Yazarlar Baden-Württemberg Stiftung (BioMatS-14) "Bioinspired malzeme sentezi" çerçevesinde finansal destek için teşekkür etmek istiyorum.

1. hidrojel hazırlık
<ol>
	<li>BSA 200 mg %20 (w/v) BSA stok (stok çözelti A) oluşturmak için deiyonize H2O 1 mL ile karıştırın.</li>
	<li>THPC çözüm (134 mg/mL) Mix 165 µL 4.835 mL THPC oluşturmak için deiyonize su ile stok çözüm (hisse senedi çözüm B).</li>
	<li>KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) peptid (veya eşdeğer bir hücre yapışkanlı peptid) 1 mg tartmak ve 10 mg/mL solüsyon (hisse senedi çözüm C) elde etmek için steril H2O 100 µL içinde seyreltik. Not: Bu adım isteğe bağlıdır ve yalnızca hidrojel hücre kültür uygulama için gerekse dahil edilmesi gerekiyor.</li>
	<li>96-şey plaka altındaki çıkarın ve çıkarılabilir plastik wrap ile değiştirin. Not: Burada kullanılan plakalar için alt her kuyunun için basınç uygulayarak kolayca kaldırılabilir; ince plastik alt sadece düşecek.</li>
	<li>BSA hisse senedi çözüm mix 100 µL (A) ve THPC 100 µL stok çözüm (B) (isteğe bağlı: functionalized, hücre yapışkanlı hydrogels için hisse senedi çözümü C 4 µL) hidrojel 200 µL elde etmek için 96-şey plaka. Bileşenleri yukarı ve aşağı en az 5 kez bir üniforma hidrojel polimerizasyon sonra garanti pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>Kadar tüm hydrogels düzgün polimerli, oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 10 dakika için 96-şey plaka koyun.</li>
	<li>Dikkatli ve yavaş plastik wrap kalenin altından kaldırın.</li>
	<li>Hydrogels küçük bir damga kullanarak 96-şey plaka dışında basın ve steril PBS, pH 7.4 ile 1,5 mL tüpler için aktarabilirsiniz. Not: Hydrogels silindir şeklinde, çapı yaklaşık olarak 4 mm ve 8 mm yüksekliğe sahip.</li>
	<li>Hydrogels fosfat tamponlu tuz (PBS) 4 ° C'de için birkaç ay kadar saklayın.</li>
</ol>
2. Hydrogels dağılması
<ol>
	<li>1.5 mL tüpler steril deiyonize H2O 500 µL ile doldurun ve kapağını çıkarın. Hydrogels bir spatula kullanarak 1,5 mL tepki tüpler aktarın.</li>
	<li>1.5 mL tüpler parafin film, en az üç katmanları için her şişe ile sıkıca sarın. Tüp gaz yayın etkinleştirmek için film küçük delik delmek için bir iğne kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki adımlardan birini yapın:
	<ol>
		<li>Şişe su ve hidrojel tamamen dondurma güvence altına almak 5 min için sıvı azot çözüm aktarın. Sıvı azot dan hemen kaldırıldıktan sonra dondurma çözdürme üzerinden malzeme önlemek için kurutma şişeleri aktarın. Not: Bu yordam hakkında gözenekleri sonuç 10-15 µm yarıçap içinde.</li>
		<li>Şişeleri-20 ° C'de yavaş yavaş hydrogels dondurmak için gecede devam et. -20 ° c hemen kaldırıldıktan sonra dondurma çözdürme üzerinden malzeme önlemek için kurutma şişeleri aktarın. Not: Bu yordam hakkında gözenekleri sonuçları yarıçap içinde 50-60 µm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>24 h (ve tam buharlaşma ve hidrojel çevresinde su) sonra malzeme Donma kurutma makinesi kaldırarak çözülme. Not: Gözenek boyutları mikroskobu (Adım 5, "Hidrojel görselleştirme") tarama confocal lazer ile çözümlenebilir.</li>
</ol>
3. parçacık Leaching
<ol>
	<li>Hidrojel 1,1-1,5 adımlarda açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Doğrudan bileşenleri karıştırma sonra doygunluk (36 mg/mL) oluşana kadar NaCl ekleyin. Tuz kristal çözümde bir beyaz çökelti görülebilir kadar tuz ekleyin.</li>
	<li>96-şey plaka bir shaker aktarmak ve polimerizasyon gerçekleşir (yaklaşık 10 dakika) kadar çalkalanır. Hydrogels plaka, 1.7-1.8 adımlarda açıklandığı gibi kaldırın.</li>
	<li>Hydrogels hidrojel şablondan tüm tuz elute RT bir shaker (20 devir/dakika) steril su içinde en az 24 saat için kuluçkaya. Hydrogels 4 ° C'de PBS için birkaç ay kadar saklayın.</li>
</ol>
4. kanal oluşumu
<ol>
	<li>Hydrogels 1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. Bir hidrojel bir kıskaç kullanma çözümden kaldırmak, aşırı su ile yüksek emici kağıt çıkarın ve kuru buz kalıbı üzerine yerleştirin.</li>
	<li>30 hidrojel dondurmak s ve dikkatli bir şekilde blok çıkarın. Hidrojel zarar vermeyen; dikkatli bir spatula bloktan kazımak için kullanın. 1.5 mL tüp hidrojel aktarmak ve gecede 37 ° C'de Kuru</li>
</ol>
5. hidrojel görselleştirme
<ol>
	<li>Rodamine B hisse senedi çözüm rodamine B PBS 10 ml 1 mg sulandrarak hazırlayın. Bir seri seyreltme konsantrasyonu 0.001 mg/mL ulaşılana kadar PBS rodamine hisse senedi çözümde sulandrarak hazırlamak (seyreltme faktörü: 100)</li>
	<li>Depolama çözümü (Örneğin, adım 2.4.) hidrojel kaldırmak ve 1 mL 0.01 mg/mL rodamine B çözeltisi ile 1,5 mL tüp aktarmak. RT rodamine B çözüm geceleme hidrojel leke</li>
	<li>Ertesi gün, PBS (pH 7,4) ve yıkama için en az 3 h 10 ml görüntülenmeyecektir için hidrojel aktarın.</li>
	<li>Bir slayda bir µ-8 hidrojel de transfer ve PBS ile kaplayın.</li>
	<li>Bir bıçak kullanarak hidrojel (yaklaşık 0.5 mm içinde yükseklik) dışında küçük dilimler kesin.</li>
	<li>Mikroskop, tarama confocal lazer kullanarak görselleştirmek hidrojel bir dalga boyu 514, nm (Amaç: EC planı-Neofluar 40 x / 1,30 petrol DIC M27, uçak tarama modu: 514 nm ve yakınlaştırma: 1 X).</li>
</ol>
6. hücre kültür fizibilite
<ol>
	<li>Steril-filtre 0,45 µm filtre ile tüm stok Çözümleri (A, B ve C).</li>
	<li>Hidrojel 1.1-1.4 hidrojel polimerizasyon önce hücre yapışkanlı peptid de dahil olmak üzere, adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>De alt tamamen kaplıdır kadar bileşenleri karıştırma sonra hemen bir µ slayt 8 karışımı pipette. Not: polimerizasyon slayt dakika içinde yer alır gibi bu adımı diliye hizli ve dorudan bileşenleri, karıştırma sonra gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Kültür yapışma hücre ve bir tek hücre süspansiyon Standart hücre kültürü teknikleri kullanarak elde etmek için geçiş. Hücreleri Önceden ısıtılmış, steril DMEM hücre kültür fetal sığır serum (FBS, % 10 (w/v)), penisilin-streptomisin (%1 (w/v)) ve gerekli olmayan amino asit çözüm (MEM, %1 (w/v)) ile desteklenmiş orta içine aktarın.</li>
	<li>Sayım odası ve dikkatle pipet 200 µL hidrojel yüzeyine (2 x 105 hücreleri/cm2) hücrelerinin istenilen sayının bir Neubauer ile hücreleri saymak.</li>
	<li>Μ-slayt 8 de kapaklı kapağı ve bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) aktarın. En az 4 h 37 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>Hücresel eki en az 4 saat sonra hücreleri iki kez 200 µL steril hücre kültür PBS ile yıkayın.</li>
	<li>200 µL % 3.7 (v/v) formaldehit RT, 10 dk ile hücreleri tamir ve yıkama ile iki kez PBS (~ 200 µL). Not: uygun kişisel koruyucu ekipman formaldehit işleme giyerler.</li>
	<li>İki kez PBS ile 5 dk. yıkama için %0,1 Triton X 200 µL hücrelerle permeabilize.</li>
	<li>Methanolic stok 5 µL PBS 195 µL ile karıştırma ve RT. leke 20 dk için hücreleri karanlıkta hücrelere ekleme tarafından phalloidin-rodamine hücrelerle leke. İki kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>514 confocal bir mikroskop kullanarak hücre adezyon özellikleri araştırmak nm (Amaç: EC planı-Neofluar 40 x / 1,30 petrol DIC M27, uçak tarama modu: 514 nm ve yakınlaştırma: 1 X). Uygun yazılımı kullanarak görüntüleri analiz ( Tablo reçetesigörmek).</li>
</ol>
7. hidrojel özellikleri
<ol>
	<li>Şişme oranı.
	<ol>
		<li>Tamamen hydrogels 37 ° C'de en az bir gün kuru.</li>
		<li>Her hidrojel tartmak ve tam ağırlık not edin.</li>
		<li>2 mL tepki tüp PBS 1,5 mL ile doldurulması.</li>
		<li>Bu 2 mL tepki tüpüne hidrojel aktarmak ve tamamen PBS içinde bırakın.</li>
		<li>Hidrojel PBS RT denge PBS ile ulaşmak için en az iki gün için bırakın.</li>
		<li>Üç gün sonra hidrojel çözümden kaldırmak ve hidrojel yüzeyindeki aşırı su çıkarmak için kağıt mendil ile kurulayın.</li>
		<li>Hidrojel tartın.</li>
		<li>Şişme oranı aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar: 
		<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55813/55813eq1.jpg"> Wd ağırlık kurutulmuş jel (adım 7.1.2.) ve Ws nerede ıslak jel (adım 7.1.7) ağırlığıdır. Şişme oranı yüzde 100 ile çarpmak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pH ve sıcaklık istikrarı.
	<ol>
		<li>5 mL PBS de 15 mL tepki tüp aktarın.</li>
		<li>NaOH ve HCl. Bring uygun sıcaklık (Örneğin, RT, 37 ° C veya 80 ° C) çözümü ile çözüm uygun pH (Örneğin, pH 2, 7 veya 10) için ayarlayın.</li>
		<li>Uygun bir çözüm içine onun istikrar için soruşturma olması için hidrojel aktarın. PH gerekirse yeniden ayarlayabilirsiniz. Not: Tüm hydrogels tamamen bu noktada (bkz: şişme oranı) ağırlık malzeme şişmesi nedeniyle yanlış yorumlanması önlemek için şişmiş.</li>
		<li>Belirli zaman aralıklarında sonra çözüm (Örneğin, her saat için 2 gün) hidrojel kaldırmak, aşırı su kaldırmak ve tartmak çok emici kağıt mendil ile Makinası.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Enzimatik bozulması.
	<ol>
		<li>300 U tripsin ve pepsin, üreticinin yönergelerine göre bir hisse senedi enzim çözüm hazırlamak.</li>
		<li>Hidrojel (Örneğin, adım 1.8) için uygun bir çözüm aktarın. Not: Tüm hydrogels tamamen bu noktada ağırlığı yanlış yorumlanması önlemek için şişmiş.</li>
		<li>Belirli zaman aralıklarında sonra hidrojel (Örneğin, her saat) eriyik--dan kaldırmak için aşırı su kaldırmak ve tartmak çok emici kağıt mendil ile kuru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics.">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).</li><li>Liu, Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomimetic+hydrogel+based+on+methacrylated+dextran-graft-lysine+and+gelatin+for+3D+smooth+muscle+cell+culture.">A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture.</a> Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).</li><li>Raic, A., R&#246;dling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+macroporous+PEG+hydrogels+as+3D+scaffolds+for+the+multiplication+of+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).</li><li>Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-component+protein-engineered+physical+hydrogels+for+cell+encapsulation.">Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).</li><li>Zhu, J., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+properties+of+hydrogel+tissue-engineering+scaffolds.">Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds.</a> Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).</li><li>Samaryk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+Approach+to+Develop+Porous+Hydrogels+with+a+Regular+Pore+Distribution+and+Investigation+of+their+Physicomechanical+Properties.">Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties.</a> J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).</li><li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+3D+cell+culture:+potential+application+for+tissue-based+bioassays.">Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).</li><li>Park, H., Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Swelling+Ratio+of+Injectable+Hydrogel+Composites+on+Chondrogenic+Differentiation+of+Encapsulated+Rabbit+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+In+Vitro.">Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro.</a> Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).</li><li>Stokols, S., Tuszynski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fabrication+and+characterization+of+linearly+oriented+nerve+guidance+scaffolds+for+spinal+cord+injury.">The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury.</a> Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).</li><li>Sung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Impact+of+2D+and+3D+Fibroblast+Cultures+on+In+Vitro+Breast+Cancer+Models.">Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models.</a> PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).</li><li>Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+hydrogel+guidance+channels+facilitate+regeneration+of+adult+rat+brainstem+motor+axons+after+complete+spinal+cord+transection.">Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection.</a> J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).</li><li>Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+hydrogels+used+in+cell+encapsulation:+An+in+vitro+comparison+of+alginate+and+agarose.">Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose.</a> Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).</li><li>Chiu, Y. -. C., Kocag&#246;z, S., Larson, J. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+physical+and+mechanical+properties+of+porous+poly+(ethylene+glycol)-co-(L-lactic+acid)+hydrogels+during+degradation.">Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation.</a> PloS One. 8 (4), e60728 (2013).</li><li>Jonker, A. M., L&#246;wik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-+and+Protein-Based+Hydrogels.">Peptide- and Protein-Based Hydrogels.</a> Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).</li><li>Bodenberger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+bread+and+beer:+whole+cell+protein+extracts+from+baker's+yeast+as+a+bulk+source+for+3D+cell+culture+matrices.">Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices.</a> Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).</li><li>Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cheap+and+easy+to+handle+protein+hydrogel+for+3D+cell+culture+applications+a+high+stability+matrix+with+tunable+elasticity+and+cell+adhesion+properties.">A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties.</a> Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).</li><li>Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospinning+technique+for+biomedical+applications.">Use of electrospinning technique for biomedical applications.</a> Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).</li><li>Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-electrospraying+and+droplet-based+microfluidics:+control+of+cell+numbers+within+living+residues.">Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues.</a> Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).</li><li>Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+electrospinning+highly+concentrated+cellular+suspensions+containing+primary+living+organisms+into+cell-bearing+threads+and+scaffolds.">Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds.</a> Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).</li><li>Selimovi&#263;, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+strategies+for+generating+cell-encapsulating+hydrogels.">Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels.</a> Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).</li><li>Annabi, N., Nichol, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+porosity+and+microarchitecture+of+hydrogels+for+tissue+engineering.">Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).</li><li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+matrices:+state+of+the+art.">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).</li><li>Bodenberger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methods+for+pore+generation+and+their+influence+on+physio-chemical+properties+of+a+protein+based+hydroge.">Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge.</a> Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).</li><li>Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+and+redox+sensitive+albumin+hydrogel:+A+self-derived+biomaterial.">pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial.</a> Sci Rep. 5, 15977 (2015).</li><li>Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+crosslinking+methods+to+design+hydrogels.">Novel crosslinking methods to design hydrogels.</a> Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).</li><li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrakis(hydroxymethyl)+phosphonium+chloride+as+a+covalent+cross-linking+agent+for+cell+encapsulation+within+protein-based+hydrogels.">Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).</li><li>Cal&#243;, E., Khutoryanskiy, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+hydrogels:+A+review+of+patents+and+commercial+products.">Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products.</a> Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).</li><li>Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+transformation+and+physical+properties+of+a+hydrogel-forming+peptide+studied+by+NMR,+transmission+electron+microscopy,+and+dynamic+rheometer.">Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer.</a> Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).</li><li>Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspheres+leaching+for+scaffold+porosity+control.">Microspheres leaching for scaffold porosity control.</a> J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).</li><li>Whang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Bone+Regeneration+with+Bioabsorbable+Scaffolds+with+Novel+Microarchitecture.">Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture.</a> Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).</li><li>Ziv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+silk-alginate+hydrogel+scaffold+for+stem+cell+culture+and+transplantation.">A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation.</a> Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).</li><li>Butruk-Raszeja, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Athrombogenic+hydrogel+coatings+for+medical+devices--Examination+of+biological+properties.">Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties.</a> Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).</li><li>L&#252;, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoresponsive+injectable+hydrogel+for+three-dimensional+cell+culture:+chondroitin+sulfate+bioconjugated+with+poly(N-isopropylacrylamide)+synthesized+by+RAFT+polymerization.">Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization.</a> Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).</li><li>Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+perspectives+in+cell+adhesion:+RGD+and+integrins.">New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins.</a> Science. 238 (4826), 491-497 (1987).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th...

Hydrogels çözünmez 3D ağlar büyük miktarda su bağlama yeteneğine sahip formu malzemelerdir. Bu materyalleri canlı hücreler için mükemmel çevre koşulları sağlayabilir. Şu anda, orada ilgi üç boyutlu hidrojel yapıları nesil ve onların kimyasal ve fiziksel özellikleri terzi süreçlerinin geliştirme artmaktadır. Bir kez bu elde edilir, hücrelerinin büyümesini ve hücresel davranış manipülasyon için şablon oluşturulan1,2,3,4olabilir. Bu 3D yapılar sadece bir daha doğal ve gerçekçi daha geleneksel iki boyutlu yaklaşımlar, ama onlar da reveal kök hücrelerin büyüme için yeni olanaklar ortamı veya tümör5modelleri. Farklı malzeme esas olarak jel6gözenek boyutu üzerine bağlıdır özellikleri bir dizi sahip. Gözenekleri hücre kültür uygulamaları, doku Mühendisliği ve kök hücrelerin yönlendirilmiş büyüme çok önemli bir rol oynamaktadır. Örneğin, oksijen ve besin matris ile diffüz ve yeterli miktarda hücreleri7ulaşmak mümkün olması gerekir. Öte yandan, zararlı metabolitleri kısa zamanda kaldırılması ve hücre büyümesi için yeterli alanı7kullanılabilir olması gerekir. Sonuç olarak, malzeme ve böylece gözenek boyutu özelliklerini ciddi potansiyel yararı ve olası uygulamalar Matrix etkisi. Malzeme özellikleri bağlı olarak, farklı hücre büyüme süreçleri nöronal yapıların oluşumu da dahil olmak üzere 3D hücre kültüründe ortaya çıkabilir; büyüme ve farklılaşma deri ya da kemik hücreleri; ve tetkikine veya fibroblastlar2,3,8,9,10,11gibi özel kök hücre satırları yönlendirilmiş büyüme. Başka bir önemli nokta bir malzeme mümkün uygulanması etkileyen istikrarı dış uyaranlara12doğru olduğunu. Örneğin, hidrojel mekanik bütünlüğünü hücre kültür medya veya insan vücudu korumak gerekir.
Son yıllarda yoğun 3D hücre kültür hydrogels üzerinde araştırma ve birçok çalışma sistemleri133D mimarileri çözmek için yapılmıştır. Hydrogels kimyasal olarak sentezlenmiş bileşenlerden oluşur çünkü kolayca sentezlenmiş ve kimyasal olarak değiştirilmiş ve onlar yüksek kararlılık göstermek en yaygın olarak incelenmiştir (bkz: Zhu vd., 2011 için bir daha gözden geçirme)5. Ancak, proteinler birçok yararlı özellikleri var: kadar sözde "hassas polimerler," onlar Biyouyumlu; Onlar tanımlanmış bir uzunluğu var; Onlar değiştirmek nispeten kolaydır; ve onlar-si olmak çok sayıda hedef siteleri14,15. Bu bağlamda, çok özel, yenilikçi yapıları çok alanda uygulama için oluşturulabilir. Bu çalışmada, bir protein bazlı hidrojel16 3D mimari malzeme etkilemek için köklü yöntemlerden yeteneğini göstermek için kullanıldı. Ayrıca, yeteneği ve gözenek üretimi uygulanabilirliği da araştırıldı.
Çok farklı teknikler basit yöntemleri ve malzeme bilimi farklı alanlardan sofistike, alanında son derece uzman teknikleri dahil olmak üzere 3D yapılar değiştirmek kullanılabilir. İyi tanımlanmış yapılar17oluşturmak için electrospinning kullanımı yaygın bir tekniktir. Şarj edilmiş lifler bir çözümden bir elektrik alanı tarafından alınır ve oksijen maruz üzerine kuvvetlendirmek. Bu şekilde, lifleri birkaç nanometre kadar birkaç mikron aralığındaki üretilebilir. Boyutu, yapısı ve gözenekleri matris içinde dağılımını ayarlamak için ek teknikler vardır yumuşak litografi, fotolitografi, hidrodinamik odaklama, elektro-püskürtme ve biyo-baskı18,19,20. Bu tekniklerin önemli bir dezavantajı özel, pahalı ekipman ve özel kimyasallar veya malzeme üzerine kendi bağımlılık olduğunu. Ayrıca, bu teknikleri ile deneyim çoğu zaman doğrudan protein bazlı malzeme için transferrable değildir ve birçok kimyasal madde ve yöntemleri hücre uyumlu değildir.
Öte yandan, birçok teknik yapım onları daha kolay ve ucuz uygulamak için ve yeniden üretmek için özel ekipman güvenmeyin. Yapısı manipülasyon için yaygın bir yöntem solvent döküm21,22,23' tür. Parçacıklar polimerizasyon reaksiyonu önce eklenir ve homojen çözüm emdirmek dağıtılır. Gözenekleri malzeme içinde kalırken polimerizasyon sonra parçacıkların solvasyon bir seyreltme veya bir pH değişikliği gibi koşulları değişimine yol açar. Tuz, şeker, parafin, jelatin ve tebeşir, gibi bu teknikleri kullanılan kimyasalların ucuz ve kullanılabilir durumda. Dağılması, şişmiş hydrogels dondu. Bir vakum altında sıvı aşamadan sonraki süblimasyon ise23,24,25gerçekleştirilen. Su süblimasyon ağdan malzemenin belirli 3D yapıları korumak için nazik. Polimerizasyon gözenekleri jel21içinde bırakarak gerçekleştikten çalışırken köpük gaz, gaz ile bir çözüm akışla gönderilir. Gözenekleri dağılımı ve boyutu gaz akışı bağlı olarak ayarlanabilir.
Protein hidrojel oluşturmak için BSA ile tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium klorür (THPC) Birincil aminler ve dört kollu bağlayıcı molekül26hidroksi grupları arasında Kovalent bağlar oluşumu için izin vermek için bir Mannich tipi tepki tepki. Reaksiyon oluştuktan sonra olası zararlı ara malzeme aşırı yıkama tarafından kaldırılır.
Bu çalışmada BSA-esaslı malzeme işlemek ve gözenekleri boyutunu terzi için farklı teknikler ile tedavi olasılığını gösterir. Hiçbir özel ekipman gerekli olduğu gibi tekniklerin herbirini herhangi bir laboratuvar olarak dünya çapında kullanılabilir. Şişme oranı, enzimatik çözünebilirlik, pH istikrar ve sıcaklık hassasiyeti, muayene ve her diğer, karşılaştırıldığında gibi Ayrıca, farklı parametreleri, özellikle farklı teknikleri etkisi için 3D mimarileri nesil üzerinde saygı duyuyorum. Son olarak, malzemeler ile hücre kültürü mümkün uygulamaya malzemelerin araştırmak için hücre yapışkanlı peptidler functionalized. İki farklı model hücre satır kullanılmıştır: A549 ve MCF7.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (high glucose)</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nonessential Amino Acid Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99.8%, verg&amp;auml;llt</td><td>&amp;Ouml;lfabrik Schmidt</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>3854.2</td><td></td></tr><tr><td>THPC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>0.1% Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Slightly toxic</td></tr><tr><td>Phalloidin-rhodamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>3.7% Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>F8775-25ML</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>2 83.1826.001&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro; slide 8 well</td><td>Ibidi GmbH</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>KCSSGKSRGDS peptide</td><td>UPEP Ulm</td><td>Custom sysnthesis</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99.8%, verg&amp;auml;llt</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>K928.5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 50 ml&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 1.5 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,690,001</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 2 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner</td><td>655073</td><td></td></tr><tr><td>FreezeDryer Epsilon 1-6D,&amp;nbsp;</td><td>Christ, Osterode am Harz, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7</td><td>GSA GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

easy manipulation of architectures in protein-based hydrogels for cell culture applications

Hydrogels hücre kültür uygulamaları nedeniyle son derece sulu hücre ortamları sağlamak için yeteneklerini için umut verici malzemeler kabul edilmektedir. 3D şablonların alan bu malzemeleri potansiyel benzerliği nedeniyle doğal hücre dışı matriks artıyor. Protein bazlı hydrogels özellikle umut verici, çünkü onlar kolayca functionalized ve ayarlanabilir fizikokimyasal özellikleri ile tanımlanmış yapılar elde edebilirsiniz. Ancak, üretim macroporous 3D şablonların doğal malzemeler kullanarak hücre kültür uygulamalar için genellikle sentetik malzemeler için göre daha zayıf mekanik özellikleri ile sınırlıdır. Burada, farklı yöntemler macroporous sığır serum albumin (BSA) üretmek için değerlendirildi-ayarlanabilir gözenek boyutları 10-70 µm çapındaki yelpazesi ile hidrojel sistemleri dayalı. Ayrıca, birkaç yüz mikron uzun olan bu protein bazlı malzeme kanalları oluşturmak için bir yöntem kuruldu. Gözenekleri gözenek boyutu oranı, pH, sıcaklık kararlılığı ve enzimatik bozulması davranış, şişme gibi malzeme özellikleri üzerinde etkisi üretmek için farklı yöntemler analiz edildi. Gözenek boyutları confocal lazer mikroskobu tarama kullanarak hydrogels yerli, şişmiş durumda araştırıldı. Hücre kültür uygulamaları için fizibilite bir hücre yapışkanlı RGD peptid değiştirme-in protein sistemi ve iki modeli hücre satırları kullanarak değerlendirildi: insan meme kanseri hücreleri (A549) ve adenocarcinomic insan alveoler Bazal epitelyal hücreler (MCF7).

Hydrogel development has become one of the most prominent fields in material research-related biological studies, with thousands of entries indexed in scientific research archives. Although the behavior of many systems is well studied, the manipulation of 3D networks, especially of sensitive protein-based materials, is often a major issue in material science. Another commonly underestimated challenge is the correct measurement of the native structure of a material using cryo electron micr...

Watch this Scientific Journal Video about Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications at JoVE.com

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Protein bazlı hydrogels üç boyutlu mimarisinde işlemek için farklı yöntemler burada malzeme özellikleri ile ilgili olarak değerlendirilir. Macroporous ağlar ile bir hücre yapışkanlı peptid functionalized ve onların fizibilite hücre kültüründe iki farklı model hücre hatları kullanılarak hesaplandı.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

easy-manipulation-architectures-protein-based-hydrogels-for-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.7K Görüntüleme.  Ulm University. Protein bazlı hydrogels üç boyutlu mimarisinde işlemek için farklı yöntemler burada malzeme özellikleri ile ilgili olarak değerlendirilir. Macroporous ağlar ile bir hücre yapışkanlı peptid functionalized ve onların fizibilite hücre kültüründe iki farklı model hücre hatları kullanılarak hesaplandı.

Video: Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...