Bu eser tarafından destek sayesinde mümkün yapıldı: Pavia Üniversitesi FRG 2016; Parma Üniversitesi FIL 2014, 2016; ve bu çalışma taşımak için gerekli plasticware temini için Kinesis. Dr. Shane Windsor (Mühendislik Fakültesi, University of Bristol, İngiltere) Cell_PIV yazılım sağlamak için teşekkür ederiz.

Tüm yordamları hayvanları içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım ve Pavia Üniversitesi, etik Komiteler tarafından kabul edildi. Hayvanlar 22 ° C, % 60'ı hava nemi ve 12:12 saat ışık/karanlık döngüsünü koşullar altında muhafaza.
1. yumurtalık yalıtım
<ol><li>İntraperitoneally 2 dört onbir haftalık CD1 dişi fareler 10 U folikül uyarıcı hormon bir steril 1 mL insülin şırınga ile enjekte.</li>
	<li>46-48 h bekleyin.</li>
	<li>Fare tartmak ve 50 mg/kg Zoletil (Tiletamina ve Zolazepan cloridrate) bir kas içi enjeksiyon ile anestezi. Servikal çıkığı tarafından ötenazi.</li>
	<li>Diseksiyon forseps bir çift kullanarak karın duvarı kaplayan deri kavramak. Cilt ve vücut duvar makas çifti ile kesmek ve belgili tanımlık kesme Forseps ile çekerek açın.</li>
	<li>Bir çift cımbız kullanarak, cesaret bir yana, rahim boynuzları kesin olarak belirlemek ve onların ekstremite, yumurtalık yerelleştirmek taşıyın.</li>
	<li>Yavaşça saatçi forseps kullanarak yumurtalık tutun ve onun bağ rahim kesmek için makas kullanın. Diğer yumurtalık ile yineleyin.</li>
	<li>Toplanan yumurtalık içine önceden 37 ° c, % 5 CO2 havada sıcak M2 yalıtım orta 1 mL içeren 35-mm hücre kültür Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Yağ ve bir stereomicroscope altında iyi makas kullanarak ovidukt kaldırın.</li>
</ol>2. izolasyon Cumulus oosit kompleksleri
<ol><li>Antral kümülüs oosit kompleksleri (COCs) pasif serbest kadar steril cımbız ve 1 G steril insülin iğne kullanarak yumurtalık yüzey delik.</li>
	<li>Üçten fazla katmanları bir ağız kontrollü el çekti Pasteur micropipette (çapı 200 µm) kullanarak kümülüs hücreleri ile COCs toplamak ve taze M2 orta 300 µL damla aktarabilirsiniz.</li>
	<li>Bir el çekti Pasteur micropipette (çapı 80 µm) kullanarak yumurta çevreleyen kümülüs hücreleri yavaşça girip kaç saniye pipetting tarafından kaldırmak,</li>
	<li>Kümülüs hücreleri tamamen ortadan kalkar kadar tekrar tekrar yumurta M2 orta 20 µL damla--dan başka bir, aktarabilirsiniz.</li>
</ol>3. Kromatin organizasyon tabanlı oosit sınıflandırma
<ol><li>Höchst 33342 boyama çözüm 0,05 µg/mL olarak 5 mg/mL 1 x PBS içinde seyreltilmiş bir anne çözümden M2 orta başlayarak nihai bir konsantrasyon, hazır olun.</li>
	<li>3.5 µL çözüm bir 35 mm Petri kabına kapak altındaki boyama Höchst mikro damlacıkları yerleştirin.</li>
	<li>Her tek yumurta bırakma boyama bir Höchst aktarmak, Önceden ısıtılmış (37 ° C) ısıtma yüzeyi üzerine tabak yerleştirin ve ışık Fuar önlemek için karanlık bir kapak ile kapak.</li>
	<li>Kuluçka oda sıcaklığında 10 dakika sonra yumurtalar için en fazla 1-2 s ile floresan mikroskop altında UV ışık (330-385 nm), 10 X büyütme, gözlemlemek.</li>
	<li>Höchst pozitif Kromatin çekirdekçik çevreleyen bir yüzük varsa yumurta çevrili çekirdekçik (SN) (şekil 1A), sınıflandırmak.</li>
	<li>Yumurta onların çekirdekçik Höchst pozitif Kromatin tarafından çevrili değil ve gösterir (şekil 1B) çekirdeği heterochromatic noktalar dağıtmak değil çevrili çekirdekçik (NSN), sınıflandırmak.</li>
</ol>4. sinirsel ağ tabanlı oosit sınıflandırma
<ol><li>Dört hazırlamak %5 ısı inaktive fetal sığır serum, 2 mM L-glutamin, 5 mM taurin, 100 U/mL penisilin, 75 µg/mL streptomisin ve 23.5 µg/µL sodyum pyruvate 35-mm cam içine ile takıma α-MEM orta 2 µL damlacıkları Petri kabına alt ve onlarla kapak Önceden ısıtılmış (37 ° C) ve orta buharlaşma önlemek için önceden dengelenmiş madeni yağ. Not: canlı bir hücre-tarama sistemi kullanılıyorsa, damla belirli bir mesafede 7 x 7 mm çizilmiş bir kılavuz bir kılavuz olarak kullanarak kalmasını sağlayın.</li>
	<li>Transfer 3 - 4 yumurta her damla için.</li>
	<li>Hızlandırılmış kayıt yazılımı ile donatılmış bir canlı hücre-tarama sistemi cam alt Petri kabına yerleştirin ( Tablo malzemelerigörmek, gözlem oosit olgunlaşma dengeli sıcaklık (37 ° C) ve CO2 olan bir ortamda sağlayan) konsantrasyonu (% 5).</li>
	<li>Hızlandırılmış kayıt yazılımı açın. Ekranda sol taraftaki oosit ve sağ taraftaki tüm ayar düğmeleri canlı bir atış ile bir pencere görüntülenir.</li>
	<li>Ekran Merkezi'nde konumlandırmak için oosit Merkezi'ni seçin. Odağı ayarlayın.</li>
	<li>Ph düğmesini seçin ve DIA lamba 192 ayarlayın; pozlama süresi için 1/125 s; kazanmak için 1,99; ve 1600 x1200 Çözünürlük .</li>
	<li>FL2 seçin ve DIA lamba 5olarak ayarlayın; pozlama süresi için 3 s; kazanmak için 2.37; ve 1600 x1200 Çözünürlük .</li>
	<li>Kültür damla içindeki yumurta konumunu kaydetmek için Yenigelin düğmesini seçin. Kültür damla içinde her yumurta için aynı yordamı yineleyin.</li>
	<li>Zaman seçin ve satın alma döngüsü 8 dk ve 15h Toplam süre ayarlayın.</li>
	<li>Kayıt döngüsü başlatmak için hızlandırılmış Başlat ' ı seçin.</li>
	<li>MATLAB yazılımını açın ve yazmak >>cell_piv; ve PIV aracınıseçin.</li>
	<li>Kaydedilmiş filmi içeren klasörü seçin ve tüm görüntü sırası yüklemek için .jpeg dosyalarını seçin. Her yumurta için faiz (ROI) bölgenin alanı aracını seçintıklatarak seçin.</li>
	<li>İşlem PIV Dosya menüsünden seçin. Görüntüleyicisi aracı düğmesini seçin. Not: Program hız vektörel çizimler içinde yatırım Getirisi hesaplar ve otomatik olarak bir .mat dosyası olarak kaydedilmiş bir veri dosyası oluşturur.</li>
	<li>.Mat dosyayı açmak için seçin. Düğmesini seçin ROI aracını seçin ve oosit anahattı çevresinde bir daire çizin. Dosya menüsünde Kaydet'i tıklatın. Not: Bu bölgedeki vektörel çizimler, şimdi görüntülenir ve ortalama büyüklükte veri grafik penceresinde bu yeni yatırım Getirisi için güncelleştirildi.</li>
	<li>Açık bütün zaman atlama kare toplanan ortalama büyüklükte veri ile kare dizisinin satırları üzerinde ve sütunlar, bir elektronik tabloya analiz her tek yumurta kaydetti.</li>
	<li>NSN ve SN yumurta verileri 10 alt grupları düzenlemek.</li>
	<li>Besleme-ileri yapay sinir ağı yinelemeli olarak eğitmek için 9 alt grupları kullanın (FANN) ve kör test etmek için 1 alt grubu.<ol>
<li>Başka bir yineleyin 9 kez, kör test örnek (10 kat çapraz doğrulama) değiştirme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MATLAB açın, ana özel komut dosyası çalıştırma ve talebi üzerine, eğitim veri (train.txt), (genellikle, üzerinden analiz edilecek eğitim ve hızlandırılmış aralığı için kullanılan NSN ve SN yumurta sayısı ile dosya adını Ekle # 112-113 Çerçeve çerçeve 1-2).</li>
	<li>Eğitim gerçekleştirmek için girmek tuşuna basın.</li>
	<li>Sınama verileri (test.txt) ile dosya adını ekleyin.</li>
	<li>Vektör test_outputs_cyt MATLAB çalışma alanında açın. Not: Bir pencere, ilk satırda, gerçek pozitif (TP veya gerçek NSN) ve yanlış pozitif (FP veya yanlış NSN) NSN ve SN yumurtalar için sırasıyla elde etmek için olasılık gösterilen ekranda görünür; Bunun yerine, ikinci sıra, yanlış negatif (FN veya yanlış SN) ve yumurta, NSN ve SN için doğru negatifleri (TN veya gerçek SN) sırasıyla elde etmek için olasılık.</li>
	<li>Formülünü kullanın: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), yüzde ifade edilen FANN doğruluk hesaplamak için.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte.">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li><li>Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+value+of+oocyte+morphology+in+human+IVF:+a+systematic+review+of+the+literature.">Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature.</a> Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).</li><li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+configurations+in+the+germinal+vesicle+of+mammalian+oocytes.">Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes.</a> Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).</li><li>Vigone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+based+identification+of+mouse+cumulus+cell+markers+that+predict+the+developmental+competence+of+their+enclosed+antral+oocytes.">Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes.</a> BMC Genomics. 14, 380 (2013).</li><li>Bui, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+movement+profiles+of+mouse+surrounding+nucleolus+and+not-surrounding+nucleolus+antral+oocytes+during+meiotic+resumption.">Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption.</a> Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).</li><li>Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organisation+and+nuclear+architecture+in+growing+mouse+oocytes.">Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).</li><li>Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+it+take+to+make+a+developmentally+competent+mammalian+egg?.">What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?.</a> Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).</li><li>Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+oocyte+nucleus+and+cytoplasm+to+the+determination+of+meiotic+and+developmental+competence+in+mice.">Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice.</a> Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).</li><li>Ajduk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+actomyosin-driven+contractions+induced+by+sperm+entry+predict+mammalian+embryo+viability.">Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability.</a> Nat. Commun. 2, 417 (2011).</li><li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-&#950;-induced+Ca2++oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Phospholipase C-&#950;-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li><li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed+forward+artificial+neural+network:+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer.">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li><li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network:+A+Review.">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bir fare yumurta yanı sıra bu diğer türler ile bu iletişim kuralı yaparken dikkat çekmek birkaç kritik adım vardır. Arkadaşı kümülüs ayrılması Tetikleyicileri hücreleri gibi bir zamanlar onların köklerinin yumurtalar hemen kayıt damla aktarılması gerektiğini GV MII geçişin başlangıcını. Olası bir değişiklik mevcut iletişim kuralına COCs yalıtımı için kullanılan M2 orta 3-İzobütil-1-methylxanthine (IBMX) ek olabilir. IBMX hemen GV MII geçiş tetikleyen engeller ve yumurtalar tama...

Kadın kısırlığı kadınlar giderek artan sayıda etkiler bir patoloji olduğunu. Dünya Sağlık Örgütü göre çiftlerin % 20 civarında infertil kadın infertilite nedeniyle % 40 ile. Buna ek olarak, kanser tedavisi gören kadınların üçte biri (300.000/yıl ve 30.000/yıl ABD yada İtalya, sırasıyla) erken yumurtalık yetmezliği geliştirmek.
Kanser hastalarında infertilite önlemek için bir strateji yalıtım ve dondurma vitro olgunlaşma (IVM) tarafından takip Onkolojik tedavi öncesi yumurtalık köklerinin GV yumurta MII sahneye (GV MII geçiş) olmuştur. Non-invaziv işaretleri oosit gelişimsel yetki durumu gübreleme ve gelişim süreçleri ve genel gebelik başarı1,2artıracak.
Supravital fluorochrome Höchst 33342, ile boyama sonra gözlenen onların Kromatin yapılandırmasına göre memeli köklerin yumurtalar bir çevrili çekirdekçik (SN) veya değil çevrili çekirdekçik (NSN)3olarak sınıflandırılır. Onların farklı Kromatin organizasyon yanı sıra yumurta bu iki tür pek çok morfolojik ve fonksiyonel farklılıklar3,4,5,6,7,8 görüntülemek. ,9onların segregasyonun ve gelişimsel yeterlilik dahil olmak üzere,. Yumurtalıktan izole ve olgunlaştı vitro, her ikisi de yumurta eriþiminden MII sahne yazın ve sonra sperm tohumlama, 2-hücre Sahne Alanı'na geliştirmek, ama sadece bu SN Kromatin kuruluş ile dönem9' a gelişebilir. İyi olmamakla birlikte yetkili vs beceriksiz yumurta seçmek için bir sınıflama yöntemi, en büyük dezavantajı fluorochrome kendisi ve her şeyden önce onun algılama için kullanılan UV ışık hücreleri üzerinde olabilir mutajenik etkisi olduğunu.
Tüm bu nedenlerden dolayı aynı yüksek sınıflandırma doğruluğu korurken Höchst kullanımı yerine olabilir SN veya NSN Kromatin uyum ile ilişkili diğer non-invaziv işaretçileri için aradık. Sitoplazmik hareket hızları (CMVs) hızlandırılmış gözlem bir özellik olarak hücre durumu farklı çıkmaktadır. Örneğin, son yıllarda yapılan çalışmalarda zamanda gübreleme ve fare ve insan zigotları kapasitesi tam Preimplantasyon ve tam dönemlik geliştirme10,11CMVs arasındaki ilişkiyi kaydedilen gösterdi.
Bu daha önceki çalışmalar üzerinde bağlı olarak, biz burada gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta5,6,7,8tanınması için bir platform tanımlamak. Platform üzerinde üç ana adım dayanmaktadır: 1) antral folikül izole yumurta ilk olarak çevrili çekirdekçik (SN) ya da değil-çevrili çekirdekçik (NSN); onların Kromatin yapılandırmasına ya göre sınıflandırılır 2) her tek yumurta GV MII geçişi sırasında meydana gelen CMVs hızlandırılmış görüntülerini alınır ve analiz partikül imaj velosimetri (PIV); ve 3) PIV ile elde edilen veriler ile bir besleme ileri yapay sinir ağı (FANN) kör sınıflandırma12,13analiz edilir. Fareyi test ve diğer memeli türler için (Örneğin, sığır, maymun ve insanlar) kullanılan mevcut hazır yapmak için tasarlanmış yordam en kritik adımları ayrıntılarını ver.

<table><tbody><tr><td>Folligon</td><td>Intervet</td><td>A201A02</td><td>Hormonal treatment</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>For oocyte heterochromatin staining</td></tr><tr><td>Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430165</td><td>For COCs isolation</td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red</td><td>Merck-Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>For COCs isolation</td></tr><tr><td>MEM Alpha medium (1X) + Glutamax&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td>For oocyte in vitro maturation</td></tr><tr><td>Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom&amp;nbsp;</td><td>WillCo&amp;nbsp;</td><td>GWSt-3522</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>BioStation IM-LM&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MFA91001</td><td>Live cell screening system&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>Delchimica Scientific Glassware</td><td>6709230</td><td>For follicles manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>To prevent contamination and medium evaporation</td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>To prevent medium contamination&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML16141079</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3310</td><td>For making up &amp;alpha;MEM media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;P4562</td><td>For making up &amp;alpha;MEM media</td></tr><tr><td>Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate)</td><td>Virbac Srl</td><td>QN01AX9</td><td>For mice anesthesia</td></tr><tr><td>Cell_PIV sofware&amp;nbsp;</td><td>Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Natick, MA&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td><td>For multi-paradigm numerical computing</td></tr></tbody></table>

a neural network-based identification of developmentally competent or incompetent mouse fully-grown oocytes

Kısırlık klinikler beceriksiz yumurta gelişim yetkili vs böylece genel gebelik sonucu artırmak non-invaziv yordamları kullanarak seçmek için yeteneğinden yararlanırlar. Biz son zamanlarda geliştirilen sitoplazmik hareketleri analiz tarafından takip metafaz II sahneye germinal vezikül (GV)--dan onların vitro olgunlaşma sırasında fare yumurtalar, mikroskobik canlı gözlem dayalı bir sınıflama yöntemi hızlandırılmış bu dönemde meydana gelen. Burada, bu yordamın ayrıntılı protokolleri mevcut. Yumurtalar köklerin antral folikül izole ve 37 ° C ve % 5 CO2hızlandırılmış analiz için donatılmış bir mikroskop içinde 15 h için kültürlü. Resimler 8 dk aralıklarla alınır. Görüntüleri hesaplar, her yumurta için sitoplazmik hareket hızları (CMVs) kültür süresince meydana gelen profil partikül imaj velosimetri (PIV) yöntemi kullanılarak analiz edilir. Son olarak, her tek yumurta CMVs gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz %91.03 bir hassasiyetle olmak bir gamet olasılığını öngörür bir matematiksel sınıflandırma aracı (Feed-ileri yapay sinir ağı, FANN), üzerinden beslenir. Bu iletişim kuralı için fare, kurmak, şimdi insanlar da dahil olmak üzere diğer türlerin yumurta üzerinde test olabilir.

Şekil 2 bir temsilcisi gelişimsel olarak yetkili ve beceriksiz oosit sırasıyla (GV) başında ve sonundaki (MII) IVM yordamı gösterir. Köklerin fare yumurta IVM 15 h kültür sırasında oluşur. Hızlandırılmış gözlem mayoz ilerleme kaydeder ve GVBD ve Ekstrüzyon ilk kutup vücudun da dahil olmak üzere önemli segregasyonun olayları algılar.
Analiz ve daha--dan iki - yüz beceriksiz...

Watch this Scientific Journal Video about A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes at JoVE.com

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Burada, non-invaziv oosit gelişimsel yetkinlik metafaz II sahneye germinal vezikül--dan onların vitro olgunlaşma sırasında gerçekleştirilen değerlendirilmesi için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem zaman hata görüntüleme partikül imaj velosimetri (PIV) ve neural ağ analizleri ile birleştirir.

Bir Neural ağ tabanlı kimlik gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

a-neural-network-based-identification-developmentally-competent-or

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Görüntüleme.  University of Pavia. Burada, non-invaziv oosit gelişimsel yetkinlik metafaz II sahneye germinal vezikül--dan onların vitro olgunlaşma sırasında gerçekleştirilen değerlendirilmesi için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem zaman hata görüntüleme partikül imaj velosimetri (PIV) ve neural ağ analizleri ile birleştirir.

Video: A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Gelişim Biyolojisi

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetik

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

Yetişkin Fare Yumurtalıklarında Doğru Folikül Numaralandırması

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Farelerin Profaz Tutuklu Oositlerinde DNA Hasarının Belirlenmesi

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Yazar Spotlight: Memeli Oositlerinde ve Preimplantasyon Embriyolarında DNA Hasar Tepkisini Anlamak 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Bir Neural ağ tabanlı kimlik gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

Yetişkin Fare Yumurtalıklarında Doğru Folikül Numaralandırması

Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi