrupole Kütle Spektrometre, 3 milyon µm2 (3 mm2) dokusunun kullanılarak analiz ilaçların çoğu analizleri için yüzey alanı yeterlidir.
Bu iletişim kuralı kayma profil oluşturma güçlü bir kombinasyon açıklar ve mutlak ilaç konsantrasyonları TB granülomlar bütün bölümler içinde sağlayan tam miktar LCM-LC/MS tarafından sunulan. Teknik aynı zamanda birçok farklı hastalıklı dokuları hayati ilaç bulma ve geliştirme bilgi veren konsantrasyonlarda uyuşturucu belirlemek için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White rabbits</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL flat-cap PCR tubes</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>Steel frames, PET-membrane</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 Deep well plate 2.0ML PP RB</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &amp;mu;m)</td><td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Zipper&amp;rdquo; Seal Sample Bags</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 cryostat</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica CM1860 is the current model</td></tr><tr><td>Laser Microdissection System 6500</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica LMD 6 is the current model</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

Tüberküloz hala morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen bir nedenidir. İlerleme-e doğru mevcut uyuşturucu rejimleri ve roman therapeutics gelişimi şiddetle ihtiyaç vardır. Ulaşmak ve bakteri kötü skarların nekrotik bölgeler (caseum), pulmoner granülomlar içinde sterilize etmek için biraz dozlayıp TB uyuşturucu başarılı terapötik müdahale için çok önemli bir özelliğidir. Etkili tedavi rejimleri bu nedenle uyuşturucu ile olumlu caseum penetrasyon özellikleri içermesi gerekir. Biyolojik dokuların seviyelerinde ilaç miktarının geçerli LC/MS yöntemler sınırlı Uzaysal çözünürlük yetenekleri, doğru küçük doku bölmeleri içinde bulunanlar gibi içinde mutlak ilaç konsantrasyonu belirlemek üzere nekrotik granülomlar. Burada lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) patolojik olarak farklı doku bölgeleri LC/MS miktar ile birleştiren bir iletişim kuralı mevcut. Bu teknik granuloma caseum, hücresel lezyon ve ilişki kurmadan Akciğer doku çevreleyen içinde ilaçların mutlak miktar sağlar ve bu nedenle, doğru bir şekilde bakterisidal konsantrasyonları elde olup olmadığını belirler. Tüberküloz araştırma ek olarak, teknik hastalıklı dokularda dağınık şekilde çözülmüş miktar uyuşturucu için birçok potansiyel uygulamalar var.

LCM-LC/MS yaklaşım genel bakış şekil 1' de gösterilen. Gama-ışın tarafından doku sterilize sonra (doku itibaren kesit) üzerinden tüm sonraki adımları BSL3 koşullar dışında gerçekleşecek. Şekil 2 lezyon öncesi ve sonrası doku yalıtım LCM tarafından biyopsisi bölümleri gösterir. TB lezyonlar nekrotik ve hücresel bölgelerin kolayca tespit ve optik görüntü (olmadan bitişik doku histolojik olarak lek...

Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Burada, LC/MS analizi ile birleştiğinde lazer yakalama mikrodiseksiyon dağınık şekilde ölçmek-akciğer tüberkülozu granülomlar içinde uyuşturucu dağıtımı için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Yaklaşım ilaç konsantrasyonları yüksek uzaysal detay dokularda miktarının için geniş uygulanabilirliği vardır.

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Görüntüleme.  Rutgers, The State University of New Jersey. Burada, LC/MS analizi ile birleştiğinde lazer yakalama mikrodiseksiyon dağınık şekilde ölçmek-akciğer tüberkülozu granülomlar içinde uyuşturucu dağıtımı için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Yaklaşım ilaç konsantrasyonları yüksek uzaysal detay dokularda miktarının için geniş uygulanabilirliği vardır.

Video: Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle's Mapping and Quantification in Organ Tissue

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) performed on thin sections of rodent tissues: kidneys and tumor, allows the detection of inorganic elements such as (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, and Fe, naturally present in the body and (ii) Si and Gd, detected after the injection of gadolinium-based nanoparticles. The animals were euthanized 1&#160;to 24 hr&#160;after intravenous injection of particles. A two-dimensional scan of the sample, performed using a motorized micrometric 3D-stage, allowed the infrared laser beam exploring the surface with a lateral resolution less than 100 &#956;m. Quantitative chemical images of Gd element inside the organ were obtained with sub-mM sensitivity. LIBS offers a simple and robust method to study the distribution of inorganic materials without any specific labeling. Moreover, the compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of the same biological tissue with different types of response:&#160;elemental, molecular, or cellular.

Laser-induced breakdown spectroscopy performed on thin organ and tumor tissue successfully detected natural elements and artificially injected gadolinium (Gd), issued from Gd-based nanoparticles. Images of chemical elements reached a resolution of 100 &#956;m and quantitative sub-mM sensitivity. The compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of a same biological tissue.

Lazer kaynaklı Arıza Spektroskopisi: Organ Doku Nanopartikülün en Mapping ve Nicelik için Yeni Bir Yaklaşım

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) ...

Mühendislik

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Biyokimya

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emAkciğer granülomlara Gömülü Formalinle Sabit Parafin dan&gt; Özel Transkript

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Tıp

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Atmosferik basınç Moleküler Görüntüleme LAESI Kütle Spektrometresi Biyolojik Dokular ve Biyofilmler

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Biyoloji

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

bir<em&gt; In vitro</emTüberküloz Lezyonlarında İlaç Penetrasyonunu Öngören Caseum Bağlanma Testi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analiz 18FDG PET/BT uzmanı Mycobacterium tüberküloz enfeksiyon ve insan olmayan primatlarda tedavisi için bir araç olarak görüntüleme

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well as other phenotypic characteristics. However, they all have in common the most relevant character of mycobacteria: its unique and highly hydrophobic cell wall. Mycobacteria species contain a membrane-covalent linked complex that includes arabinogalactan, peptidoglycan, and long-chains of mycolic acids with types that differ between mycobacteria species. Additionally, mycobacteria can also produce lipids that are located, non-covalently linked, on their cell surfaces, such as phthiocerol dimycocerosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), glycopeptidolipids (GPL), acyltrehaloses (AT), or phosphatidil-inositol mannosides (PIM), among others. Some of them are considered virulence factors in pathogenic mycobacteria, or critical antigenic lipids in host-mycobacteria interaction. For these reasons, there is a significant interest in the study of mycobacterial lipids due to their application in several fields, from understanding their role in the pathogenicity of mycobacteria infections, to a possible implication as immunomodulatory agents for the treatment of infectious diseases and other pathologies such as cancer. Here, a simple approach to extract and analyze the total lipid content and the mycolic acid composition of mycobacteria cells grown in a solid medium using mixtures of organic solvents is presented. Once the lipid extracts are obtained, thin-layer chromatography (TLC) is performed to monitor the extracted compounds. The example experiment is performed with four different mycobacteria: the environmental fast-growing Mycolicibacterium brumae and Mycolicibacterium fortuitum, the attenuated slow-growing Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), and the opportunistic pathogen fast-growing Mycobacterium abscessus, demonstrating that methods shown in the present protocol can be used to a wide range of mycobacteria.

A protocol is presented to extract the total lipid content of the cell wall of a wide range of mycobacteria. Moreover, extraction and analytical protocols of the different types of mycolic acids are shown. A thin-layer chromatographic protocol to monitor these mycobacterial compounds is also provided.

İnce Tabaka Kromatografisi ile Mikobakterilerin Lipid Bileşiminin Analizi

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. Human-infective trypanosomatid parasites include Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease; Trypanosoma brucei, the&#160;causative agent of sleeping sickness; and Leishmania species, causative agents of leishmaniasis. Jointly, they affect 20 million people across the globe. These parasites show specific tropism: heart, esophagus, colon for T. cruzi, adipose tissue, pancreas, skin, circulatory system and central nervous system for T. brucei, skin for dermotropic Leishmania strains, and liver, spleen, and bone marrow for viscerotropic Leishmania strains. A spatial perspective is therefore essential to understand trypanosomatid disease pathogenesis. Chemical cartography generates 3D visualizations of small molecule abundance generated via liquid chromatography-mass spectrometry, in comparison to microbiological and immunological parameters. This protocol demonstrates how chemical cartography can be applied to study pathogenic processes during trypanosomatid infection, beginning from systematic tissue sampling and metabolite extraction, followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, and concluding with the generation of 3D maps of metabolite distribution. This method can be used for multiple research questions, such as nutrient requirements for tissue colonization by T. cruzi, T. brucei, or Leishmania, immunometabolism at sites of infection, and the relationship between local tissue metabolic perturbation and clinical disease symptoms, leading to comprehensive insight into trypanosomatid disease pathogenesis.

This protocol describes the steps to generate a 3D model of metabolite distribution during trypanosomatid infection, including sample collection, metabolite extraction, an overview of liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, 3D model generation, and finally, data visualization.

Tripozomatid Enfeksiyonunu İncelemek için Kimyasal Kartografi Yaklaşımları

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler