Name: preparation of primary acute lymphoblastic leukemia cells in different cell cycle phases by centrifugal elutriation
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation at JoVE.com

Bu eser NIH CA109821 (TCC için) tarafından desteklenmiştir. Beckman Coulter cömertçe yayın maliyetlerini karşılamak için fon sağlamak için ve teknik yardım kurulum ve elutriation sisteminin çalışması için teşekkür ederiz. Biz Dr Fred Falkenburg ilk İlköğretim tüm kültürler için teşekkür ederiz.

Not: bu protokolü birincil B-tüm 13 µm (G2/M aşama) için yaklaşık 8 µm (G1 evresi) üzerinden çapı değişen hücreleri için optimize edilmiştir. Böylece, belirli santrifüj hızları ve pompa akış oranları farklı boyut aralıkları içeren hücreler için geçerli olmayabilir. Yine de, uygun elutriation parametreleri sedimantasyon hızı denklemi kullanarak tahmin edilebilir. Hücreleri tanımlanmış bir serum-Alerjik Orta olarak açıklanan 16 / 1-3 x 10 6 hücre/mL en uygun bir yoğunluk, kültürlü. Buz-serin borular kullanarak 4 ° C'de yürütülen topluluğu kesirler hariç, oda sıcaklığında ve en fazla 24 20 ° C'de ayarla santrifüj tüm adımları yapılmaktadır ° C.
 1. hazırlık Elutriation tampon ve malzeme hücrelerinin topaklanma azaltmak, Hank, bir elutriation arabellek hazırlamak için <ol><li>&#39; s fenol kırmızı takıma % 2 fetal sığır serum () ile tuzlu çözüm (HBSS) dengeli Elutriation süreci ve 1.6 g/M 2-naftol-6,8-disulfonic asit dipotassium tuz (NDA), olumsuz ücret hücre dış işler ve topaklanma azaltır sırasında mekanik stres hücreleri korumak için FBS).
	<ol><li>NDA 1.6 g 50 mL konik tüp ekleyin.</li>
		<li>Steril koşullarda, HBSS 35 mL 1 L şişeden NDA içeren 50 mL konik tüp ekleyin. NİV eriyene kadar tüp girdap.</li>
		<li>0.2 µm filtre kullanarak yeni bir steril 50 mL konik tüp içine çözünmüş NİV transfer. HBSS kalan 1 L için NİV ekleyin.</li>
		<li>Son olarak son konsantrasyonu % 2 (v/v) elde etmek için HBSS 21 mL FBS ekleyin. 
		Not: Elutriation arabellek olabilir hazırlanmış ve HBSS veya kadar pH büyük bir değişiklik bir göstergesi boya sararma tarafından belirtildiği şekilde sona erme tarihine kadar 4 ° C'de depolanan.</li>
	</ol></li> <li>Böylece etiketli tüpler 1 ve 2 (W1 ve W2), kesirler 1-20 (F1 - F20) yıkama ve DURDURMAK 50 mL konik tüpler kesirler topluluğu için etiket.
	<ol><li>Bu tüpler buzda kesirleri toplama önce önceden chill.</li>
	</ol></li></ol> 2. Derleme Elutriation sisteminin <ol><li>önce yükleyin strobe derleme santrifüj böylece güç kablosunu dışarı sol tarafındaki bağlantı noktası ile odaya besleniyor. Santrifüj kapatıldığında bu görüntüleme penceresi ile aynı hizada şekilde flaş flaş lamba odası ön tarafta olduğundan emin olun.
	<ol><li>İlk başta-in belgili tanımlık her destek iki delik içine iki-yıldız tornavida vida sıkma ve yanında parmak vidası her dirseğinin dibinde sıkma tarafından derleme yerde güvenli.</li>
		<li>Flaş güç bağlantı santrifüj arkasındaki güç kablosunu takın.</li>
	</ol></li> <li>Sonra rotor santrifüj sürücü hub düz aşağı ve T-kolu onaltılık anahtarıyla güvenli. 
	Not: santrifüj elutriation olmayan amaçlar için gerekli değilse, strobe derleme ve rotor santrifüj arasında çalıştırır içinde tutulabilir.</li>
	Rotor güvenli bir kez, <li>mühür montaj ve montaj plakası rotor döner içeren elutriation odası, sayaç ayarı, hızlı çıkarma derleme yerleştirin.
	<ol><li>Aşağı doğru itin eşit tek eliyle elutriation odası ve sayaç denge Öte yandan Open End civatalar Montaj plakası üzerinde delik içine snap kadar.</li>
		<li>Son olarak, pin kablo bir tarafında dönen mühür derleme deliğe yerleştirip sol tarafında o dirsek üzerinde biriyle (2.1.1 içinde belirtilen)-yıldız tornavida vidaları kablonun diğer tarafında eyehole güvenliğini sağlama bağlantı kablosunu takın f odası.</li>
	</ol></li> <li>Sonra bir değişken hız pompa kullanarak akış sistemi montajı ve pompa arabelleğe elutriation boru Kamara ve toplamak arabellek elutriation odadan akarken.
	<ol><li>Değişken hızlı pompa üst bağlantı noktası üzerinden gelen boyutu 16 giriş boru yaptı santrifüj TMMOB odasına girer böylece INSERT.</li>
		<li>Uygun bir ücretsiz giriş hortumunun sonuna eklemek ve dönen mühür derleme tarafında giriş deliği montaj takın.</li>
		<li>Boyutu 16 bağlantı noktası üzerinden boru çıkış ve transferi tüp dönen üst ekleyin Ekle mühür derleme. 
		Not: Akış sistemi de elutriation çalışmaları arasında birleştirilmiş kalabilir.</li>
	</ol></li> <li>Son olarak, santrifüj açmak ve teknik özellikleri deneme için gereken şekilde ayarlayın.
	<ol><li>Değişiklik rotor kimliği.</li>
		<li>Santrifüj zaman giriş gerektiriyorsa, çalıştırmak bir elutriation tamamlamak daha--dan yeterli 2 h için ayarla.</li>
		<li>İle maksimum geçici 24 + 20 ° C sıcaklık ayarla ° C.</li>
		<li>Max için hızlanma ve yavaşlama için yavaş ayarla.</li>
		<li>Son olarak, 867 x g. hıza ayarlayın</li>
	</ol></li></ol> 3. Elutriation sistemi priming ilk elutriation sistem sterilize etmek, rezervuar boru %5 çamaşır suyu içeren bir 500 mL plastik şişe içine yerleştirin ve çıkış boru boş 1 L plastik atık şişe içine yerleştirmek için <ol><li>.
	<ol><li>Pompa açmak ve 25 mL/dk için hızını ve %5 çamaşır suyu atık şişe içine çıktı tüp dışarı pompalanır kadar sonuna kadar elutriation sistemi üzerinden akmasına izin.</li>
		<li>Santrifüj açmak ve hız (867 x g) serbest kabarcıklar ve backpressure için belirlenmiş maksimum gelmesini izin.</li>
		<li>Santrifüj durdurmak. Rotor döner durdu sonra kapağını açmak ve herhangi bir sızıntı için odası incelemek.</li>
		<li>Hiçbir sızıntı varsa, çamaşır suyu çözüm izin en az 5 dakika süreyle sistem ile akışı</li>
	</ol></li> <li>Çamaşır suyu hangi kurşun hücreleri topaklanma için hem de hücreleri zarar elutriation arabellek precipitates oluşumu için kurşun gibi daha sonra autoclaved su ile sistem floş.
	<ol><li>Ve su ile en az 10 dk. temizlemek izin yer autoclaved 1 L şişe içine rezervuar boru</li>
	</ol></li> <li>Su ile yıkama sonra elutriation arabellek sisteme tanıtmak. Elutriation arabellek ve hücreler için su deposu oluşturmak için autoclaved olmuştur 150 mL cam şişe kullanın.
	<ol><li>Elutriation arabellek 100 mL şişe ekleyin ve tüp çok altında olması rezervuar cam şişe Boru taşımak.</li>
		<li>Ve suyu floş için sistemi aracılığıyla akış arabellek izin santrifüj başlayın.</li>
		<li>Arabellek sistem üzerinden geri dönüştürülmüş böylece çıkış atık şişe için rezervuar boru rezervuar şişe neredeyse boş ve su tamamen sistemden aktarılmadan kez hareket.</li>
	</ol></li> <li>Son olarak, izleme penceresi geçerli hızda elutriation odası görülebilir şekilde ayarlayın.
	<ol><li>Basın flaş lamba güç düğmesi santrifüj dışındaki böylece lamba yanar. Elutriation k açmaksantrifüj sol sonuna kadar dışarıdan da Nob.</li>
		Elutriation odası görünümü ve strobe ışık gelene sağdaki düğmeyi rotor dönüşü ile zamanında edip inceleyen pencereden yavaş yavaş <li>çevirmek. 
		Not: hücreleri prepped kadar elutriation sistemi bu durumda bırakılabilir.</li>
	</ol></li></ol> 4. Hücre örneği hazırlanması <ol><li>Kont hücreleri ve aliquot 300-400 milyon içinde büyüme orta birkaç 50 mL konik tüpler içine. Spin aşağı vasıl 1210 x g 3 dakika süreyle hücre</li>
	<li>Aspiratı büyüme medya ve resuspend hücreleri yukarı ve aşağı yavaşça pipetting tarafından elutriation arabellek 25 ml.</li>
	Azaltmak için <li>topaklanma hücre, bir 25 ile iki kez geçiş hücreleri iğne ölçmek.
	<ol><li>10 mL şırınga kullanarak hücreleri çizin ve sonra 25 gauge iğne takmak ve hücreler arasında iç geçmek bir steril 50 mL konik tüp duvarına. Tüm 25 mL geçti kadar iğne ile bu işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Yeni iğne ve şırınga elde etmek ve bir kez yukarıda tekrarlayın. 
		Dikkat: Şırınga iğneleri "Sharps" kaplarda yerleştirilmelidir. 
		Not: Bu hücreleri iğne ile daha önce hemen onları tanıştırmak elutriation sisteme hücre minimumda topaklanma tutmak için itilir bu önemlidir.</li>
	</ol></li></ol> 5. Hücre örnek giriş içine belgili tanımlık Elutriation sistemi ve kesirler koleksiyonu <ol><li>tanıtmak hücre örnek hücre örnek üzerinden geri dönüşüm kalan elutriation tampon vardır rezervuar tankı içine dökme tarafından elutriation sistemine .
	<ol><li>İzin girmek belgili tanımlık sistem ve denge elutriation odası içinde ulaşmak hücreleri. 
		Not: Bu işlem yaklaşık 5 dakika sürer ve ilerleme izleme penceresi Odaya girerken hücreleri izleyerek izlenebilir. Tüm hücreleri odasında emin olmak için bir damla alın eluent, yer bir cam slayt üzerinde ve mikroskop altında görüntülemek. Örnek sağlam hücreleri serbest ise, bu onların saklama odasında onaylar.</li>
	</ol></li> <li>Bir kez tüm hücreleri odasına girdiniz ve denge içinde olduğu hücreleri odası geniş kısmında ayrı bir sınır kesirler toplamaya başlamak.
	<ol>50 mL konik tüp çıktı tüp hareketli tarafından <li>Begin W1 etiketli. Toplamak için rezervuar tank göz kulak ve elutriation arabellek gerektiğinde yeniden doldurmak emin bu kesir elutriation arabellek 50 mL. 
		Not: ilk kez depo dolum önce neredeyse boş olmak rezervuar tank tüm hücreleri içine belgili tanımlık sistem girdiğinizden emin olun için olanak verir. Sonra ilk dolum havzanın neredeyse boş olmak beklemek gerekmez. Ayrıca, yapmak değil hiç bu sistemde kabarcıklar ve geri dönüş basıncı yaratacak gibi boş olmak tank izin.</li>
		<li>50 mL toplanan bir kez W1 için aynı anda 821 x g hızla değiştirin ve W2 etiketli konik tüp çıktı tüp taşımak ve 50 mL bu hızda daha fazla toplamak.</li>
		<li>Değiştirme hızı ve tablo 1'de gösterildiği gibi kesirler toplamaya devam ediyor. Havzanın medyada tank ve buz üzerinde konik tüp her zaman tutmak emin olun. Son olarak, yavaş yavaş hızı azaldıkça sağdaki düğmeyi çevirerek görüntüleme penceresi ayarlamak.</li>
		<li>Bir kez tüm 20 kesirler toplanmıştır, santrifüj durdurmak ve STOP etiketli konik tüp içinde 50 mL toplamak.</li>
	</ol></li></ol> 6. Flushing Elutriation sisteminin <ol>santrifüj tamamen gömme rezervuar tüp autoclaved su ve çıkış tüpünde geri atık şişe 1 L şişe koyarak sistem durduktan sonra <li>.
	<ol><li>Pompa hızı 50 mL/dk'ya kadar açın ve onu tükenmiş kadar sistem üzerinden çalıştırmak su izin.</li>
	</ol></li> <li>Çevirmek pompa kapatmak giriş ve çıkış hortumu hızlı çıkarma derlemesinden kaldırmak ve ankraj kablo iğnesinden dışarı çıkarmak.
	<ol><li>Kaldır rotor hızlı çıkarma derlemesinden. 
		Not: ne santrifüj için kullanılan bağlı olarak, elutriation sistem şimdi olduğu gibi bırakılabilir. Aksi takdirde, tüm montaj ters sırada yukarıda açıklandığı gibi alınabilir. Elutriation odası hızlı çıkarma derlemesinden kaldırıldı ve ultrasonik su banyosu kullanarak çalışmaları arasında temizledim. Bu enkaz ve kirletici daha sonra ishal olumsuz yönde etkileyebilecek odası duvardan kaldırır.</li>
	</ol></li></ol> 7. Kesirler ve koleksiyon G1 ve G2/M havuzları analizi.
 Not: elutriation etkinliğini göstermek için her kesir sayısı, hücre çapı ve DNA içeriği için analiz edilir ve havuzları oluşturulur hücrelerinin immunoblot analizleri, G1 ve G2/M aşamasında açıklandığı gibi Temsilcisi sonuçları. Bu iletişim kuralı bölüm bu havuzları oluşturmak ve onları deneysel kullanım için hazırlamak nasıl anlatacağım.
<ol><li>Her kesir 2000 x g 4 ° C ve elutriation arabellek kapalı aspiratı 5 min için de spin.</li>
	<li>Birlikte bir G1 evresi havuzu ve G2/M aşamaları havuzu elde etmek için birleştirin kesirler.
	<ol><li>İçin G1 aşama Havuzu, toplam fosfat tampon tuzlu çözüm (PBS) ve 15 mL konik tüp transfer 1 mL 788 x g hız aralığında 661 x g (F1 - F5) toplanan kesirler resuspend. G2/M aşamaları havuzu için 387 x g ve 333 x g (F17 - F20) hız aralığında toplanan kesirler resuspend.</li>
		<li>2000 x g 4 ° C ve aspiratı PBS kapalı 5 min için hücreleri aşağı spin.</li>
	</ol></li> <li>Resuspend 10 mL büyüme ortamının hücreleri ve hücre sayısı alır.</li>
	<li>Bir aliquot için DNA analiz edilecek her havuzundan propidium iyodür boyama yoluyla içeriği almak ve akış sitometrik analiz 15. 
	Not: Her havuzu geri kalanı için daha fazla deney kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Beach, D., Piper, M., Shall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+newly-initiated+DNA+from+the+early+S+phase+of+the+synchronous+eukaryote,+Physarum+polycephalum.">Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum.</a> Exp cell res. 129, 211-221 (1980).</li><li>Sevcikova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completion+of+cell+division+is+associated+with+maximum+telomerase+activity+in+naturally+synchronized+cultures+of+the+green+alga+Desmodesmus+quadricauda.">Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda.</a> FEBS letters. 587, 743-748 (2013).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat protoc. 8, 602-626 (2013).</li><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+cell+synchronization.">Overview of cell synchronization.</a> Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).</li><li>Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Mammalian+Cell+Cultures+by+Serum+Deprivation.">Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation.</a> Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).</li><li>Dulla, K., Margalef, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Mitotic+Cell+Synchronization.">Large-Scale Mitotic Cell Synchronization.</a> Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).</li><li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species.">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).</li><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation.">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat protoc. 3, 663-673 (2008).</li><li>Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation+by+countercurrent+centrifugal+elutriation:+recent+developments.">Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments.</a> Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).</li><li>Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Yeast.">Synchronization of Yeast.</a> Meth mol. 1524, 215-242 (2017).</li><li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells?.">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?.</a> J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).</li><li>Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+cells+by+targeting+mitosis.">Killing cells by targeting mitosis.</a> Cell death diff. 19, 369-377 (2012).</li><li>Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+is+not+a+key+target+of+microtubule+agents+in+patient+tumors.">Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors.</a> Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).</li><li>Furst, R., Vollmar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+perspective+on+old+drugs:+non-mitotic+actions+of+tubulin-binding+drugs+play+a+major+role+in+cancer+treatment.">A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment.</a> Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).</li><li>Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle-Dependent+Mechanisms+Underlie+Vincristine-Induced+Death+of+Primary+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells.">Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells.</a> Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).</li><li>Nijmeijer, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+primary+human+lymphoblastic+leukemia+cells+in+the+absence+of+serum+or+hematopoietic+growth+factors.">Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors.</a> Exp hematol. 37, 376-385 (2009).</li><li>Knudsen, E. S., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+mechanisms+for+the+inhibition+of+E2F+binding+to+RB+by+cyclin-dependent+kinase-mediated+RB+phosphorylation.">Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation.</a> Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).</li><li>Malumbres, M., Barbacid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cyclin-dependent+kinases.">Mammalian cyclin-dependent kinases.</a> Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).</li><li>Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+expression+and+cell+cycle+regulation+of+the+protein+kinase+PIM-1.">Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1.</a> Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).</li><li>Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+gene+encoding+a+tRNA+synthetase-like+protein+is+enhanced+in+tumorigenic+human+myeloid+leukemia+cells+and+is+cell+cycle+stage-+and+differentiation-dependent.">Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).</li><li>Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+response+to+cell+cycle+arrests+in+human+myeloid+leukemia+cells.">Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells.</a> eLife. 4, (2015).</li></ol>

Anisha Kothari şu anda bölümü hücre ve moleküler biyoloji St. Jude çocuk araştırma hastanesinde çalışıyor.

CCE kullanarak hücre döngüsünün farklı aşamalarında tüm hücreleri birincil elde etmek için bir yöntem anlatmıştık. Optimal koşullar altında G1 evresi hücrelerde aslında saf bir nüfusa ve G2/M aşama hücre zenginleştirilmiş bir nüfus kolayca mükemmel verim elde edilebilir ve son derece S aşamasında zenginleştirilmiş hücreleri de istenirse edinilebilir. Sonuçları burada sunulan bir birincil tüm kültür (özellikle, ALL-5) ve temelde aynı sonuçlar elde edilen bağımsız bir kültür ile ...

Genellikle zaman uyumsuz olarak kültürlü hücrelerin büyümesine ve tek tek hücreler hücre döngüsünün farklı aşamalarında mevcuttur. Bazı organizmalar doğal olarak zaman uyumlu hücre döngüsü sergi veya belirli fizyolojik uyaranlar tarafından eşitlenebilir. Örneğin, bir çok zaman uyumlu moda1ve Desmodesmus quadricauda açık ve koyu alternatif tarafından senkronize edilebilir yeşil algler hücrelerinin çekirdekleri içinde sümük kalıp Physarum polycephalum dev plasmodia bölmek dönem2. Bu tür organizmalar benzersiz deneysel öznitelikleri sunarken, yeterli ölçüde memeli hücreleri karmaşıklığı modeli. Memeli hücre popülasyonlarının yapay olarak eşitlemek için yetenek hücre döngüsü Yönetmeliği anlayışımızı ve hücre döngüsü kontrol noktaları moleküler temeli ilerleyen merkezi olmuştur. Ortak yöntemleri serum yoksunluğu, kimyasal blok ve yayın veya fiziksel özellikleri3,4istismar olabilir. Serum geri çekilmesi kez sendika girmek hücreleri neden olur ve yeniden ekleme serum G1 faz5hücre döngüsü iniş teşvik etmektedir. Kimyasal inhibitörleri aşırı timidin G1/S sınır hücreleri engellemek hidroksiüreye veya genellikle hücre M faz3,4tutuklama Mikrotubul inhibitörleri gibi ajanlar içerir. Mitotik sallamak-onlar Interphase hücreleri6' dan daha az yapışık olduğundan kullanılabilecek zenginleştirmek için Mitotik hücre dışı fiziksel özellikleri istismar bir yaklaşım içerir. Ancak, tüm bu tekniklerin potansiyel sakıncaları var. Örneğin, Mitotik sallamak-off olmadan önceki eşitleme Mitotik inhibitörleri ile sınırlıdır sonra tüm hücre tipleri canlılığı serum veya kimyasal inhibitörleri varlığı yokluğu ve hücreleri verimini korumak.
Nerede onlar7bölmek gibi hücreleri aşamalı olarak boyutu küçülür, erken embriyonik hücre döngüsü dışında çoğu hücre döngüsü boyunca ilerleyen büyüme fazları geçmesi ve daha büyük hale. Bu özellik boyut olarak farklı hücreleri ayırmak için kullanılan ve dolayısıyla Hücre döngüsünde8,9aşama kanatlı santrifüj elutriation (CCE), teknikte istismar edilir. CCE sırasında iki karşıt güç etkisi altında hücrelerdir: hücreler dönüş ekseni uzak sürücüler, merkezkaç kuvveti ve dönüş (şekil 1) eksenini karşı hücreleri sürücüler akışkan hızı (kanatlı),. Elutriation odası hücrelerde bu kuvvetlerin eşit olduğu bir denge konuma ulaşmak. Hücre çapı ve yoğunluk denge konumu dikte anahtar faktörlerdir. Akış Arabellek çözüm oranı artar ve kanatlı sürükle kuvvet merkezkaç kuvveti daha ağır basar, hücrelerin odası içinde konumunu bir değişiklik neden yeni bir denge kurulmuştur. Tüm hücreleri ise kanatlı oranı yeterince kendi çıkış tanıtmak için artış kadar büyük hücreleri odası içinde kal küçük olanlar öncelikle, oda bırakarak kaynaklanan odası çıkış doğru kaydırılır. Elutriation odası ardışık kanatlı oranı artış ile kaçan hücreleri belirli kesirler toplanabilir ve her kesir sırayla boyutları artan hücreler içerir. Artımlı kanatlı oranı artış ile elutriation iletken yerine, merkezkaç kuvveti tarafından Santrifüjü hızı azalan sıralı düşüşler aynı sonuca ulaşmak. Elutriation süreç optimizasyonu bağlı olarak hücre tipi, istihdam elutriation arabellek ve kullanılan belirli cihazları gerektirir. Bu koşullar altında hücre sedimantasyon oranı en iyi Stokes yasa ile anlatılan: SV = [d2(ρp- ρm) / 18η] .ω2r, nereye SV = sedimantasyon hızı; d = çap parçacık; Ρp = yoğunluğu parçacık; Ρm = yoğunluğu arabelleği; Η viskozite arabelleği; = Ω = açısal hızı Open End; ve r = parçacığın Radyal konumu. Böylece, SV hücre çapı ve yoğunluğu ile doğru orantılıdır ve çapı ikinci kuvvetine yükseltilmiş beri daha da önemlisi hangi hücre döngüsünün genellikle sabittir yoğunluğu daha katkıda bulunur.
CCE önemli bir avantajı hücreleri kimyasal arıtma veya besin yoksunluğu sert koşullara tabi değil ve mükemmel verim aslında soğukkanlı kurtarılabilir olduğunu. Hücre döngüsü Travers olarak söz konusu hücreler çapı, en az % 30, önemli bir artış geçmesi zorunludur. Ana dezavantajı ise özel santrifüj, rotor ve aksesuarları maliyetidir. Yine de, hücreleri belirli hücre döngüsü aşamalarında CCE tarafından zenginleştirilmiş hazırlamak yeteneği büyük ölçüde hücre döngüsü araştırma memeli hücreleri9,10üzerinden Maya organizmalarda kolaylaştırdı. Ayrıca, son gelişmeler kullanır üzerinden kanserli doku, farklı hücre tipleri heterojen karışımları ve belirli hücre tiplerinin immünoterapi9üretim için ayrılması karşı sağlıklı hücreleri ayırma için arttırıyoruz.
Bizim büyük ilgi ajanlar (MTAs) Cezayir menekşesi alkoloidler ve taxanes gibi hedefleme Mikrotubul hareket mekanizması anlamakta olmuştur. Bu ilaçların iğ Mikrotubul işlevi11,12, engelleme sadece mitoz içinde hareket düşünüldü ama onlar da Interphase mikrotübüller13,14hedefleyebilir son kanıtlar gösteriyor. Biz son zamanlarda birincil Akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücreleri ya da ölümde G1 evresi geçmesi veya M yılında vincristine ve hücre döngüsü bağlı şekilde15dakika sonra diğer MTAs ile tedavi ederken aşama bildirdi. Farklı hücre döngüsü aşamaları CCE tarafından tüm hücreler ayrı yeteneği bu sonuca ulaşmada vesile oldu. Bu makalede, biz teknik ayrıntıları açıklamak ve CCE uygulamaya İlköğretim hazırlanması için pratik ipuçları tüm hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Hanks&#039; balanced salt solution</td><td>Lonza</td><td>10-508Q</td><td>1 L bottle</td></tr><tr><td>Fetal Plus bovine serum</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td>500 mL bottle</td></tr><tr><td>2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt</td><td>Acros Organics</td><td>212-672-4</td><td>100 g powder</td></tr><tr><td>50 mL concial tubes</td><td>Denville Scientifics</td><td>C1062-P</td><td>500/case</td></tr><tr><td>PES Membrane 0.22 &amp;micro;m filter unit</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>250/pack</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14544</td><td>centrifuge compatible with elutriation system</td></tr><tr><td>JE 5.0 elutriator rotor kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>356900</td><td>rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly</td></tr><tr><td>Chamber, standard, 4-mL, &quot;A&quot;</td><td>Beckman Coulter</td><td>356943</td><td>standard elutriation chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Variable-Speed Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1.5 Precision Glide needle</td><td>BD</td><td>305127</td><td>sterile, single-use needles</td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok syringe</td><td>BD</td><td>309604</td><td>sterile, single-use syringes</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>PI/RNase staining buffer</td><td>BD Pharmingen</td><td>550825</td><td>propidium iodide/RNase staining buffer</td></tr><tr><td>cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118s</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate</td><td>BioRad</td><td>170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of primary acute lymphoblastic leukemia cells in different cell cycle phases by centrifugal elutriation

Hücreleri eşitlemek için yetenek hücre döngüsü Yönetmeliği anlayışımızı ilerleyen merkezi olmuştur. Ortak teknikler istihdam serum yoksunluk içerir; hücreleri farklı hücre döngüsü aşamaları tutuklama kimyasallar; veya Mitotik sallamak-hangi azaltılmış onların bağlılık yararlanan kapalı kullanımı. Ancak, tüm bu dezavantajları var. Örneğin, serum açlık normal hücreleri için iyi ama daha az tümör hücreleri nedeniyle onkogen harekete geçirmek ya da Tümör baskılayıcı kaybı güvenliği aşılan hücre döngüsü kontrol noktaları ile iyi çalışır. Benzer şekilde, kimyasal tedavi hücre popülasyonlarının ilaçla zarar liman ve stres ile ilgili değişiklikler gösterir. Hangi bu sorunları circumvents bir akışlı santrifüj elutriation (CCE), nerede hücreleri iki karşıt güç, merkezkaç kuvveti ve hücre boyutu ve yoğunluğu temelinde ayrılması sonucunda sıvı hız tabi tekniktir. Hücreler arasında geçiş yapma genellikle ilerleyen büyütmek, CCE hücreler farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için kullanılabilir. Burada birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri için bu tekniği uygulamak. Optimal koşullar altında G1 evresi hücrelerde aslında saf bir nüfusa ve G2/M aşama hücre zenginleştirilmiş bir nüfus içinde mükemmel verim elde edilebilir. Bu hücre popülasyonlarının ideal eğitim hücre döngüsü bağlı mekanizmaları eylem antikanser ilaçların ve diğer uygulamalar için uygundur. Biz de nasıl değişiklikler standart bir prosedür olabilir suboptimal performansa yol göstermek ve teknik sınırlamaları tartışıyorlar. Sunulan ayrıntılı metodoloji uygulama ve araştırma tekniği hücreleri diğer türleri için kolaylaştıracaktır.

Birincil tüm hücreleri (3-4 10 x8) için santrifüj elutriation tabi ve toplanan iki yıkama kesirler ve yirmi ana kesirler, iletişim kuralında tanımlandığı gibi. Tablo 1 nerede her kesir hem de karşılık gelen rotor hızı toplam sayısı sunulmaktadır temsilcisi verileri gösterir. Genel olarak verim genellikle üzerinde % 80 oldu. Bu hücre çapı elutriation (Şekil 2) ilerleyen ile artan bireysel kesirler hücre çapı ölçümü do...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation at JoVE.com

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Bu iletişim kuralı birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için santrifüj elutriation açıklar.

Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

preparation-primary-acute-lymphoblastic-leukemia-cells-different-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.2K Görüntüleme.  University of Arkansas for Medical Sciences. Bu iletişim kuralı birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için santrifüj elutriation açıklar.

Video: Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western countries. The majority of CLL patients show an indolent course of the disease as well as an anergic phenotype of their leukemia cells, referring to a B cell receptor unresponsive to external stimulation. We have recently shown that the transcription factor NFAT2 is a crucial regulator of anergy in CLL. A major challenge in the analysis of the role of a transcription factor in different diseases is the identification of its specific target genes. This is of&#160;great significance for the elucidation of pathogenetic mechanisms and potential therapeutic interventions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions and can, therefore, be used to identify direct target genes of transcription factors in mammalian cells. Here, ChIP was used to identify LCK as a direct target gene of NFAT2 in human CLL cells. DNA and associated proteins are crosslinked using formaldehyde and subsequently sheared by sonication into DNA fragments of approximately 200-500 base pairs (bp). Cross-linked DNA fragments associated with NFAT2 are then selectively immunoprecipitated from cell debris using an &#945;NFAT2 antibody. After purification, associated DNA fragments are detected via quantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA sequences with evident enrichment represent regions of the genome which are targeted by NFAT2 in vivo. Appropriate shearing of the DNA and the selection of the required antibody are particularly crucial for the successful application of this method. This protocol is ideal for the demonstration of direct interactions of NFAT2 with target genes. Its major limitation is the difficulty to employ ChIP in large-scale assays analyzing the target genes of multiple transcription factors in intact organisms.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the western world. NFAT transcription factors are important regulators of development and activation in numerous cell types. Here, we present a protocol for the use of chromatin immunoprecipitation (ChIP) in human CLL cells to identify novel target genes of NFAT2.

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Kanser Araştırmaları

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant cellular localization disrupting their mechanism of action. The survival of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) cells, among other cancer cells, is assisted by the deregulation of nuclear to cytoplasmic shuttling, at least in part through deregulation of the transport receptor XPO1 and the constitutive activation of PI3K-mediated signaling pathways. It is essential to understand the role of individual proteins in the context of their intracellular location to gain a deeper understanding of the role of such proteins in the pathobiology of the disease. Furthermore, identifying processes that underlie cell stimulation and the mechanism of action of specific pharmacological inhibitors, in the context of subcellular protein trafficking, will provide a more comprehensive understanding of the mechanism of action. The protocol described here enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These fractions can be used to determine changes in protein trafficking between the nuclear and cytoplasmic fractions upon cell stimulation and drug treatment. The data can be quantified and presented in parallel with immunofluorescent images, thus providing robust and quantifiable data.

This protocol enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These samples are used to determine protein localization as well as changes in protein trafficking that take place between the nuclear and cytoplasmic compartments upon cell stimulation and drug treatment.

Nükleer/Sitoplazmik Protein Ticaretini İzlemek Için Primer Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinin Subsellüler Fraksiyonları

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

Protein fonksiyonu için bir 2DE-Jel Spot: Kronik Lenfositik Lösemide HS1 öğrendim Ders

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

Tıp

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Modelleme Kemoterapi Dayanıklı Lösemi<em&gt; İn Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Biyoloji

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Preparation of Subcellular Fractions from Leukemic Cells: A Method to Generate Cellular and Nuclear Fractions from Leukemic Cells

Source: Hay, J., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/60426">Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the preparation of subcellular fractions from leukemic cells which is a method to generate cellular and nuclear fractions from leukemic cells. The nuclear and cytoplasmic fractions can be used for further downstream analysis.

Lösemik Hücrelerden Hücre Altı Fraksiyonların Hazırlanması: Lösemik Hücrelerden Hücresel ve Nükleer Fraksiyonlar Üretmek İçin Bir Yöntem

Source: Hay, J., et al. Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking. J. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Lösemi

İn vitro teknikler ve analizler

Density Gradient Centrifugation: A Method to Isolate CLL Cells from Peripheral Blood

Source: Hay, J. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/60426">Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of isolating chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells from peripheral blood. With this protocol, we will isolate CLL cells from human patient blood sample for subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions.

Yoğunluk Gradyanlı Santrifüjleme: CLL Hücrelerini Periferik Kandan İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Source: Hay, J. et al. Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking. J. Vis. ...

Hayvan modeli çalışmaları

Leukemic Subpopulation Harvest: A Method for Spatial Separation of Leukemic Cell Subpopulations from 2D Co-culture

Source: Slone, W. L., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/53645">Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a method for spatial separation of three leukemic cell subpopulations: the suspended leukemic cells freely floating in the media, phase bright leukemic cells adhered to the surface of the mesenchymal stromal cell monolayer, and the phase dim leukemic cells that have migrated beneath the mesenchymal stromal cell monolayer from 2D co-culture.

Lösemik Alt Popülasyon Hasadı: Lösemik Hücre Alt Popülasyonlarının 2D Ko-kültürden Mekansal Olarak Ayrılması İçin Bir Yöntem

Source: Slone, W. L., et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a method for spatial separation ...