Bu eser Instituto de tarafından desteklenen Salud Carlos III (Plan Estatal de ben + D + ben 2013-2016): CP15-00012, PI16-00860 ve CIBER (CB06/02/0053), ortak '' Europe ulaşmanın bir yolu '' Avrupa Kalkınma bölgesel Fonu tarafından finanse hibe (ERDF). JAE Madrid (2016-T1/biyo-1105) ve ben hükümet Atracción de talento program tarafından desteklenmektedir + D Excelencia, İspanyol "gayri resmi" de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM: Instituto de Miguel Servet bursu tarafından desteklenmektedir Salud Carlos III (MS15/00012) ortak Avrupa Sosyal Fonu tarafından finanse edilen "senin geleceğine yatırım" (ESF) ve ERDF.

1. deneysel sistem antibiyotik direnci Gene kodlama inşaatı
Not: Burada E. coli MG1655 plazmid veya Kromozom kodlanmış antibiyotik direnci gen alıcı suşu kullanıldı. Antibiyotik direnci geni kromozom veya bir başka türlü isogenic zorlanma (şekil 1) içinde multicopy bir plazmid kodlanmış olduğunu.
<ol><li>
MG1655 kromozom λ fajının Tümleştirme sitesi (attB)20 antibiyotik direnci gen ekleme.
	<ol>
<li>Kromozom attB sitesi PCR tarafından her iki tarafında, 500 bp-uzun bölgeleri yükseltmek. Oligonucleotides YbhC-F kullanın (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') ve attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') sol homoloji bölge ve attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') ve YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') için doğru bir. Tem1-pBAD-F primerler kullanılarak blaTEM-1 direnç gen yükseltmek (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') ve Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). Tasarım astar yaklaşık 20 ile kan basıncı (5' ucuna) tamamlayıcılık için erimiş olacak parçası için gösterilen dizi.</li>
		<li>Homoloji bölgeleri (ve organizatörü bölgede de dahil olmak üzere) antibiyotik direnci gen PCR ürünü için sigorta için 30 dk 50 ° C'de izotermal derleme21, kullanarak.</li>
		<li>Electroporate MG1655 içeren plazmid pKOBEG hücreleri. Not: pKOBEG λ içerir bir thermosensitive vektörü olduğu kırmızı makine, kromozom ve PCR ürünleri22arasında allelic değişim homoloji-esaslı teşvik.<ol>
<li>2 mm cuvettes 4 ° C'de electrocompetent hücrelerinin 40 µL ve 2.5 adım 1.1.223 ürünün 1 µL kullanın kV. Resuspend hücreleri 1 mL LB suyu + λ ifade korumak için % 0,2 arabinoz kırmızı makine.</li>
			<li>Toplam hacim microfuge tüp aktarmak ve 2 h 30 ° C'de yoğun (bir orbital shaker 200 devir/dakika) sallayarak ile (pKOBEG için izin veren sıcaklık) kromozom içinde eklenen direnç işaretleri fenotipik bir ifade için izin vermek için kuluçkaya.</li>
			<li>Antibiyotik direnci gen (Ampisilin veya 100 mg/l blaTEM-1için carbenicillin) seçmek için uygun antibiyotik içeren LB agar hücrelerdeyse plaka.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir Petri dish üzerinde 100 µL plaka ve birimin dinlenme spin, taze LB suyu 100 µL içinde resuspend ve başka bir Petri kabına plakası. Gecede 42 ° C'de kuluçkaya Not: Bu non-keyfi pKOBEG çoğaltma için sıcaklığıdır. Bu koşullarda büyümek mümkün kolonileri pKOBEG kaybetmiş ve attB siteye entegre direnç gen sunacak (kolaylık olması açısından bu soy adı verilecek MG1655::resA bundan böyle).</li>
		<li>Test plakaları kloramfenikol ile ilgi kolonileri çoğaltma tarafından pKOBEG kaybı için (hangi pKOBEG karşı antibiyotik içeren bir direnç marker). Not: Kloramfenikol plakaları keyfi sıcaklıkta büyüme 30 ºC eksikliği plazmid yokluğu göstergesidir.</li>
		<li>Klonlar doğrulamak için PCR yükseltmek dış primerler YbhC Extern kullanılarak inşaat (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') ve YbhB-Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), Jel Elektroforez ile amplicon ve sırasını doğru boyutunu doğrulayın arıtılmış ürün eklenen gen dizisini doğru olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antibiyotik direnci gen multicopy bir plazmid yerleştirin. Not: plazmid çok yüksek kopya numarası ile büyük bir azalma bakteriyel konak fitness empoze eğilimindedir çünkü çoğaltma, p3655 gibi doğal bir kökeni multicopy plazmid kullanımıyla önerilir (pSU18T-pBADgfp2, ColE1 türü kökeni çoğaltma24). Bu Plasmid'ler genellikle bir orta kopya dizi hakkında mevcut hücre başına 15-20 kopya.<ol>
<li>PCR, PCR ürünü fazdan ve plazmid PCR güçlendirilmiş omurgaya ligate antibiyotik direnci gen (organizatörü bölgesi de dahil olmak üzere) seçim yükseltmek:<ol>
<li>PCR antibiyotik direnci gen yükseltmek; blaiçinTEM-1 kullanmak astar Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') ve Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').</li>
			<li>T4 polinükleotit kinaz, üreticinin yönergeleri kullanarak saf ürün fazdan.</li>
			<li>PCR yükseltmek bir yüksek-sadakat polimeraz ve oligonucleotides pBAD-F kullanarak plazmid omurga (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') ve pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').</li>
			<li>T4-ligaz kullanarak her iki PCR parçaları ligate üreticisinin yönergeleri izleyerek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Daha önce en fazla 1 µL ligasyonu ürün ve antibiyotik direnci gen (Ampisilin veya 100 mg/L, carbenicillin için uygun antibiyotik seçin electrocompetent E. coli DH5-α hücre 40 µL açıklandığı gibi Electroporate, blaTEM-1için) ve plazmid omurga. Not: LB arabinoz ile ilave gereksizdir.</li>
		<li>Reader's choice ticari Mini hazırlık seti kullanarak plazmid çıkarımı:<ol>
<li>5 mL de bir gecede kültür 12.000 x g oda sıcaklığında, centrifuging tarafından hasat. Resuspension çözümün 250 µL hücrelerde resuspend ve iyice karıştırın. 250 µL lizis çözüm ekleyin ve iyice karıştırın. Nötralizasyon 350 µL ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
			<li>Kiti, 1 dk santrifüj ile sağlanan DNA bağlama sütun süpernatant transfer ve aracılığıyla akış atın. İki kez sütun yıkama çözüm, bir dakikalığına centrifuging ve flowthrough her yıkama atarak 500 µL ile yıkayın. Boş sütun için artık çamaşır arabellek kaldırmak ek 1 dk santrifüj kapasitesi.</li>
			<li>Sütun bir temiz tüpü yerleştirin ve ultra saf su 50 µL saf DNA elute membran için ekleyin. 1-2 dk santrifüj kapasitesi ve toplamak arıtılmış plazmid aracılığıyla bu akış içerir. Sanger sıra sıra doğru olduğundan ve hiçbir mutasyonlar evrim deneyleri önce direnç gen mevcut olduğunu onaylamak için eklenen sıra dışında gelen primerler kullanılarak plazmid ilgi gen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sıra doğrulandıktan sonra electroporate E. coli MG1655 gerginliği, yukarıda açıklandığı gibi plazmid. Not: Bu zorlanma verir MG1655/pRESA.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. evrim kurtarma yaklaşım antibiyotik direnci (şekil 1) deneysel olarak gelişmeye
<ol><li>Çizgi çalışması altında suşları LB plakaları dışarı: MG1655::resA ve MG1655/pRESA artı duyarlı ebeveyn gerginliği, MG1655. Not: Bu nedenle antibiyotik LB plakaları eklemenize gerek yoktur plazmid pRESA MG1655 içinde kararlı olmalıdır. Plazmid dizi her adımda doğrulamak gerekli değildir, inşaat doğrulandıktan sonra mutasyon oranları E. coli olarak yeterince düşüktür.</li>
	<li>96-şey pilakalar ve 200 µL lb her iyi hazırlamak ve her yük bağımsız Wells (bir tabak başı zorlanma) 48 izole kolonileri aşılamak. Gecede, 37 ° C ve 200 rpm plakaları kuluçkaya. Donmuş bir hisse senedi bu kurucusu nüfusun tutun. Not: önlemek ve 96-şey tabak içinde kültür Çapraz bulaşma için kontrol için aşısını wells ile bakteri-özgür orta 96-şey plaka boyunca enterkalasyon bir Dama Tahtası plaka tasarım kullanın. Bu plaka tasarım tüm deneysel evrim sırasında kullanın.</li>
	<li>Evrimsel kurtarma deney aşı 2 µL yeni 96-şey plakaları kurucusu nüfus ile plakaların her kuyudan LB her iyi 198 µL antibiyotik altında eğitim sub-inhibitory bir konsantrasyon ile ile başlayın. Evrimsel kurtarma yaklaşım ¼ veya 1/8 (mikrofon, belirlenen daha önce25) minimal inhibitör konsantrasyonunun LB antibiyotik her üç suşları için başlatın ve antibiyotik günlük konsantrasyon çift. Direnç mutasyonları26elde etmek için nüfus olasılığını en üst düzeye çıkarmak için bu yaklaşımı kullanın. Plakayı 37 ° C ve 200 rpm 20 h için kuluçkaya. Not: gece OD kurucusu nüfusun ölçün. OD suşları arasında önemli farklılıklar aynı şey başına hücre sayısı ile deneme başlatmak için ilk inoculum düzelt.</li>
	<li>Her gün, her nüfus gecede kültür sonra OD ölçmek ve bir transfer kültürlerin 2,3, önceki günden antibiyotik çift konsantrasyonu ile yeni 96-şey plakalar için açıklandığı gibi gerçekleştirin. Tabak 20 h 37 ° C'de ve 200 rpm kuluçkaya. Not: 1: 100 seyreltme faktörü günde yaklaşık 6-7 nesiller üretir.</li>
	<li>Buna paralel olarak, denetim nüfus aynı koşullarda her yük 2.3 ve 2.4, ancak antibiyotik yokluğunda açıklandığı gibi yaymak. Not: Denetim nüfus antibiyotik ve genel mutasyonlar için deneysel koşullar adapte bakteri yardım varlığı nedeniyle doğan mutasyonlar arasında ayırımcılık yardımcı olacaktır. Paralel mutasyonlar antibiyotik yokluğunda doğan bakteri deneysel koşullar adapte yardımcı olmak büyük olasılıkla ve antibiyotik direnci için ilişkili olmayan vardır.</li>
	<li>Hayatta kalan nüfus sayısını her gün dalga boyunda 600 Absorbans ölçerek izlemek nm (OD) plaka okuyucu kullanarak kültürlerin. Not: 0,1 nüfus tükenme belirtmek daha optik yoğunluk değerleri daha düşük. Şekil 2 yaşam eğrilerinin bir örnek için bkz:.</li>
	<li>Bir dondurulmuş hazır tüm nüfusun düzenli aralıklarla (her 3-5 gün) tutmak.</li>
	<li>Günlük sırası testleri [paket RStudio (sürüm 0.99.486) "hayatta kalma"] istatistik nüfus farklı suşları yaşama antibiyotik12konsantrasyonu artan altında zaman içinde farklılıkları belirlemek için kullanın. Not: Bu deneme multicopy plazmid belirli antibiyotik ve gen altında eğitim için antibiyotik direnci evrimi kazara belirleyecek.</li>
</ol>3. moleküler temeli antibiyotik direnci (şekil 1) evrimi
<ol><li>Nüfus ve klonlar temsilcisi bir dizi toplam DNA çekimi suşları ve tedavileri arasında gerçekleştirin. Ebeveyn suşları dahil (MG1655, MG1655::resA ve MG1655/pRESA) deneme sırasında biriken mutasyon tespit edebilmek için. Not: tablo malzemelerin DNA ekstraksiyon kitleri örnekleri için bkz:. Her kitte farklı protokoller vardır; üreticileri yönergeleri izleyin.</li>
	<li>DNA kalite ve ölçmek. DNA kalite ve belirlemek için farklı yöntem vardır. Oranları Absorbans 260 nm/280 nm ve 260 nm/230 nm ölçme kalite belirleme. DNA toplama üretici yönergeleri izleyerek ölçmek için bir Floresan, DNA'ya bağlanıcı boya kullanımı ve özel Jel Elektroforez orada onaylamak için hiçbir DNA bozulma ya da RNA kirlenme.</li>
	<li>Antibiyotik direnci genetik temeli araştırmak için kullanım derin DNA sıralama örneklerinden tüm nüfus ve bireysel klonlar. Not: Biz insan genetiği, Oxford, İngiltere için Wellcome Güven Merkezi tüm sıralama yapılmıştır. Daha fazla bilgi için bkz: San Millan vd. 201612.</li>
	<li>Breseq 0.26.1 boru hattı27,28 mutasyonlar nüfus sıklığı tahmin etmek için çok biçimlilik modunu kullanma mutasyonlar, algılamak için kullanın. Deneme sırasında birikmiş mutasyonlar algılamak için ebeveyn genom için farklı gelişti genleri karşılaştırın.</li>
	<li>Paralel denetimi nüfus bu nüfusun mutasyonlar birikmiş karşılaştırmak konsantrasyonu antibiyotik bakteri genel deneysel koşullar (adapte yardım mutasyonlar arasında ayırt etmek için artan altında gelişti Bu denetim nüfus içinde bulunur) ve bu söz konusu olursa antibiyotik direnci (Bu sadece antibiyotik baskısına maruz nüfusu bulunan). Not: farklı paralel mutasyon tedaviler arasında kolayca tespit edilebilir böylece paralel mutasyonlar sayısı genellikle düşüktür. Diğer mutasyonlar dışında antibiyotik direnci gen altında oldukça bulmak olasıdır eğitim mutasyonların kromozom içinde antibiyotik direnci, porins veya sızma sistemleri12böyle mutasyonların ile ilişkili.</li>
	<li>Bu protokolün 1 kısmı olduğu gibi aynı yaklaşımı kullanarak ebeveyn zorlanma antibiyotik direnci gen mutasyonların yeniden. Puan 1.1 ve 1.2 yeni mutasyonlar (Gelişmiş genler PCR şablon olarak kullanıp) ebeveyn arka planda tanıtmak için iletişim kuralı izleyin. Antibiyotik direnci fenotipleri mutasyonlar rolü onaylamak için bu yeni yapıların analiz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TACKLING+DRUG-RESISTANT+INFECTIONS+GLOBALLY:+FINAL+REPORT+AND+RECOMMENDATIONS.">TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS.</a> Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).</li><li>Palmer, A. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding,+predicting+and+manipulating+the+genotypic+evolution+of+antibiotic+resistance.">Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance.</a> Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).</li><li>MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+population+genetics+of+antibiotic+resistance:+integrating+molecular+mechanisms+and+treatment+contexts.">The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts.</a> Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).</li><li>Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Beagle+in+a+bottle.">The Beagle in a bottle.</a> Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).</li><li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+dynamics+during+experimental+evolution.">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).</li><li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+experiments+with+microorganisms:+The+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation.">Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).</li><li>Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Experimental+Evolution+in+Escherichia+coli.+I.+Adaptation+and+Divergence+During+2,000+Generations.">Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations.</a> The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).</li><li>Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+in+response+to+high-temperature+selection.">Rapid evolution in response to high-temperature selection.</a> Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).</li><li>Bell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+rescue+and+the+limits+of+adaptation.">Evolutionary rescue and the limits of adaptation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).</li><li>Bell, G., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+Evolutionary+Rescue+in+Metapopulations+Experiencing+Environmental+Deterioration.">Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration.</a> Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).</li><li>Bell, G., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+rescue+can+prevent+extinction+following+environmental+change.">Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change.</a> Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).</li><li>San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicopy+plasmids+potentiate+the+evolution+of+antibiotic+resistance+in+bacteria.">Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1, 0010 (2016).</li><li>Alekshun, M. N., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+antibacterial+multidrug+resistance.">Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance.</a> Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).</li><li>Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+gene+transfer+and+the+nature+of+bacterial+innovation.">Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation.</a> Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).</li><li>Carattoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+and+the+spread+of+resistance.">Plasmids and the spread of resistance.</a> Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).</li><li>Smillie, C., Garcill&#225;n-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+plasmids.">Mobility of plasmids.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).</li><li>San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+epistasis+between+co-infecting+plasmids+promotes+plasmid+survival+in+bacterial+populations.">Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations.</a> ISME J. , (2013).</li><li>Stoesser, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+History+of+the+Global+Emergence+of+the+Escherichia+coli+Epidemic+Clone+ST131.">Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131.</a> MBio. 7 (2), (2016).</li><li>San Millan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiresistance+in+Pasteurella+multocida+is+mediated+by+coexistence+of+small+plasmids.">Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids.</a> Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).</li><li>Escudero, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+the+ancestral+activity+of+integron+integrases+reveals+a+smooth+evolutionary+transition+during+functional+innovation.">Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation.</a> Nat Commun. 7, 10937 (2016).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+efficient+gene+replacement+in+the+filamentous+fungus+Aspergillus+nidulans.">A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans.</a> Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).</li><li>Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+Vibrio+splendidus+mutant+lacking+the+metalloprotease+gene+vsm+by+use+of+a+novel+counterselectable+suicide+vector.">Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , (2009).</li><li>Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+rescue+from+extinction+is+contingent+on+a+lower+rate+of+environmental+change.">Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change.</a> Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).</li><li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq.">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li><li>Barrick, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+structural+variation+in+haploid+microbial+genomes+from+short-read+resequencing+data+using+breseq.">Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq.</a> BMC Genomics. 15, 1039 (2014).</li><li>Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+evolution+of+TEM-1+&#946;-lactamase:+experimental+reconstruction+and+clinical+relevance.">Natural evolution of TEM-1 &#946;-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance.</a> FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).</li><li>Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycoside+modifying+enzymes.">Aminoglycoside modifying enzymes.</a> Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).</li><li>Jerison, E. R., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+investigations+of+evolutionary+dynamics+and+epistasis+in+microbial+evolution+experiments.">Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 35, 33-39 (2015).</li><li>Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Basis+of+Evolutionary+Innovation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz moleküler biyoloji, deneysel evrim ve evrim bakterilerde antibiyotik direnci ve multicopy plazmid rolünü araştırmak için tasarlanmış derin DNA sıralama birleştiren yeni bir iletişim kuralı mevcut. Her ne kadar bu iletişim kuralı teknikleri farklı alanlardan birleştiren, onu geliştirmek için gereken tüm yöntemleri basit ve düzenli Mikrobiyoloji laboratuvar olarak gerçekleştirilebilir. Protokol en kritik adımlarda muhtemelen modeli sistem suşları inşası ve yeniden yapılanma (ki tam olarak a...

Bakterilerde antibiyotik direnci önemli bir sağlık sorunu1' dir. Temel düzeyde, antibiyotik direnci patojen bakteri yayılmasını evrimin doğal seleksiyon2,3tarafından basit bir örnektir. Basitçe söylemek gerekirse, kullanma-in antibiyotik dirençli suşların için seçim oluşturur. Bir anahtar Evrimsel Biyoloji, bu nedenle, antibiyotik direnç gelişmeye bakteriyel nüfus yeteneğini etkileyen faktörleri anlamak için sorundur. Seçim deneyler bakterilerin Evrimsel Biyoloji araştırmak için çok güçlü bir araç olarak ortaya çıktı ve bu alanda inanılmaz geniş bir evrimsel sorunları4,5,6anlayışlar üretti. Deneysel evrim, bakteriyel nüfus tek bir ebeveyn yük başlatılan seri olarak tanımlanmış ve sıkı şekilde denetlenen koşullar altında pasajlı. Bazı bu kültürler büyüme sırasında meydana gelen mutasyonlar bakteriyel fitness artırmak ve bunlar kültürler seçim doğal tarafından yayıldı. Deneme sırasında nüfus örnekleri belirli aralıklarla cryogenically donmuş fosil kaydı olmayan gelişen oluşturmak için korunur. Yaklaşımlar geniş bir dizi bakteriyel nüfus gelişen karakterize etmek için kullanılabilir, ama onların uzak ataları ve olan tüm genom sıralamanın karşı gelişti bakteri rekabet yeteneğini ölçen fitness deneyleri iki en yaygın yöntem vardır Bu sürücü adaptasyon genetik değişiklikleri tanımlamak için kullanılır. Richard Lenski ve meslektaşları7,8öncü çalışmaları deneysel evrim standart yaklaşımda Çoğalt nüfusun nispeten az sayıda meydan olmuştur (genellikle < 10) yeni bir uyum ile Yeni karbon kaynakları, sıcaklık veya yırtıcı fajının gibi çevresel meydan okuma.
Direnç antibiyotik konsantrasyonları hasta dokularda ölümcül seviyelere artırmak mümkün değildir yüksek olduğunda antibiyotik dirençli bakterilerin neden olduğu enfeksiyonların büyük bir sorun haline. Klinisyenler ne bu eşik antibiyotik konsantrasyonu, klinik kesme noktası yüksek dozda antibiyotik direnç gelişmeye bakteri sağlar bu nedenle ilgilendi. Bu deneysel çalışmaya nasıl? Bakteriyel nüfus az sayıda yüksek dozda antibiyotik ile meydan, Lenski stilin olduğu gibi deneme, daha sonra büyük olasılıkla sonucu tek antibiyotik tüm nüfus için extinction götürmek olacaktır. Kullanılan antibiyotik doz düşük minimum inhibitör konsantrasyonu ebeveyn gerginliği, (MIC) ise aynı zamanda, o zaman bu özellikle eğer bakteriyel nüfus direnç, klinik düzeyde gelişecek düşüktür direnç büyük maliyeti taşır. Bu iki senaryoyu arasında bir uzlaşma "evrimsel kurtarma" deney9,10,11kullanmaktır. Bu yaklaşımda, kültürler, çok sayıda (genellikle > 40) ile zaman içinde genellikle antibiyotik konsantrasyon ikiye katlayarak her gün12artış antibiyotik doz meydan. Bu deney damgasını artan direnç gelişmeye değil herhangi bir popülasyon için extinction tahrik olduğunu. Bu şekilde meydan çoğu nüfus soyu tükenmiş tahrik, ama küçük bir azınlık direnci yüksek düzeyde gelişen tarafından devam edecek. Bu yazıda, bu deneysel tasarım evrim multicopy plazmid katkısını direnç araştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Bakteri iki asıl yol, kromozomal mutasyonlar ve mobil genetik elemanları, çoğunlukla plazmid13edinimi antibiyotik direnç kazanır. Çünkü onlar arasında konjugasyon14,15bakterilerin direnç genleri aktarmak mümkün plazmid antibiyotik direnci gelişiminde önemli rol oynar. Plazmid boyutu ve Biyoloji göre iki gruba ayrılabilir: "küçük", bakteri hücre ve "büyük" başına yüksek kopya numarası ile düşük ile kopyalayın sayı16,17. Direnci ve çoklu direnç bakteri15arasında yayılması anahtar sürücüleri vardır Konjügatif plazmid içerdiğinden evrim antibiyotik direnci ve büyük plazmid rolü kapsamlı bir şekilde belgelenmiş oldu. Küçük multicopy plazmid da bakteri17,18içinde son derece yaygındır ve genellikle antibiyotik direnç genleri19için kod. Ancak, küçük multicopy plazmid antibiyotik direnci gelişiminde rolü daha az bir ölçüde inceledi.
Bir son çalışmada, multicopy plazmid gen mutasyon oranları daha yüksek Gen kopya numarası cep12başına nedeniyle artırarak taşıdıkları genler evrimi hızlandırmak önerdi. Bir deneme modeli kullanarak e.coli suşu MG1655 ve β-lactamase gen blaTEM-1 bu multicopy plazmid görünüm üçüncü nesil direnci veriyor TEM-1 mutasyonların oranı hızlandırılmış gösterildi sefalosporin ceftazidime. Bu sonuçlar multicopy plazmid antibiyotik direnci gelişiminde önemli bir rol oynayabileceği belirtti.
Burada, biz geliştirdik yöntemi ayrıntılı bir açıklama mevcut antibiyotik direnci plazmid aracılıklı multicopy evrimi araştırmak için. Bu yöntem üç farklı adımlar vardır: gen altında eğitim multicopy bir plazmid veya ana bilgisayar bakteri kromozom ilk, ekleme. İkinci olarak, deneysel evrim (evrimsel kurtarma) seçici basınç adapte farklı suşları potansiyelini değerlendirmek için kullanın. Ve üçüncü, plazmid aracılıklı evrim sıralama ve ebeveyn genotip şüpheli mutasyonların tek tek yeniden yapılandırma DNA'yı kullanarak temel moleküler olarak belirlenmesi.
Burada açıklanan protokol antibiyotik direnci evrimi araştırmak için tasarlanmış olsa da, son olarak, bir bu yöntem genellikle mutasyonlar tarafından herhangi bir multicopy elde yenilikler evrimi analiz etmek yararlı olabilir iddia edebilirsiniz Plazmid kodlanmış gene.

<table><tbody><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BiorRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert</td><td>UF1060</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (shaker)</td><td>Cole-Parmer Ltd</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis power supply</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Electrophoresis chamber</td><td>BioRad</td><td>1704405</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Pippettes</td><td>Biohit</td><td>725020, 725050, 725060, 725070</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pippetes</td><td>Biohit</td><td>728220, 728230,&lt;br/&gt; 728240</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader Synergy HTX</td><td>BioTek</td><td>BTS1LF</td><td></td></tr><tr><td>Inoculating loops</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8388</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Falcon</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>BD Difco</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F533S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Resctriction enzymes</td><td>Fermentas FastDigest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Plasmid extraction kit</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>gDNA extraction kit</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kits</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>gDNA extraction kit</td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9054</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>ClearLine</td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates (-80&amp;ordm;C storage)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>249945</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Quantification of DNA concentartion</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad</td><td>1613100</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>50x TAE buffer</td><td>BioRad</td><td>1610743</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0031</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0014</td><td></td></tr></tbody></table>

testing the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance

Multicopy plazmid Prokaryotlarda son derece bol miktarda bulunmaktadır ancak bakteri evriminin içindeki rollerine kötü anlaşılır kalır. Biz son zamanlarda Gen kopya numarası multicopy plazmid tarafından sağlanan hücre başına artış plazmid kodlanmış genler evrimi hızlandırmak gösterdi. Bu çalışmada, biz multicopy plazmid gen evrim teşvik yeteneğini test etmek için deneysel bir sistem mevcut. Basit moleküler biyoloji yöntemleri kullanarak, nerede bir antibiyotik direnci gen Escherichia coli MG1655, kromozom veya multicopy bir plazmid üzerinde içine yerleştirilebilecek bir modeli sistemi inşa edilmiştir. Antibiyotiklerin konsantrasyonları artan altında farklı suşları yaymak için bir deneysel evrim yaklaşım kullanmak ve bakteriyel nüfus yaşama zamanla ölçüyoruz. Böylece gen sadece direnç mutasyonları edinimi ile görüşmek antibiyotik molekül ve direnç gen seçimdir. Bu "evrimsel kurtarma" yaklaşım antibiyotik direnci edinimi tanıtmak için multicopy plazmid potansiyelini test etmek için basit bir yöntem sağlar. Deneysel sistem sonraki adımda antibiyotik direnci moleküler üsleri karakterizedir. Mutasyonlar tanımlamak için antibiyotik direnci edinimi için sorumlu tüm nüfus ve klonlar elde örnekleri derin DNA sıralama kullanın. Son olarak, altında eğitim gen mutasyonların rolü onaylamak için biz onları ebeveyn arka planda yeniden ve direnç fenotip elde edilen suşların sınayın.

Önceki çalışmalarda, evrim direnç üçüncü kuşak sefalosporin ceftazidime12 veriyor doğru β-lactamase gen blaTEM-1 araştırılmıştır. Çünkü her ne kadar TEM-1 ceftazidime direnç görüşmek değil, blaTEM-1 mutasyonların etkinlik TEM-1 sefalosporinler ceftazidime29gibi hidrolize aralığını genişletebilirsiniz, bu gen seçildi. Antibiyotik direnci enzimler β-laktamaz veya değiş...

Watch this Scientific Journal Video about Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance at JoVE.com

Antibiyotik Direncinin Evriminde Çoklu Kopya Plazmidlerin Rolünün Test Edilmesi | Genetik | Video

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plazmid rolü antibiyotik direnci gelişimi test

Burada multicopy plazmid rolü antibiyotik direncinin evrime sınamak için deneysel bir yöntem mevcut.

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

testing-role-multicopy-plasmids-evolution-antibiotic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Natural Selection

SCIENTISTS IN ACTION

11.5K Görüntüleme.  Universidad Complutense de Madrid. Burada multicopy plazmid rolü antibiyotik direncinin evrime sınamak için deneysel bir yöntem mevcut.

Video: Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Sınıf 1 integronlar ve Gen Kasetleri için gıda maddelerinin taranması

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

Çevre

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons of conjugation frequency under different conditions are required to understand how the conjugative element spreads in nature. However, conventional methods for comparing conjugation frequency are not appropriate for in-depth comparisons because of the high background caused by the occurrence of additional conjugation events on the selective plate. We successfully reduced the background by introducing a most probable number (MPN) method and a higher concentration of antibiotics to prevent further conjugation in selective liquid medium. In addition, we developed a protocol for estimating the probability of how often donor cells initiate conjugation by sorting single donor cells into recipient pools by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Using two plasmids, pBP136 and pCAR1, the differences in conjugation frequency in Pseudomonas putida cells could be detected in liquid medium at different stirring rates. The frequencies of conjugation initiation were higher for pBP136 than for pCAR1. Using these results, we can better understand the conjugation features in these two plasmids.

With an aim to understand the behaviors of various bacterial conjugative DNA elements under different conditions, we describe a protocol for detecting differences in conjugation frequency, with high resolution, to estimate how efficiently the donor bacterium initiates conjugation.

Bakteriyel konjugasyon frekans yüksek çözünürlüklü karşılaştırma

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Genetik

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

Deneysel Evrim Yaklaşımında Plazmid Aracılı Antibiyotik Direncinin Ölçülmesi

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the study of the mobilization of naturally occurring conjugative plasmids, using two naturally-occurring plasmids as an example. These protocols rely on the differential presence of selectable markers in donor, recipient, and conjugative plasmid. Specifically, the methods described include 1) the identification of natural conjugative plasmids, 2) the quantification of conjugation rates in solid culture, and 3) the diagnostic detection of the antibiotic resistance genes and plasmid replicon types in transconjugant recipients by polymerase chain reaction (PCR). The protocols described here have been developed in the context of studying the evolutionary ecology of horizontal gene transfer, to screen for the presence of conjugative plasmids carrying antibiotic-resistance genes in bacteria found in the environment. The efficient transfer of conjugative plasmids observed in these experiments in culture highlights the biological relevance of conjugation as a mechanism promoting horizontal gene transfer in general and the spread of antibiotic resistance in particular.

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation mediates horizontal gene transfer by mobilizing plasmid DNA across two different cells, facilitating the spread of beneficial genes. This work describes a widely-used method for the efficient detection of conjugative plasmid transfer, based on the use of differential markers in the conjugative plasmid, donor, and recipient to detect transconjugation.

E. coli'de Doğal Konjugatif Plazmidlerin Aracılık Ettiği Yatay Gen Transferinin Saptanması

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

Antibiyotik Direnci Platformu Kullanarak Antibiyotik Dereplication

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Çoklu İlaç Akış Sistemlerini Karakterize Etmek için Tek Kopyalı Gen İfadesi

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

Yazar Spotlight: Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanarak Antibiyotik Direnci Araştırmasını İlerletmek

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Bacterial Transformation

<h4>Background</h4>

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine against pneumonia, Frederick Griffith set out to study two different strains of the Streptococcus pneumoniae: a non-virulent strain with a rough appearance (R-strain) and a virulent strain with a smooth appearance (S-strain) due to an outer polysaccharide capsule2. This outer layer of the S-strain bacteria enabled them to withstand the host immune system, eventually leading to a life-threatening illness. When Griffith separately injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice lived. However, when he injected mice with a combination of the heat-killed S-strain with live R-strain, the mice died2. When he analyzed the samples obtained from dead mice injected with the combination, he observed live S-strain bacteria to be present. In 1928, Griffith noted that a &#8220;transformation&#8221; process must have occurred to change the nonvirulent bacteria into the virulent strain. As the first known discovery of bacterial transformation, his discovery paved the way for the development of an essential tool in genetic engineering - transformation3.

Transformation is the genetic change in a cell due to the intake of DNA from the environment. In Griffith&#8217;s experiment, the DNA that encodes the protective polysaccharide coating of the S-strain bacteria did not break down from the heat shock and was introduced into the R-strain, allowing the latter to bypass the immune system of the mouse. While this process constantly occurs in the wild between organisms and even different species, scientists transform bacteria in laboratory settings for research purposes4.

<h4>Bacterial Transformation using Plasmids</h4>

Bacteria are the ideal organisms for transformation as they can easily take in exogenous genetic material into their genome and quickly amplify it3,5. They have one circular chromosome and multiple small circular pieces of double-stranded DNA called plasmids within the cytoplasm. These plasmids can replicate independently from the chromosomal DNA and generally provide certain functional benefits, such as resistance to antibiotics6,7. In their natural environment, bacteria undergo &#8220;bacterial transformation&#8221; by taking in plasmids from other bacteria in a process called conjugation8. Moreover, when they multiply, each of their progeny receives a copy of the new plasmid.

Plasmids that are used for experimental purposes are called plasmid vectors. In a laboratory setting, scientists can artificially create &#8220;recombinant plasmids&#8221; that are approximately 5,000-10,000 base pairs in length by inserting DNA fragments into a plasmid vector. These recombinant plasmids usually have certain components: an origin of replication (ORI), an antibiotic resistance gene, a multiple cloning site, a promoter, a selection marker, and the gene of interest. The origin of replication is where replication begins. The antibiotic resistance gene allows the bacteria that take in the plasmid to survive on plates in the presence of a certain antibiotic drug. Although plasmids are relatively small pieces of DNA, scientists need to treat the host cells to enable the plasmid penetration through the cell membrane. Hence, the efficiency of the transformation is directly related to porosity of the host membrane. One common approach is to heat-shock the bacteria that have been treated with a calcium chloride solution9. The bacteria that do not incorporate the plasmid will not transform, and therefore have no resistance to survive on the plate and be visible. The multiple cloning sites aid in DNA insertion by containing sites for restriction enzymes to cut the plasmid where the gene of interest can be inserted and ligated. The promoter drives transcription of the gene of interest. It is tagged by a marker, usually a fluorescent protein such as a green fluorescent protein (GFP), or can be an additional antibiotic resistance gene. The antibiotic resistance gene and the other selection markers help us determine whether the collected bacteria contain the plasmid of interest.

<h4>Applications</h4>

Effective transformation methods enabled scientists to isolate and profile genes and gene products and led to many advancements in life sciences and medicine, such as development of effective drugs, generation of genetically-modified crops, and advanced diagnostic tools10. In addition, with technological advancements, new methods of transformation have emerged. For instance, Gateway Cloning allows insertion of multiple DNA fragments into different vectors as well as transfer of DNA sequences between plasmids11. Furthermore, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 is a gene-editing technique that directly modifies nucleotides in the genome and does not require the use of plasmids12. After transformation, researchers often isolate and profile the gene of interest and its products. Subsequently, the whole process of genetic cloning has opened up a new field of genetic manipulation. Thanks to genetic cloning, researchers can manipulate bacteria to produce large amounts of specific human proteins, such as insulin to treat diabetes patients10. Cloning also has served a major importance in modern day agriculture. Genetically modified organisms (GMO) are a direct result of genetic cloning and bacterial transformation10. For instance, scientists are working to generate genetically modified crops with nitrogen-fixing genes incorporated into their genome to boost food production and reduce fertilizer use, thus, diminishing the economic and environmental impact of fertilizers13. In sum, bacterial transformation is the first step of modern-day biotechnology and the foundation of future research discoveries.

<h4>References</h4>

<ol class="references">
	<li>GL, Armstrong, LA, Conn and RW, Pinner. Trends in Infectious Disease Mortality in the United States During the 20th Century. JAMA. 1999, Vol. 281, 1 (61-66).</li>
	<li>F, Griffith. The Significance of Pneumococcal Types. J Hyg (Lond). . 1928 , 2 (113-59).</li>
	<li>Lorenz, MG and Wackernagel, F. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol Rev. . 1994 Sep;, Vol. 58, 3: (563-602).</li>
	<li>S, Domingues, et al. Natural Transformation Facilitates Transfer of Transposons, Integrons and Gene Cassettes between Bacterial Species. PLOS Pathogens. 2012, 8(8): e1002837.</li>
	<li>Dubnau, D. DNA uptake in bacteria. Annu Rev Microbiol. . 1999, 53: (217-44).</li>
	<li>Solar, G del, et al. Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. . 1998 , Vol. 62, 2: (434-64).</li>
	<li>Bennett, PM. Plasmid encoded antibiotic resistance: acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria. Br J Pharmacol. . 2008 , Vol. 153, S1: (S347-S357).</li>
	<li>MLlosa, et al. Bacterial conjugation: a two-step mechanism for DNA transport. Mol Microbiol. 2002 Jul;, Vol. 45, 1: (1-8).</li>
	<li>Roychoudhury, A, Basu, S and Sengupta, DN. Analysis of comparative efficiencies of different transformation methods of E. coli using two common plasmid vectors. Indian J Biochem Biophys. . 2009 , Vol. 46, 5: (395-400).</li>
	<li>Khan, S, et al. Role of Recombinant DNA Technology to Improve Life. I. nt J Genomics. . 2016, 2016:2405954.</li>
	<li>Marsischky, G and LaBaer, J. Many Paths to Many Clones: A Comparative Look at High-Throughput Cloning Methods. Genome Res. 2004, Vol. 14, 2020-28.</li>
	<li>Doudna, JA and Charpentie, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014, Vol. 346, 6213-1258096.</li>
	<li>Good, A. Toward nitrogen-fixing plants. Science. 2018, Vol. 359, 6378: 869-70.</li>
</ol>

Bacterial Transformation using Plasmids - Concept

Bakteriyel Dönüşüm

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Multicopy plazmid rolü antibiyotik direnci gelişimi test

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sınıf 1 integronlar ve Gen Kasetleri için gıda maddelerinin taranması

Bakteriyel konjugasyon frekans yüksek çözünürlüklü karşılaştırma

Deneysel Evrim Yaklaşımında Plazmid Aracılı Antibiyotik Direncinin Ölçülmesi

E. coli'de Doğal Konjugatif Plazmidlerin Aracılık Ettiği Yatay Gen Transferinin Saptanması

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Antibiyotik Direnci Platformu Kullanarak Antibiyotik Dereplication

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Bakteriyel Dönüşüm