Bu eser kısmen Koch Enstitüsü destek (çekirdek) Grant P30-CA 14051 Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından Ulusal kurumları sağlık Grant'ın (CA206157-22 ve GM118066) ve Angelika Amon Curt mermer kanser araştırma fonu tarafından desteklenmiştir. Angelika Amon da Howard Hughes tıp Enstitüsü ve Glenn Vakfı Biyomedikal Araştırma için bir dedektif olduğunu. S. S. tarafından Amerikan İtalyan kanser Vakfı (AICF), kanser araştırma Marie Curie eylemleri ve İtalyan Derneği kanser araştırma (AIRC) için bir arkadaş grubu tarafından ve bir KI Quinquennial kanser araştırma bursu tarafından desteklenmiştir. E.M. Howard Hughes tıp Enstitüsü'nden bir arkadaş grubu tarafından desteklenmiştir.

Kültür durumu
RPE-1 hTERT hücre kültürünü kültürlü Dulbecco'nın modifiye kartal % 10 ile desteklenmiş orta (Tablo reçetesi) Fetal sığır Serum, 2 mM L-glutamin ve 100 U/ml penisilin/streptomisin. Hücreleri oksijen bir ortamda % 5 CO2 37 ° C'de inkübe. Aşağıda açıklanan protokol 10 cm yemekleri kullanılarak geliştirilen ve tüm teknik detayları bildirdi o yemekleri için başvurun. Farklı yemekler kullanıyorsanız, ölçek yukarı ya da buna göre aşağı.
1. senkronizasyon 1 RPE hücrelerinin
<ol><li>Tüm deneyler için 15'ten fazla pasajlar tabi tutulmuştur değil taze çözdürülen hücreler kullanın. Gün 1, çözülme ve ~2.5 - 5.0 x 105 RPE-1 hTERT hücreleri bir 10 cm doku kültürü çanak içine dağıtmak. Standart büyüme Orta 8 mL ekleyin ve gecede kuluçkaya. Standart hücre sayaç (örneğin, hemasitometre) kullanarak cep numarasını belirleyin. Not: Hücre yoğunluğu 1 RPE hücrelerinin büyüme koşullarına anlamına gelir. Büyüme koşulları farklı hücre hatları arasında değişebilir; Buna göre ayarlayarak göz önünde bulundurun.</li>
	<li>2 günde hücreleri G1/S sınır normal büyüme orta alıyorum ve 5 mM timidin içeren 8 mL orta ekleyerek eşitleyin. Not: Timidin konsantrasyon ve tedavi uzunluğunu farklı hücre hatları arasında değişebilir. Test edilecek hücre satırları için en iyi koşulları belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>Timidin ekledikten sonra günde 3, 24 h orta (Adım 1.2), serbest timidin bloğundan orta alıyorum ve hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkama tarafından. 8 mL normal büyüme ortamının eklemek ve tabakları da kuluçka için dönmek.</li>
</ol>2. nesil Aneuploid Mitotik kinaz Mps1 aktivite ile girişim tarafından hücreleri
<ol><li>Günde 3, yayımlanmasından sonra 6 h timidin Block (1.3; adım hücreler mitoz girmeden önce yaklaşık 3-6 h bu), Aspire orta, bir kez 1 x PBS ile yıkayın ve 500 nM reversine (Mps1 inhibitörü) içeren orta ile değiştirin. Not: RPE-1 hücreler mitoz 9-12 h girin timidin wash-out10,11' den sonra. Ancak, hücre döngüsü Kinetik farklı hücre hatları arasında değişiklik gösterir. Bu nedenle, pilot deneylerde Bu kinetik tarafından kurulan yöntemleri (DNA analizi içerik üzerinden FACS ölçme tarafındanörneğin,) hücre döngüsü analizi gerçekleştirerek belirlemek çok önemlidir. Ayrıca, Mps1 inhibitörü en uygun çalışma konsantrasyonu hücre hatları arasında değişebilir. Önceki deneyler RPE1 hücreleri kullanarak bir çalışma konsantrasyonu 500 nM10,11,12reversine kullanarak başarılı olmuştur. Test edilecek hücre satırı için en uygun konsantrasyonu belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>Günde 4, 12 h reversine tedavi (yaklaşık 6 hücreler mitoz sonra h gibi) sonra reversine orta Aspire edin ve hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkayın. 8 mL normal büyüme orta plakasına eklemek ve hücreler için kuluçka dönmek.</li>
</ol>3. Aneuploid Bisiklete binme hücreleri ve ArCK nüfus zenginleştirme kaldırılması
<ol><li>Günde 6, hücreleri ilk mitoz girdikten sonra yaklaşık 72 h (2.2; adım yaklaşık 66 h reversine yıkama hakkında için karşılık gelen çıkış sonra bu 2-3 hücre döngüsü), Aspire orta, bir kez 1 x PBS ile yıkayın ve 300 nM nocodazole içeren orta ile değiştirin. Not: Son iş aneuploid karyotypes yataklık RPE-1 hücreleri genomically kararsız olan ve onların yayılması hakkında tutuklama göstermiştir ilk hatalı mitoz10sonra 2-3 hücre döngüsü. Ancak, bu Kinetik farklı hücre hatları arasında değişebilir. Bu nedenle, aneuploid Bisiklete binme hücreleri kaldırılması için uygun zamanlama belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek çok önemlidir.</li>
	<li>Gün 7, 12 h nocodazole tedavi sonra orta Aspire edin ve 3 mL 1 x PBS için plaka ekleyin. Mitotik hücre plaka tarafında dokunarak sallamak. Mitotik hücre bile kaldırılmasına izin için her dokunun arasında plaka döndür.</li>
	<li>Mitotik hücre tümüyle kaldırılmasını sağlamak için alıyorum ve 3 mL 1 x PBS her turun arasında ekleme (3 - 5 kez önerilir), birden fazla mermi için shake-off işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Sallamak-off sonra yavaşça kapağı veya plaka kenarına yapıştırılır herhangi bir sıvı Aspire edin. Kısaca, plaka 10 X büyütme, mikroskop altında kontrol edin. Kaç Mitotik hücre gözlenir emin olun. Beşten fazla Mitotik hücre 10 X amaç altında görülürse, başka yuvarlak-in sallamak-off yineleyin. Not: Mitotik hücreler yuvarlak görünür ve shake-kapalı sonra kısmen müstakil olabilir. Nocodazole tedavi bir sonraki turda hücrelere açığa önce Mitotik hücre tümüyle kaldırılmasını sağlamak çok önemlidir. Aksi halde Mitotik hücre ölüme yol ve/veya tetraploid hücreler nesilde neden.</li>
	<li>Son sallamak-off sonra bir kez 5 mL 1 x PBS de içeren hücreleri yıkayın. 330 nM nocodazole plaka içeren 8 mL orta ekleyin ve 12 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Nocodazole tedavi/sallamak-off (Adım 3.1-3,5) her 12 h tekrarlayın kadar hiçbir Mitotik hücre kuluçka sonra gözlenir. Genellikle, 4-5 tur tedavi/sallamak-kapalı tavsiye edilir. Not: burada sağlanan bilgi RPE-1 hücrelere bakın. Tedavi/sallamak-off tur sayısını farklı hücre hatları arasında değişebilir. Nocodazole uzun süreli ve gereksiz maruz önlemek için dikkatli bir şekilde, pilot bir deneyde aneuploid Bisiklete binme hücreleri verimli ve tam kaldırılması için gerekli tur sayısını belirlemek önemlidir.</li>
	<li>4-5 tur sonra nocodazole tedavi/sallamak-off (Adım 3.1-3.6), normal büyüme orta 10 mL ekleyin ve kuluçkaya. Hücreler için 12-24 h gelecekteki manipülasyon veya tahlil kullanmadan önce dinlenmek izin verir. Not: Son sallamak kapalı sonra plaka üzerinde kalan hücreleri hücre döngüsü tutuklandı ve10, son zamanlarda görüldüğü gibi karmaşık karyotypes liman var. Bu hücreler ArCK (karmaşık karyotip ile Arrested) hücreler olarak adlandırılır. Bu deneyleri ArCK nüfus üzerinde yalıtım bir hafta içinde gerçekleştirmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, karmaşık karyotypes tutuklandı hücrelerle yüzdesi değerlendirmek için toplamak ve standart hücre sayaç kapalı her sallamak-hücreleri saymak.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> Şekil 1: genel olarak oluşturmak ve karmaşık karyotip (ArCK) ve temsilcisi görüntüleri ile aneuploid hücreleri izole etmek için kullanılan yönteminin şematik. (A) üretimi ve yalıtım Protokolü şematik ArCK hücreleri. (B) temsilcisi görüntüleri RPE-1 hTERT hücre tedavisi her aşamasında. (Kırmızı özetlenen) son paneli izole ArCK hücreleri temsil eder. Ölçek bar 100 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
4. ArCK nüfus karakterizasyonu
<ol><li>ArCK nüfusunun başarılı yalıtım aşağıdaki testleri gerçekleştirerek onaylayın.<ol>
<li>Eşek beta-galaktozidaz (yaşlanma marker) Boyama ticari olarak kullanılabilir kullanarak (tablo malzemeleri görmek) kit.</li>
		<li>CCL2 gibi pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını piyasada kitleri (tablo malzemeleri görmek) istihdam ederek ölçmek.</li>
		<li>Hücre döngüsü inhibitörleri p53, p21, p16 Western Blot tarafından yüksek düzeyde onaylayın. Not: düzgün bu deneyleri denetlemek için ArCK nüfusu euploid ve aneuploid Bisiklete binme hücrelere göre olmalıdır. Eski düşük geçiş, katlanarak büyüyen yaban tipi RPE-1 hTERT hücreleri. İkinci RPE-1 hTERT kromozom mis segregasyon inducing ve sonra ilk anormal mitoz hücre 72 h hasat tarafından alınabilir. Bunu yapmak için ilk nocodazole tedavi (Adım 3.1) önce adım 1.1 ve hasat hücrelerden yukarıda açıklanan Protokolü uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Karyotip tutuklandı hücre değerlendirmek için tek hücreli sıralama gerçekleştirir. Not: Tek hücreli sıralama tek hücre düzeyi13hücre nüfus arasında kromozom ve alt kromozom değişiklikleri belirlemek için köklü bir yöntemdir. Tek hücreli sıralama gerçekleştirmeye ilişkin ayrıntılı yordamlar10başka bir yerde bulunabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy.">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li><li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer:+from+yeast+to+man.">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li><li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer.">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li><li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li><li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress,+senescence+and+cell+depletion.">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li><li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells.">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668 (2015).</li><li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability.">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754 (2016).</li><li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast.">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li><li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast.">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).</li><li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System.">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li><li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation.">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes &amp; Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li><li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine.">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li><li>L&#243;pez-Soto, A., Gonzalez, S., L&#243;pez-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes.">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li><li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown!.">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!.</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Oluşturmak ve karmaşık karyotypes (ArCK) ile tutuklandı hücreler için zenginleştirmek için bu roman yöntemi birden çok kromozom kazancı veya zararı var ve bölmek ateşkes hücreleri çalışma için sağlar. Yöntem kurulum hızlı ve güvenilir bir şekilde ArCK hücre izolasyon kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.
Bu tahlil en kritik adımda titizlikle ilaç tedavisi kronolojisi ve en önemlisi, aneuploid Bisiklete binme hücre kaldırma kontrol ediyor. En iyi sonuçlar için nocodazole tedavi ve shake-off onlar hala yuvarlak ve Mitotik, Mitotik hücre ölümü veya kayma olasılığı G1 içine önleme iken Bisiklete binme hücreleri plaka kaldırılır emin olmak için özellikle önem zamanı, potansiyel bir tetraploid nüfus oluşturma. Sallamak-off zamanlaması önerilen 12-h nocodazole kuluçka üzerinden iki saatten fazla sapma tavsiye edilmez.
Hücreleri nasıl karmaşık karyotypes daha derin bir anlayış kolaylaştırmak için potansiyel var ArCK gelecek çalışmalar hücre fizyolojisi etkiler. Özellikle, yeni yapılan bir çalışmada bağışıklık sistemi hücrelerinin ile etkileşim edebiliyoruz ve10ArCK tetikleyici bağışıklık Gümrükleme hücreleri gösterdi. Burada açıklanan yöntemi ArCK hücreleri bağışıklık izni dönüştürülmemiş hücrelere ve nasıl oncogenic dönüştürme çalışmanın temel moleküler mekanizmaları açıklama da dahil olmak üzere, daha fazla karakterizasyonu için mükemmel bir başlangıç noktası sağlar Bu gözetim mekanizması, alan14,15dakika içinde çok önemli bir soru atlamak.

Kromozom ayrımı sürecinde hataları anöploidi, haploit tamamlayıcı1,2,3,4katı değil bir kromozom sayısı ile karakterize bir durum neden. Aneuploid daha fazla genomik istikrarsızlık5,oluşturur tetikleyicisi çoğaltma stres karyotypes6,7,8,9,10, artırır karyotip karmaşıklık ve sonuçta bir subpopulation hücre10hücre döngüsü tutuklanması yol açar. Burada sunulan yöntemin amacı oluşturmak ve hücreleri Bisiklete binme böyle bir subpopulation ayrı etmektir. Ucuz doku kültürü teknikleri kullanarak, bu iletişim kuralı yalıtım ve hücre döngüsü tutuklandı karmaşık karyotypes aneuploid hücrelerle karakterizasyonu kolaylaştırır. Bu hücreler ArCK (karmaşık karyotip ile Arrested) hücreleri ve euploid Bisiklete binme karşılıkları denetimleri olarak adlandırılır.
Bu iletişim kuralı bu amaçla kurulacak Birincisi ve yalıtım için izin verir ve daha fazla dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, onların indüklenen yaşlanma ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip (SASP), onların pro-inflamatuar ArCK satırlarının çalışma özellikleri ve bağışıklık hücreleri ile girmeye yeteneklerini. Burada sunulan yöntem dönüştürülmemiş, ölümsüzleştirdi insan hücrelerinde geliştirilmiştir ancak kanser satırlarında henüz test edilmemiştir. Bazı dönüştürülmüş hücrelerin hücre döngüsü tutuklama bir veya birden çok yolları bastırılması nedeniyle duyarsız olabilir; Bu nedenle, daha fazla doğrulama diğer hücre satırlarında gerçekleştirilmesi gerekiyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="953">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:319px;">11995-073</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reversine</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10004412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p53 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:319px;">sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p21 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:319px;">sc-6246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p16 antibody</td>
			<td style="width:311px;">BD</td>
			<td style="width:319px;">554079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td style="width:311px;">Cell Signaling Technology&#160;</td>
			<td style="width:319px;">9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit&#160;</td>
			<td style="width:311px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:319px;">ARY005B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes

Kromozom mis segregasyon anöploidi, hücreleri bir dengesiz kromozom sayısı liman bir koşul için yol açar. Kanıt birkaç satırlık şiddetle o anöploidi genom istikrarsızlık, sonuçta onların yayılması tutuklamak karmaşık karyotypes içeren hücreleri üreten tetikler gösterir. Yalıtım ve karmaşık karyotypes yataklık hücrelerin karakterizasyonu bir dengesiz kromozom sayısı hücre fizyolojisi üzerinde etkisini incelemek büyük önem taşımaktadır. Bugüne kadar hiçbir yöntem güvenilir bir şekilde böyle aneuploid hücreleri izole etmek için kurulmuştur. Bu kağıt standart, ucuz doku kültürü teknikleri kullanan karmaşık karyotypes ile zenginleştirme ve aneuploid hücre analizi için bir protokol sağlar. Bu iletişim kuralı aneuploid hücrelerin çeşitli özellikler ile indüklenen yaşlanma ilişkili salgı fenotip, pro-inflamatuar özellikleri ve bağışıklık hücreleri ile etkileşim yeteneği de dahil olmak üzere karmaşık karyotypes analiz etmek için kullanılabilir. Kanser hücrelerinin kez dengesizlikler kromozom sayısı içinde liman çünkü anöploidi hem yanlısı ve anti tumorigenic etkileri ortaya çıkararak nihai hedefi ile normal hücrelerde hücre fizyolojisi nasıl etkilediğini deşifre önemlidir.

Bu yöntem bir vitro doku kültürü sistemi onların yayılması tutuklamak karmaşık karyotypes ile aneuploid hücreleri izole etmek için kullanır. Bu nüfus ArCK (Arrested karmaşık Karyotypes ile) hücreler olarak adlandırılır. Şekil 1A deney düzeni gösterir. Vahşi tipi Bisiklete binme RPE-1 hTERT hücreleri timidin G1/S sınırında eşzamanlı ve kromozom mis segregasyon ikna etmek için Mps1 inhibitörü ile tedavi. İğ zehir nocodazole hücrelere 72 h kromozom mis segregasyon indüksiyon sonra eklenir. 12 saat sonra nocodazole tedavi, hala çoğalırlar edebiliyoruz aneuploid hücreleri mitoz girin ve Mikrotubul polimerizasyonu ile girişim nedeniyle bu hücre döngüsü aşamasında sıkışıp kalırlar. Bunlar tuzağa hücreleri kolayca nazik sallamak-off tarafından kaldırıldı sonra. Sallamak-off işlem tekrarlanan 3 - 5 kere hücreleri Bisiklet tümüyle kaldırılmasını sağlamaktır. Şekil 1B 1 RPE hücrelerinin temsilcisi görüntüleri tedavinin her aşamasında gösterir.
ArCK hücreler, hücre döngüsü yavaşlatıcılar, p53, p21 ve euploid ve aneuploid hücreleri, Bisiklete binme şekil 2Agösterildiği gibi kıyasla p16 gibi daha yüksek düzeyde görüntüler. Ayrıca, şekil 2B olumlu β-galaktozidaz ile karşılaştırıldığında euploid kontrol hücreleri, ArCK hücrelerdeki hücresel yaşlanma köklü bir marker boyama gösterir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> Resim 2: ArCK hücreleri kullanan temsilcisi sonuçları. (A) Western blot değerlendirilmesi hücre döngüsü inhibitörü düzeyleri euploid, aneuploid Bisiklete binme ve ArCK hücreleri. P53, p21 ve p16 düzeyde western blot analizi ile belirlenmiştir. Aktin yükleme denetimi olarak görev yaptı. (B) β-galaktozidaz yaşlanma ArCK hücrelerdeki düzeyini değerlendirmek boyama. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktozidaz (β-Gal) faaliyet euploid hücreleri ve ArCK hücreleri tespit edilmiştir. Ölçek bar 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bu hücre döngüsü tutuklama aneuploid hücreleri ile karmaşık karyotypes, önemli bir özelliği tek hücreli ArCK hücreler birden çok, görüntüler şekil 3' te, rasgele kromozom kazançları ve kayıpları sıralama temsilcisi karyotip analizi tarafından gösterildiği gibidir. Bu bulgu önceki raporları10ile tam anlaşma mevcuttur.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> Şekil 3: temsilcisi tek hücreli sıralama ArCK hücrelerinin. Karyotip altı temsilcisi ArCK hücre gösterilen segmentasyon çizer. Segmentasyon araziler (vahşi RPE-1 kadın kökenli diploit hücre kültürünü türüdür) bir günlük2 ölçekte x 1 euploid başvuru göre kromozom tüm kopya sayısını gösterir. Kromozom kazançlar kırmızı, kromozom kayıp yeşil vurgulanır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes at JoVE.com

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Anöploidi sonunda karmaşık karyotypes içeren hücre döngüsü tutuklandı hücreleri üreten genom istikrarsızlık yol açar. Bu kağıt aneuploid hücreleri bölmek için ateşkes karmaşık karyotypes ile izole etmek için basit ve uygun bir yöntem sağlar.

Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

generation-isolation-cell-cycle-arrested-cells-with-complex

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.3K Görüntüleme.  Massachusetts Institute of Technology. Anöploidi sonunda karmaşık karyotypes içeren hücre döngüsü tutuklandı hücreleri üreten genom istikrarsızlık yol açar. Bu kağıt aneuploid hücreleri bölmek için ateşkes karmaşık karyotypes ile izole etmek için basit ve uygun bir yöntem sağlar.

Video: Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a common mechanism of disease progression and a prognostic-determinant feature of malignant tumors. In prostate cancer (PC), resistance to MTAs such as the taxane Docetaxel dictates treatment failure as well as progression towards lethal stages of disease that are defined by a poor prognosis and high mortality rates. Though studied for decades, the array of mechanisms contributing to acquired resistance are not completely understood, and thus pose a significant limitation to the development of new therapeutic strategies that could benefit patients in these advanced stages of disease. In this protocol, we describe the generation of Docetaxel-resistant prostate cancer cell lines that mimic lethal features of late-stage prostate cancer, and therefore can be used to study the mechanisms by which acquired chemoresistance arises. Despite potential limitations intrinsic to a cell based model, such as the loss of resistance properties over time, the Docetaxel-resistant cell lines produced by this method have been successfully used in recent studies and offer&#160;the opportunity to advance our molecular understanding of acquired chemoresistance in lethal prostate cancer.

Resistance to cancer therapies contributes to disease progression and death. Determining the mechanistic underpinnings of resistance is crucial for improving therapeutic response. This manuscript details the protocol to generate taxane-resistant cell models of prostate cancer (PC) to help dissecting the pathways involved in progression to Docetaxel resistance in PC patients.

Prostat kanseri hücre modelleri Anti-Mitotik Ajan Docetaxel direnç üretimi

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Kanser Araştırmaları

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been shown to be responsible for tumor initiation, metastasis, and drug resistance. Therefore, it is important to develop specific TIC-targeting therapy in addition to current chemotherapy strategies, which mostly focus on the bulk of non-TICs. In order to further understand the mechanism behind the malignancy of TICs, we describe a method to isolate and to characterize TICs in human sarcomas. Herein, we show a detailed protocol to generate patient-derived xenografts (PDXs) of human sarcomas and to isolate TICs by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using human leukocyte antigen class I (HLA-1) as a negative marker. Also, we describe how to functionally characterize these TICs, including a sphere formation assay and a tumor formation assay, and to induce differentiation along mesenchymal pathways. The isolation and characterization of PDX TICs provide clues for the discovery of potential targeting therapy reagents. Moreover, increasing evidence suggests that this protocol may be further extended to isolate and characterize TICs from other types of human cancers.

We describe a detailed protocol for the isolation of tumor-initiating cells from human sarcoma patient-derived xenografts by fluorescence-activated cell sorting, using human leukocyte antigen-1 (HLA-1) as a negative marker, and for the further validation and characterization of these HLA-1-negative tumor-initiating cells.

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their antigen presentation and T cell activation capacities. Since most vaccinations of experimental tumor models require millions of DC, they are widely isolated from the bone marrow or spleen. However, these DC significantly differ from blood and tumor DC in their responses to immune complexes (IC), and presumably to other Syk-coupled lectin receptors. Importantly, given the sensitivity of DC to danger-associated molecules, the presence of endotoxins or antibodies that crosslink activation receptors in one of the isolating steps could result in the priming of DC and thus affect the parameters, or at least the dosage, required to activate them. Therefore, here we describe a detailed protocol for isolating MoDC from blood and tumors while avoiding their premature activation. In addition, a protocol is provided for MoDC activation with tumor IC, and their subsequent analyses.

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Monocyte-derived DC (MoDC) can sense minor amounts of danger-associated molecules and are therefore easily primed. We provide a detailed protocol for the isolation of MoDC from blood and tumors and their activation with immune complexes while highlighting key precautions that should be considered in order to avoid their premature activation.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor environment and cell-cell interactions. Identification of cancer and stem cell interactions, including changes in extracellular environment, physical interactions, and secreted factors, might enable the discovery of new therapy options. We combine known co-culture techniques to create a model system for mesenchymal stem cells (MSCs) and cancer cell interactions. In the current study, dental pulp stem cells (DPSCs) and PC-3 prostate cancer cell interactions were examined by direct and indirect co-culture techniques. Condition medium (CM) obtained from DPSCs and 0.4 &#181;m pore sized trans-well membranes were used to study paracrine activity. Co-culture of different cell types together was performed to study direct cell-cell interaction. The results revealed that CM increased cell proliferation and decreased apoptosis in prostate cancer cell cultures. Both CM and trans-well system increased cell migration capacity of PC-3 cells. Cells stained with different membrane dyes were seeded into the same culture vessels, and DPSCs participated in a self-organized structure with PC-3 cells under this direct co-culture condition. Overall, the results indicated that co-culture techniques could be useful for cancer and MSC interactions as a model system.

We provide protocols for evaluation of mesenchymal stem cells isolated from dental pulp and prostate cancer cell interactions based on direct and indirect co-culture methods. Condition medium and trans-well membranes are suitable to analyze indirect paracrine activity. Seeding differentially stained cells together is an appropriate model for direct cell-cell interaction.

Mezenkimal kök hücre izolasyon hamuru doku ve kanser hücreleri ile ortak kültür ilişkileri incelemek için

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced killer (CIK) T cell therapy has been reported to exert significant cytotoxic effects against cancer cells and to reduce the adverse effects of surgery, radiation, and chemotherapy in cancer treatments. CIK can be derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), bone marrow, and umbilical cord blood. CIK cells are a heterogeneous subpopulation of T cells with CD3+CD56+ and natural killer (NK) phenotypic characteristics that include major histocompatibility complex (MHC)-unrestricted antitumor activity. This study describes a qualified, clinically applicable, flow cytometry-based method for the quantification of the cytolytic capability of PBMC-derived CIK cells against hematological and solid cancer cells. In the cytolytic assay, CIK cells are co-incubated at different ratios with prestained target tumor cells. After the incubation period, the number of target cells are determined by a nucleic acid-binding stain to detect dead cells. This method is applicable to both research and diagnostic applications. CIK cells possess potent cytotoxicity that could be explored as an alternative strategy for cancer treatment upon its preclinical evaluation by a cytometer setup and tracking (CS &#38; T)-based flow cytometry system.

Here, we present a protocol to perform the isolation and expansion of peripheral blood mononuclear cells-derived cytokine-induced CD3+CD56+ killer cells and illustrate their cytotoxicity effect against hematological and solid cancer cells by using an in vitro diagnosis flow cytometry system.

Kanser Tedavisi için Sitotoksik Sitokin Kaynaklı Katil T Hücrelerinin İzolasyon ve Genişlemesi

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and composition. It is based on a microsurgical procedure designed to catheterize the trachea and aorta of a euthanized mouse to perfuse the heart and lungs with decellularizing agents. The decellularized cardiopulmonary complex can subsequently be immunostained to reveal the location of structural ECM proteins. The whole procedure can be completed in 4 days.
The ECM scaffolds resulting from this protocol are free of dimensional distortions. The absence of cells enables structural examination of ECM structures down to submicron resolution in 3D. This protocol can be applied to healthy and diseased tissue from mice as young as 4-weeks old, including mouse models of fibrosis and cancer, opening the way to determine ECM remodeling associated with cardiopulmonary disease.

This protocol aims to decellularize the heart and lungs of mice. The resulting extracellular matrix (ECM) scaffolds can be immunostained and imaged to map the location and topology of their components.

Murine Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücreden Arındırılması

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...