Name: hypoxic preconditioning of marrow-derived progenitor cells as a source for the generation of mature schwann cells
Uploaded: 2017-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells at JoVE.com

Yazarlar, teknik destek için hipoksi oda aparatı ve Bayan Alice Lui&#39;yi sağladıkları için Dr. Nai-Sum Wong&#39;u onaylamak istiyorlar.

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, NIH Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu&#39;na ve aynı zamanda Hong Kong Üniversitesi&#39;nden Li Ka Shing Tıp Fakültesi Öğretim ve Araştırma için Canlı Hayvanların Kullanımı Komisyonu tarafından onaylanmış şekilde gerçekleştirildi. İnsanlara kemik iliği örnekleri, bilgilendirilmiş onayı aldıktan sonra sağlıklı bağışçıların iliyak kretinden elde edildi. Protokoller, Kurumsal Değerlendirme Kurulu, Hong Kong Üniversitesi tarafından onaylandı. 1. Sıçan MSC Kültürlerinin Hazırlanması <ol><li> MSK&#39;ların femurdan hasat edilmesi <ol><li> Kullanmadan önce en az 2 saat boyunca 180 ° C&#39;de tüm diseksiyon aletlerini ( yani ince kesme makası, küt uçlu kesme makası ve dişli forseps) otoklavlayın. </li><li> % 15 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin (P / S,% 1 v / v) ile takviye edilmiş asgari esansiyel orta-alfa modifikasyonu (aMEM) içeren MSC büyüme ortamı hazırlayın). </li><li> Genç erkek Sprague Dawley sıçanlarını (200-250 g vücut ağırlığı) pentobarbitone aşırı doz (240 mg / kg vücut ağırlığı, intraperitoneal) ile kurban edin. NOT: Farklı farelerden alınan ilik örnekleri ayrı ayrı işlenmelidir. </li><li> Kurbağalanmış hayvanları yatay konuma getirin. Karnını ve alt ekstremitelerini% 70 etanol ile iyice temizleyin. </li><li> İnce uyluk makası ve forseps kullanarak medial uylukların üzerindeki cildi ve cilt altı dokuyu çıkarın. Uyluk kaslarını çevresel olarak femur maruz kalana kadar çıkarın. Diz ve kalça eklemleri görene kadar bunu proksimal ve distal olarak devam ettirin. Küt uçlu kesme makası kullanarak kalça ve diz eklemi vasıtasıyla femurun parçalanması. NOT: Kemik iliğini bu aşamada maruz kalacak şekilde transarm etmeyin. Hasarsız femurları ileri işlem için laminer bir akış doku kültür kaputuna aktarın. </li><li> Metrafizden femurun distal ve proksimal uçlarını kesmek için küt uçlu kesme makası kullanın. </li><li> 50 mL konik tüpün üzerine 70 μm hücre süzgeç yerleştirin. Maruz kalmış femoral kanal içine fosfat tamponlu salin (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7.4) içeren 21 G, 10 mL şırınga yerleştirin ve tekrar tekrar yıkama ile kemik iliği konik tüp içine yıkayın. NOT: Her bir femurun yıkanması için yaklaşık 20 mL PBS kullanılır. Temizlenen içeriğin rengi kan lekeli ve bulanık kalırsa, daha büyük bir hacim kullanılabilir. </li><li> 5 dakika boyunca 480 xg&#39;de santrifüje ederek hücreleri toplayın. Süpernatanı atın. Hücre pelletini 10 mL MSC büyüme ortamı içinde tekrar süspanse edin. 10 cm doku kültürü dish.Place bir hücre inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2 ) içine doku kültürü yemekleri üzerine plakalar hücreleri. Kaplamanın ilk gününü 0 gün olarak kaydedin. NOT: Santrifüjü içeren tüm adımlarda, maksimum yavaşlama freni ayarlayın. </li></ol></li><li> MSC kolonilerinin kurulması ve yaygınlaştırılması NOT: Bu protokol rIlik boşluğundan MSC&#39;leri seçmek için bir araç olarak doku kültürü plastik tutunması üzerinde durur 11 . Kemik iliği içeriğinin doku kültürü plastikine 2 gün boyunca yapışmasına izin verilir. <ol><li> 2. günde yapışkan olmayan hücreleri çıkarmak için kültür plakalarını 10 mL PBS ile üç kez durulayın. Durulamadan sonra PBS&#39;yi 10 mL MSC büyüme maddesi ile değiştirin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve her 3 günde MSC büyüme maddesi ile doldurun. NOT: MSC kolonileri 6-7. Günde görünür olmalıdır ( Şekil 2A ). </li><li> Büyüme ortamı çıkarılarak hücreleri 10 günde geçirin ve hücreleri PBS ile durulayın. 1.5 mL rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifini ilave edin ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. Reaksiyonu nötralize etmek için 3 mL MSC büyüme ortamı ekleyin. Ayrılmış hücreleri, 250 xg&#39;de 5 dakika santrifüj ederek toplayın. </li><li> PBS içinde uygun bir seyreltme sonrasında bir hemositometre kullanarak topaklardaki hücreleri ölçün. </li><li> MSC büyüme ortamında 10 cm&#39;lik bir kültür plakasına 40,000 hücre / cm2 yoğunluğunda pasif hücreleri tohumlandı. NOT: Sıçan MSC&#39;leri pasajdan sonraki 2 gün içinde% 80-90&#39;a kadar birleşmelidir ( Şekil 2B ). Hücreler, adım 1.2.2&#39;de tarif edildiği gibi, en fazla 8 pasaj için geçirilebilir. MSC&#39;ler immünositokimya ve trilineaj farklılaşması için kapasiteleri ile karakterize edilebilir ( Şekil 3 ) 12 . Yalnızca 3. ve 8. pasajlar arasındaki MSC kültürleri, daha sonraki hipoksik ön koşullandırma ve sinirsel progenitör zenginleştirmeye tabidir. Geçiş sayısının daha yüksek MSC&#39;leri düzleştirilmiş bir morfolojiyi benimser ( Şekil 2C ) ve yeterli sayıdaki sinir öncüsü üretmez. Bu kültürler atılmalıdır. </li></ol></li></ol> 2. İnsan BMSC Kültürlerinin Hazırlanması <ol><li> 9 mL MSC büyüme ortamı ile 1 mL insan kemik iliği aspiratı seyreltin veHücreleri 10 cm&#39;lik bir doku kültürü çanak üzerinde. Kültürleri hücre inkübatöründe muhafaza edin (37 ° C,% 5 CO 2 ). </li><li> Ortamı 2 gün sonra çıkarın ve yapışık olmayan hücreleri çıkarmak için kültürleri üç kez 10 mL PBS ile hafifçe durulayın. Son durulamadan sonra, PBS&#39;yi çıkarın ve 10 mL MSC büyüme ortamı ile değiştirin. PBS durulamadan sonra her 3 günde bir büyüme ortamını tekrar doldurun. NOT: MSC kolonileri 6-7. Günde görünür olmalıdır. Kolonilerin sayısı konular arasında değişebilir. </li><li> Adım 1.2.2&#39;de açıklandığı gibi, hücreleri 10. günde geçirebilirsiniz. PBS içinde uygun bir seyreltme sonrasında bir hemositometre kullanarak topaklardaki hücreleri ölçün. MSC büyüme ortamında 10 cm&#39;lik bir kültür plakası üzerine pasifleştirilmiş hücreleri 40.000 hücre / cm2 yoğunluğunda tohumlandı. NOT: İnsan MSC&#39;leri ( Şekil 2D ), sıçan MSC&#39;lerine benzer bir morfolojiyi gösterir ve aynı şekilde geçişten sonraki 2 gün içinde% 80-90&#39;lık birleşmeye ulaşmalıdır. Onlar chara olmalılarİmmünositokimya ve trilineaj farklılaşması için kapasiteleri vasıtasıyla citerleştirilir 12 . Sıçan MSC&#39;lerde olduğu gibi, geçit 3 ve 8 arasında olan insan MSC&#39;leri, daha sonraki hipoksik önkoşullamaya ve sinirsel progenitör zenginleştirmeye tabidir. </li></ol> 3. Hipoksik Ön Şartlandırma <ol><li> Halka kelepçeyi bıraktıktan sonra hipoksi oda bileşenlerini ( örn. Taban, kapak, tepsiler) sökün ve tek tek parçaları% 70 etanolle silerek temizleyin. 15 dakika için UV ışığı altında sterilizasyon için oda bileşenleri bir laminer akış doku kültür kaputu yerleştirin. </li><li> Hipoksik ön koşullandırmadan önce ortamı alın ve sıçan ve insan MSC kültürlerini (bölüm 1 ve 2) 10 mL PBS ile durulayın. PBS, 25 mM HEPES ile takviye edilmiş 10 mL MSC büyüme ortamı ile değiştirilir. NOT: 10 cm&#39;lik bulaşıklar üzerinde kültürlenen MSC&#39;ler, hipoksik ön koşullandırmadan önce% 80-90&#39;lık konfluene ulaşmış olmalıdır. </li><li> Cul&#39;u yerleştirinYemekleri hipoksi odasında arayın. Bölme bileşenlerini tekrar monte edin ve halka kelepçe sıkın. % 99 N 2 /% 1 O 2 gaz karışımını 5 dakika süreyle 10 L / dk&#39;lık bir akış oranında odacık içine boşaltın. </li><li> Gaz kaçağı olmadığından emin olmak için hipoksi odacığının bağlantı uçlarını kapatın. Oda hücre inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2 ) içinde 16 saat boyunca yerleştirin. </li><li> Hipoksik önkoşullamanın tamamlanmasının ardından, sonraki nöral progenitör zenginleştirme kültürüne hazırlık amacıyla bölmeden kültürleri çıkarın. </li></ol> 4. Sinirsel Progenitör Zenginleştirme Kültürü <ol><li> B27 (% 2 v / v), bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 20 ng / mL), epidermal büyüme faktörü (EGF, 20 ng / mL) ile takviyeli Dulbecco&#39;nun modifiye kartal ortamı / Ham besin karışımı F12&#39;den (DMEM / F12) oluşan sinirsel progenitör ortamını hazırlayın. 20 ng / mL) ve P / S (% 1 v / v). </li><li> Adım 1.2.2&#39;de açıklandığı gibi hipoksik önkoşullamış sıçan / insan MSC&#39;lerini çıkarın.Ayrılmış hücreleri, 250 xg&#39;de 5 dakika santrifüj ederek toplayın. PBS içindeki uygun seyreltme sonrasında bir hemositometre kullanarak topak içerisindeki hücreleri ölçün. </li><li> Nöral progenitör ortamda hücreleri tekrar süspanse edin ve 6.000 hücre / cm2&#39;lik bir yoğunluğa sahip düşük bağlanmış, 6 oyuklu plakalar üzerine tohum ekleyin. Kültürü bir hücre inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2 ) 12 gün boyunca yerleştirin. Sinir öncü madde ortamının% 75&#39;ini her 3 günde bir doldurun. NOT: Boyutlanabilir yapışkan olmayan hücre kümeleri 6-7. Günde gözlemlenmelidir. 10-12. Günde, ≥ 100 μm çapında nevrosferler görülebilir ( Şekil 4 ). Hipoksik önkoşullamış MSC&#39;ler normoksik koşullar altında kültüre edilen MSC&#39;lere kıyasla daha fazla sinir küresi üretmelidir 9 . </li><li> 12 mL&#39;de nörosferler toplayın ve 10 mL&#39;lik bir pipete aspire edin ve bunları 15 mL&#39;lik bir konik tüpe aktarın. Sinirküreleri, 250 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. NOT: Neurospheres olabilirNestin ve GFAP 7 gibi nöral progenitör belirteçleri için 12. günde karakterizedir. </li></ol> 5. Öldürülen Schwann Hücrelerinin DRG Nöronları ile birlikte Kültür yoluyla Üretilmesi <ol><li> Saflaştırılmış sıçan DRG nöronlarının hazırlanması <ol><li> Kullanmadan önce en az 2 saat süreyle tüm diseksiyon aletlerini ( yani diseksiyon makası, forseps, iki mikrodiseksiyon forsepsi ve mikrodiseksiyon makası) otoklavda tutun. </li><li> Poly-D-lisin (PDL, PBS içinde 10 ug / mL) ile 6-iyi doku kültürü plakalar 4 ° C&#39;de gece boyunca kaplayın. PDL&#39;yi çıkarın ve göz başına 1.5 mL PBS ile durulayın. </li><li> Plakları laminin (PBS içinde 10 ug / mL) ile kaplayarak, 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle uygulayın. Tabletleri göz başına 1.5 mL PBS ile durulayın. </li><li> B27 (% 2 v / v), L-glutamin (% 1 v / v), sinir büyüme faktörü (NGF, 20 ng / mL) ve P / S ile desteklenen nörobazal ortamdan oluşan DRG nöron bakım ortamını hazırlayın % V / v). </li><li>B27 (% 2 v / v), L-glütamin (% 1), NGF (20 ng / mL), P / S (% 1), florodeoksiüridin (FDU, 10) takviyeli nörobazal ortamdan oluşan DRG nöron saflaştırma ortamını hazırlayın Μg / mL), ve uridin (10 μg / mL). </li><li> Hamile fareleri 14-15 gebelik haftasında pentobarbital aşırı doz ile kurutun (240 mg / kg vücut ağırlığı, intraperitoneal). </li><li> Kurbağalanmış hayvanları yatay konuma getirin. Karnını% 70 etanol ile iyice temizleyin. </li><li> İnce diseksiyon makası ve forseps kullanarak hayvanın alt karın duvarını boyuna kesin. Diseksiyon makası kullanarak rahmin tanımlanması ve çıkarılması. Embriyonları açığa çıkarmak ve çıkarmak için uterus duvarını kesin. Embriyoları PBS ile dolu steril, 10 cm&#39;lik bir kültür kabına aktarın. Kültüre buz koyun. </li><li> Diseksiyon için hazırlanan embriyo, PBS (oda sıcaklığı) ile dolu steril, 10 cm&#39;lik bir kültür kabına aktarın ve diseksiyon mikroskopunun altında konumlandırın. Embriyo salladı konumda olsun. DEĞİLE: Beyaz renkli omurilik ve eklenen DRG&#39;ler, embriyonun dorsal yüzeyi üzerinde, yarı saydam cildi üzerinden görülebilir. </li><li> Spinal kordun her iki yanından mikro-delici forseps yerleştirin ve çevresindeki yumuşak dokudan omuriliği ayırmaya başlamak için künt diseksiyon uygulayın. Boyun açıklığı ve kuyruk sapı boyunca mikrodiseksiyon forseps kullanarak hayvan ücretsiz omurilik kesin. Çevreleyen yumuşak dokudan kurtarmak için kordonun ventral yüzeyi üzerinde daha fazla künt diseksiyon gerçekleştirin. </li><li> Serbest omuriliğin dorsal yüzeyi üzerinde kalan yumuşak dokuyu çıkarmak için mikroskopi forseps kullanın. NOT: Bu aşamada yalnızca omurilik, sinir kökleri ve bağlı DRG kalmalıdır. </li><li> Mikrodiseksiyon forseps kullanarak bağlanan sinir köklerinden bireysel DRG&#39;ler ayırın. DRG&#39;leri PBS içeren 1.5 mL&#39;lik steril bir santrifüj tüpüne aktarmak için 1 mL&#39;lik bir uça tutturulmuş bir pipet kalemi kullanın. NOT: Her bir 1.5 mL tüp için, maksimum100 DRG barındırabilir. </li><li> 5 dakika için 250 xg&#39;de DRG&#39;leri santrifüjleyin ve rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifine (tüp başına 200 μL) tekrar süspanse edin. 10 dakika inkübe edin (37 ° C,% 5 CO 2 ). 250 xg&#39;de 5 dakika boyunca DRG&#39;leri santrifüjleyin, süpernatanı alın ve DRG nöron bakım ortamında tekrar süspansiyon haline getirin. 200 μL&#39;lik bir pipet ucu kullanarak peleti yumuşak öğütme ile parçalayın. Uygun bir seyreltme işleminden sonra bir hemositometre kullanarak pellet içindeki hücreleri ölçün. </li><li> Hücreleri, hücre başına 1.5 mL DRG nöron bakım ortamında PDL / laminin kaplı 6 oyuklu plakalara 5,000 hücre / cm2 yoğunlukta tohum ekti. Kültür iki gün sonra DRG nöron bakım ortamı çıkarın, PBS ile durulayın ve DRG nöron saflaştırma orta ile değiştirin. NOT: Her saflaştırma döngüsü için DRG kültürlerini saflaştırma ortamı ile 2 gün süreyle, ardından bakım ortamında 1 gün inkübe edin. 3-4 saflaştırma çevriminden sonra, remTüm endojen gliaların oval olması bekleniyor 7 . Bu yaklaşık 14 gün sürmelidir. Saflaştırılmış kültürler, nöronal markör TUJ1 için pozitiflik gösterir ve S100β ekspresyonu için yoktur ( Şekil 5 ). </li></ol></li><li> Schwann hücre benzeri hücrelerin üretilmesi <ol><li> Β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (% 10) ile desteklenmiş αMEM&#39;den oluşan glial indüksiyon ortamını hazırlayın ve P / S (% 1 v / v). </li><li> Bölüm 4&#39;te hazırlanan nevroküreleri, her bir göz başına 1.5 mL glial indüksiyon ortamında cm2 başına 5-10 küre yoğunluğunda plakaya / laminin kaplı 6 oyuklu plakalara yerleştirin. Hücreleri PBS ile duruladıktan sonra glial indüksiyon maddesini her 2 günde değiştirin. NOT: Çekirdekli sinirkürelerden alınan hücrelerin 2. günde dışarı doğru göç ettiği görülmektedir. 7. günde göç eden hücrelerin konik bir görünümü vardır ve Schwann hücresi için immünopozitiflik göstermelidirP75 nörotrofin reseptörü (p75) ve S100β 7 belirteçleri. Bu hücrelere SCLCs denir. </li></ol></li><li> DRG nöronları ile SCLC&#39;lerin birlikte kültürlenmesi <ol><li> 1: 1 hacim / hacim oranında DRG nöron bakım ortamı (adım 5.1.4) ve glial indüksiyon ortamı (adım 5.2.1) içeren kokültür ortamını hazırlayın. </li><li> FBS (% 5), β-Heregulin (10 ng / mL) ve P / S (% 1 v / v) ile takviye edilmiş DMEM / F12&#39;den oluşan Schwann hücre bakım ortamını hazırlayın. </li><li> 7. SCLC&#39;lerden kültür ortamını çıkarın, PBS ile yıkayın ve 5 dakika süreyle 37 ° C&#39;de rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifinin 0,5 mL / çukuru ile inkübe edin. Kültür ortamında SCLC&#39;leri tekrar süspanse edin. </li><li> Uygun bir seyreltme işleminden sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri ölçün. </li><li> Saflaştırılmış DRG nöron kültürlerine SCLC&#39;leri 1,000 hücre / cm2 yoğunluğunda ekti. Her 2 günde bir orta yenileyerek, kültürleri 14 gün boyunca muhafaza edin. NOT: Kokültür sırasında SCLC&#39;ler olgun Schwann hücrelerine özgü iğ benzeri morfolojiyi elde etmiştir ( Şekil 6 ). Bu hücreler, büyüme faktörlerinden çekildikten sonra fenotiplerinde kalır ve aksonları in vitro ve in vivo miyelinasyon yapabilirler 7 , 10 . Schwann hücre belirteçlerinin pozitifliği ( yani, p75 ve S100β) immünofloresans ile izlenmelidir. </li><li> Kokültürü tamamladıktan sonra, kademe 1.2.2&#39;de anlatıldığı gibi, kaderi tamamlayan Schwann hücrelerini geçin. Kuyu başına 0.5 mL ayrışma reaktifi kullanın. Uygun bir seyreltme işleminden sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri ölçün. </li><li> Kaderle bağlı Schwann hücrelerini 10.000 hücre / cm2&#39;lik bir yoğunlukta Schwann hücre bakım ortamında tekrar süspanse edin. İmmünofloresans için PDL / laminin kaplı 6 gözlü plakalara tohum hücreleri. NOT: Kültürler kaçınılmaz olarak bir fibroblastHücre kaderi 7 . Bu hücreler, birlikte yetiştirme tamamlandıktan sonra, kadere bağlı Schwann hücreleriyle birlikte pasajlanır. Bu fibroblast substratumun üzerinde yer alan Schwann hücreleri, başka yerlerde tarif edildiği gibi, PBS&#39;nin (4 ° C) &quot;soğuk jetleri&quot; ile yıkandıktan sonra kolayca sökülebilir ve daha da genişletilebilir. Kadere bağlı Schwann hücreleri bakım ortamında 1 ay boyunca genişletilebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wiliams, R. R., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+transplantation:+a+repair+strategy+for+spinal+cord+injury?.">Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?.</a> Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).</li><li>Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair:+its+significant+therapeutic+potential+and+prospectus.">Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus.</a> Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).</li><li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+human+neurodegenerative+disorders--time+for+clinical+translation?.">Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation?.</a> J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).</li><li>Terzic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Differentiation+of+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+From+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).</li><li>Takashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+cells+supply+an+initial+transient+wave+of+MSC+differentiation.">Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation.</a> Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).</li><li>Felling, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem/progenitor+cells+participate+in+the+regenerative+response+to+perinatal+hypoxia/ischemia.">Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia.</a> J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).</li><li>Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+Schwann+cells+achieve+fate+commitment--a+prerequisite+for+remyelination+therapy.">Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy.</a> Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+development+of+glial+cells+in+peripheral+nerves.">The origin and development of glial cells in peripheral nerves.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).</li><li>Mung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+generation+of+neural+progenitors+from+adult+bone+marrow+stromal+cells+by+hypoxic+preconditioning.">Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).</li><li>Ao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regeneration+of+transected+sciatic+nerves+of+adult+rats+using+chitosan+nerve+conduits+seeded+with+bone+marrow+stromal+cell-derived+Schwann+cells.">The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells.</a> Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).</li><li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+BM+mesenchymal+stem+cells+by+plastic+adhesion+or+negative+selection:+phenotype,+proliferation+kinetics+and+differentiation+potential.">Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).</li><li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mesenchymal+stem+cells:+characterization,+differentiation,+and+application+in+cell+and+gene+therapy.">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li><li>Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+jet:+a+method+to+obtain+pure+Schwann+cell+cultures+without+the+need+for+cytotoxic,+apoptosis-inducing+drug+treatment.">Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment.</a> J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).</li></ol>

Bu yazının tüm yazarları beyan etmek için herhangi bir açıklama yapmamıştır.

Hipoksik ön koşullandırma ve nörosfer kültürünü kullanarak nöral progenitörleri zenginleştirmeden önce MSC&#39;lerin &quot;kök salanlığını&quot; korumak esastır. Tecrübelerimize göre, multipotent MSC&#39;ler, uzatılmış fibroblast benzeri morfolojileri ile güvenilir şekilde tanımlanabilir. Buna karşın, belirgin sitokkelet stres lifleri ile daha yassı, dört köşeli morfoloji benimseyen MSC&#39;ler, nöral hücre kaderlerini kolayca kabul etmemekte ve atılmaları gerekmektedir. Genel olarak,...

Sinir öncüleri ve türevlerinin transplantasyonu, travmatik sinir yaralanması 1 , 2 ve nörodejenerasyon 3 , 4&#39;ü takiben bir tedavi stratejisi olarak vaat ettiğini göstermektedir. Klinik uygulamadan önce aşağıdakileri sağlamak önemlidir: i) otolog bir kök / progenitör hücresi kaynağına erişmek ve genişletmek için bir yöntem ve ii) bunları ilgili, olgun hücre tiplerine yönlendiren bir araç 3 . Omurilik yaralanması için hücre tedavisine olan ilgimiz yetişkin dokulardan nöral progenitörlerin sağlam, otolog bir hücre kaynağı aramamıza neden oldu. MSC&#39;lerin bir alt popülasyonu nöral krestten kaynaklanır ve kemik iliğinden kolaylıkla erişilebilir durumdadır. Bu hücreler nöronlar ve glia üretebilen sinir öncüleridır 5 . Serebral iskemi hayvan modelleri, hipoksinin prol<html> Beyinde nöral progenitörlerin çıkarımı ve multipotansı 6 . Bu, kemik iliği kaynaklı nöral progenitörlerin üzerine genişleme aracı olarak hipoksik ön koşullanmayı kullanma temelini oluşturdu. Yaralı omuriliğe Schwann hücrelerinin transplantasyonu rejenerasyon 2&#39;yi teşvik eder. SCLC&#39;ler, gliogenik faktörlerle ( yani, β-Heregulin, bFGF ve PDGF-AA) destek yoluyla MSC&#39;lerden üretilebilir, ancak fenotipik instabiliteyi gösterirler. Büyüme faktörlerinin geri çekilmesi üzerine, fibroblast benzeri bir fenotipe dönüşürler 7 . Anormal farklılaşma ve karsinogenez riski nedeniyle, hücre transplantasyonunda fenotipik instabilite istenmez. Schwann hücresi prekürsörleri, embriyonik periferik sinir 8 içindeki akson demetleri ile ilişkili olduğu için, saflaştırılmış embriyonik DRG nöronları 7 ile birlikte kültürel SCLC&#39;lere yol açtık ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 9. Elde edilen olgun Schwann hücreleri , in vitro 7 , 9 ve in vivo 10&#39;da kadere bağlı ve ispat fonksiyonudur. MSC&#39;lerden nöral progenitörlerin zenginleştirilmesi için protokolümüz basit ve etkili olup sonraki tahliller için hücre sayısının artmasına neden olur. Kader kaynaklı Schwann hücrelerinin kokültür platformu vasıtasıyla türetilmesi, glial farklılaşmanın incelenmesine ve potansiyel klinik uygulama için stabil ve fonksiyonel Schwann hücrelerinin oluşturulmasına izin verir.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Sigmaaldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermofisher scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biosera</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher scientific</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)</td><td>Thermofisher scientific</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B/100UG</td><td></td></tr><tr><td>Nerve growth factor (NGF)&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin beta-3, EGF domain (&amp;beta;-Her)</td><td>Millipore</td><td>01-201</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigmaaldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluro-2&#039; - deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (PDL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P7886-1G</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermofisher scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin (P/S)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>10 cm plate for adherent culture</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Used for selection of MSCs by tissue culture adherence</td></tr><tr><td>6-well plate for adherent culture</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>Used for expansion of MSCs following passaging</td></tr><tr><td>UltraLow 6-well plate for non-adherent culture</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Used for neural progenitor enrichment</td></tr><tr><td>anti-human CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>555593</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>550256</td><td></td></tr><tr><td>anti-human/rat STRO-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1038</td><td></td></tr><tr><td>anti-human nestin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555480</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>554895</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>551123</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat nestin</td><td>BD Biosciences</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100&amp;beta;</td><td>Dako</td><td>Z031101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p75</td><td>Millipore</td><td>MAB5386</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Sigmaaldrich</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human nuclei</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia chamber</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

hypoxic preconditioning of marrow-derived progenitor cells as a source for the generation of mature schwann cells

Bu el yazması, kemik iliği stromal hücresi (MSC) popülasyonundan nöral progenitörler için zenginleştirmek ve bundan sonra olgun Schwann hücre kaderini yönlendirmek için bir araç tanımlamaktadır. Sıçan ve insan MSC&#39;leri, epidermal büyüme faktörü (EGF) / bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) takviyesi ile düşük bağlanma alt tabakasında nörosferler olarak genişleyen, ardından geçici hipoksik koşullara (1 saat boyunca% 1 oksijen) tabi tutuldu. Neurospheres, poli-D-lizin / laminin kaplı doku kültürü plastik üzerine ekildi ve Schwann hücresi benzeri hücreleri (SCLC&#39;ler) üretmek için β-Heregulin, bFGF ve trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF) içeren bir gliojenik kokteylde kültürlendi. SCLC&#39;ler, E14-15 gebe Sprague Dawley sıçanlarından elde edilen saflaştırılmış dorsal kök gangliyon (DRG) nöronları ile 2 hafta boyunca kokültür yoluyla kader taahhüdüne yönlendirildi. Olgun Schwann hücreleri S100β / p75 ekspresyonunda kalıcılık sergiler ve miyelin segmentleri oluşturabilir. Bu şekilde üretilen hücrelerin potansiyelleriOmurilik hasarını takiben otolog hücre transplantasyonunda ve hastalığın modellemesinde uygulanmalar.

Protokolümüzdeki başlıca aşamalara genel bir bakış Şekil 1&#39;de gösterilmektedir. Özetle, sıçan ve insan MSC&#39;leri, doku kültürü plastiğine uyularak seçilir. Genişletilmiş MSC&#39;ler hipoksi ile önkoşullandırılır ve daha sonra nörosfer oluşturan koşullara tabidir. Neurospheres kaplanır ve SCLCs ayrımına izin verilir. SCLC&#39;ler, kadere bağlı Schwann hücreleri oluşturmak için saflaştırılmış DRG nöronlarıyla bi...

Watch this Scientific Journal Video about Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells at JoVE.com

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Sinirsel potansiyeli olan ilik stromal hücreleri (MSC&#39;ler) kemik iliğinde mevcuttur. Protokolümüz hipoksik ön koşullandırma yoluyla bu hücre popülasyonunu zenginleştirir ve bundan sonra onları olgun Schwann hücreleri haline getirir.

Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

hypoxic-preconditioning-marrow-derived-progenitor-cells-as-source-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.3K Görüntüleme.  The University of Hong Kong.  Sinirsel potansiyeli olan ilik stromal hücreleri (MSC'ler) kemik iliğinde mevcuttur. Protokolümüz hipoksik ön koşullandırma yoluyla bu hücre popülasyonunu zenginleştirir ve bundan sonra onları olgun Schwann hücreleri haline getirir. 

Video: Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Nörobilim

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Biyoloji

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Schwann Hücre Fenotip Spesifikasyonunu Değerlendirmek Için Hücre Dışı Matriks Mikroortamlarının Hazırlanması

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Biyomühendislik

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

<meta charset="utf8"></head><body>Işınlanmış farelerde etkili HSCT için osteo-organoid türevli hücreler

In Vivo Osteo-organoid Approach for Harvesting Therapeutic Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an adequate source of HSPCs, we developed an in vivo osteo-organoid by implanting scaffolds loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) into an internal muscle pouch near the femur in mice. After 12 weeks of implantation, we retrieved the in vivo osteo-organoids and conducted flow cytometry analysis on HPSCs, revealing a significant presence of HSPC subsets within the in vivo osteo-organoids.
We then established a sublethal model of hematopoietic/immune system injury in mice through radiation and performed hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) by injecting the extracted osteo-organoid-derived cells into the peripheral blood of radiated mice. The effect of hematopoietic recovery was evaluated through hematological, peripheral blood chimerism, and solid organ chimerism analyses. The results confirmed that in vivo osteo-organoid-derived cells can rapidly and efficiently reconstruct damaged peripheral and solid immune organs in irradiated mice. This approach holds potential as an alternative source of HSPCs for HSCT, offering benefits to a larger number of patients.

<meta charset="utf8"></head><body>Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Here, we established in vivo osteo-organoids triggered by bone morphogenetic protein-2-loaded gelatin scaffolds to harvest therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells for the reconstruction of a damaged hematopoietic and immune system. Overall, this approach can provide a promising cell source for cell therapies.

Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Schwann Hücre Fenotip Spesifikasyonunu Değerlendirmek Için Hücre Dışı Matriks Mikroortamlarının Hazırlanması

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi