Guikema laboratuarında yapılan araştırmalar, Hollanda Bilimsel Araştırmalar Örgütü (VIDI hibesi 016126355) ve &#39;Stichting Kinderen Kankervrij&#39; KiKA (proje 252) &#39;nin Yenilikçi Araştırma Teşvik Planı tarafından finanse edilmektedir.

1. Hücrelerin ve DNA hasar indüksiyonunun tedavisi <ol><li> % 20 FCS, 50 uM β-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomis ile desteklenmiş IMDM&#39;de insan BCR-ABL + B hücresi akut lenfoblastik hücre hatları BV173 veya SUP-B15 kültüründe 37 ° C&#39;de% 5 C02 atmosferi altında karıştırın. Hücreleri ve plakaları 6 kuyucuklu plakalarda 5 mL / çukurlukta 2 x 106 hücre / mL&#39;de sayın. NOT: İsteğe bağlı olarak çeşitli kökenli süspansiyon hücre hatları kullanılabilir. </li><li> BCR-ABL + B-ALL hücrelerini hücre döngüsünün G1 fazında tutmak için 5 μM imatinib metansülfonat (STI571) ekleyin ve gece boyunca inkübe edin. <ol><li> İsteğe bağlı olarak, hücre döngüsü boyunca veya BCR-ABL-negatif hücre tiplerinde protein-protein etkileşimlerini incelerken bu adımı atlayın. </li></ol></li><li> Kültür 50 ng / mL neocarzinostatin (NCS) ekleyerek DNA hasarını indükleyin ve 2 saat inkübe edin. <ol><li> Alternatif olarak,0.5 Gy / dak&#39;da bir radyoaktif kaynak [ 137 Cs] kullanarak 5 Gy&#39;lik bir dozda hücrelere ışın saçarak DNA hasarını uyandırır. Işınlama sonrasında, hücrenin% 5 CO2&#39;lik bir atmosferde 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle bekletilmesine izin verin. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı olarak, DNA hasarına tepki olarak ATM kinaz aktivitesinin katılımını değerlendirmek için, NCS ilavesi veya ışınlama tedavisinden önce ATM kinaz inhibitörü KU55933&#39;ü 5 uM ekleyin. </li><li> Bir beher veya Erlenmeyer şişesi içinde 50 mL 1x PBS üzerine 5 g fraksiyon-V BSA katmanlayarak 1x PBS +% 10 BSA hazırlayın ve BSA çözünene kadar bekletin. Çalkalamayın ya da karıştırmayın, bunun nedeni geniş köpürmeye neden olacaktır. 0.22 μm&#39;lik bir filtreden yavaşça filtre edin ve buzda tutun. </li><li> Hücreleri hasat edin ve buz soğukluğunda 1x PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri sayın ve 1 x PBS +% 10 BSA içinde 2 x 10 6 / mL&#39;de tekrar süspansiyon haline getirin. Hücreleri buzda tutun. </li></ol> 2. Sitokentrifugasyon, fiksasyon ve permeabilizasyon <ol><li> Hazırla1x PBS içinde taze% 4 paraformaldehid solüsyonu. 50 mL 1x PBS&#39;ye 2 g PFA ilave edin ve solüsyon berrak oluncaya kadar 55 ° C&#39;lik bir çalkalama suyu banyosunda inkübe edin. Çözeltiyi 0.22 um&#39;lik bir filtreden geçirin ve kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın. NOT: İsteğe bağlı olarak,% 4 PFA sabitleyici, -20 ° C&#39;de dondurulmuş olarak depolanabilir. Donduktan sonra, yalnızca bir kez çözülmeye başlayın. Aksi takdirde, PBS&#39;deki% 4 PFA solüsyonu doğrudan satın alınabilir. </li><li> Tiftiksiz dokuyla 76 mm x 26 mm&#39;lik mikroskopi slaytlarını dikkatlice cilalayın ve 5 dakika boyunca bir Coplin kavanozunda% 96 etanol koyarak yağdan arındırın. Mikroskopi 10 dakika boyunca hava ile kurutulsun. </li><li> Mikroskopi slaytlarını 6 mm&#39;lik bir alana sahip sitospin / sitoloji hunilerine yerleştirin. Prekat her huniye 50 μL 1x PBS +% 10 BSA pipetle ve 500 rpm&#39;de 1 dakika santrifüj ederek kayar. </li><li> Her huniye 100 uL hücre süspansiyonu (0.2 x 10 6 hücreye eşittir) ilave edin ve 500 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Her bir antikor kombinasyonu için,Ast 4 preparatları gereklidir (çift antikor deneyi; iki tek antikor kontrolü; antikor kontrolü yok). </li><li> Hunileri dikkatli bir şekilde sökün ve lekelere dokunmamaya dikkat edin. Hemen örnek sabitlemeye devam edin. <ol><li> İsteğe bağlı olarak, slaytları en az 30 dakika boyunca hava ile kurutun. Hava ile kurutulduktan sonra, sarma aluminyum folyoya ayrı ayrı kaydırın ve kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklayın. Dondurulmuş müstahzarları kullanırken, slaytlara aşırı yoğunlaşmamasını sağlamak için kağıt havlu sarılı slaytları çözdüğünüzden emin olun. </li></ol></li><li> PAP kalemi bir sıvı bloke ediciyi kullanarak (5 mm uç) nokta etrafında bir daire çizin (yaklaşık 15-20 mm çapında). </li><li> Her noktaya 50 μL% 4 PFA fiksasyon çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Nazik bir çalkantı ile oda sıcaklığında Coplin kavanozunda 1x PBS ile 5 dakika boyunca hücreleri yıkayın. </li><li> Slaytları lifsiz bir doku ile lekeler etrafında kurutun ve noktadan mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın.Noktaya dokunmadan veya slayt yatırmadan hayvan. Her bir noktaya 1x PBS 50 mcL% 0.25 Triton-X ekleyin ve ajitasyon olmadan oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. </li><li> Slaytları Coplin kavanozunda TBS (TBS-T) içinde ~ 50-60 mL% 0.05 Tween-20 içinde 5 dakika yavaşça ajitasyonla oda sıcaklığında 3 kez yıkayın. 10 slayt aynı anda bu şekilde işlenebilir. </li></ol> 3. Engelleme ve Birincil Antikor İnkübasyonu <ol><li> TBS-T&#39;den dokunun ve slaytları tüysüz bir doku ile lekeler etrafında kurutun. Noktaya değmeden veya slaydı eğerek bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla sıvı alın. Kısa sürede engelleme solüsyonunu vorteksleyin ve her bir noktaya bir damla (~ 40 μL) ekleyin. 1 saat süreyle 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. </li><li> Antikor kokteylini, ticari antikor seyrelticisindeki 1: 100&#39;de tavşan-anti-fosfo-Ser15-p53 ve tavşan-anti-fosfo-Ser15-p53&#39;ü kullanmadan önce vorteks antikor seyrelticisi ile karıştırarak keçi-anti-ATM&#39;yi karıştırarak hazırlayın. Kontrol deneyi içinSadece keçi-anti-ATM ve sadece tavşan-anti-fosfo-Ser15-p53 antikoru (tek antikor kontrolleri) içeren antikor seyreltmeleri hazırlayın. </li><li> Blokaj çözeltisinden dokunun ancak antikor seyreltiklerini ilave etmeden önce hücrelerin kurumasına izin vermeyin. Her antikor kokteyl seyreltme 30 mcL ekleyin ve gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Yerinde Yıkama Tamponu A ve Yıkama Tamponu B&#39;yi, bir kutu Tampon A ve Tampon B karışımı içeriğini, her biri 1.000 mL suyun son hacminde eriterek hazırlayın. <ol><li> Alternatif olarak, 8.8 g NaCl, 1.2 g Tris-baz ve 0.5 mL Tween-20&#39;nin 800 mL su içerisinde çözündürülmesi ile yıkama tamponu A hazırlanır. HCI kullanarak pH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın ve son 1000 mL&#39;ye ekleyin. </li><li> Alternatif olarak, 5.84 g NaCI, 4.24 Tris-baz ve 26.0 g Tris-HCl&#39;yi 500 mL su içinde çözerek Yıkama Tamponu B&#39;yi hazırlayın. HCI kullanarak pH&#39;ı 7.5&#39;e ayarlayın. 1.000 mL&#39;lik bir son hacme su ilave edin. </li><li> filtreHer iki çözüm de 0.22 um&#39;lik bir filtreden geçirilir. </li></ol></li><li> Slaytları Coplin kavanozunda 1x yerinde yıkama tamponu A ile 5 dakika 2 kez yavaşça çalkalamak suretiyle oda sıcaklığında yıkayın. </li></ol> 4. PLA Probları, Ligasyon ve Amplifikasyon <ol><li> Ticari antikor seyrelticisinde anti-keçi PLUS ve anti-tavşan MINUS&#39;u 1: 5 seyrelterek PLA probları hazırlayın. Slaytlardan 1x yerinde yıkama tamponu A&#39;ya dokunun ve her bir noktaya 30 uL PLA prob karışımı ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. NOT: Uygulanan birincil antikorlar farklı türlerde yetiştirildiği sürece PLUS ve MINUS PLA süpürgelerinin herhangi bir kombinasyonu (anti-fare, anti-tavşan, anti-keçi) kullanılabilir ve PLA probları kombinasyonu daima Bir PLUS probu ve bir MINUS probu içerir. </li><li> Slaytları, Coplin kavanozunda ~ 50-60 mL 1x yerinde yıkama tamponu A ile 5 dakika 2 kez yavaşça çalkalamak suretiyle oda sıcaklığında yıkayın. &lt;/ Li&gt; <li> Ligasyon çözeltisinin 39 uL&#39;sine 1 μL ligaz ekleyerek Ligasyon-Ligaz çözeltisini buz üzerinde hazırlayın ve her bir noktaya 40 μL Ligasyon-Ligaz çözeltisi ekleyin. 30 dakika 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. </li><li> Slaytları, Coplin kavanozunda ~ 50-60 mL 1x yerinde yıkama tamponu A ile 5 dakika boyunca yavaşça çalkalamak suretiyle oda sıcaklığında 2 kez yıkayın. </li><li> Amplifikasyon polimeraz karışımını, suda Amplifikasyon stok solüsyonunu 1: 5 seyrelterek buz üzerinde hazırlayın. Daha sonra, her bir nokta için 39.5 μL 1x Amplifikasyon solüsyonuna 0.5 μL polimeraz ekleyin. NOT: Güçlendirme reaktifleri ışığa karşı duyarlıdır ve doğrudan ışığa maruz kalmaya karşı korunmalıdır. Güçlendirme reaktifi dört farklı renkte (RED: uyarma 594 nm, emisyon 624 nm; FarRED: uyarma 644 nm, emisyon 669 nm; ORANGE: uyarma 554 nm, emisyon 576 nm; YEŞİL: uyarılma 501 nm, emisyon 523 nm) Mevcut mikroskopik kurulumunUygun uyarılma özellikleri ve bu renkleri görüntüleme filtreleri. </li><li> 1x yerinde yıkama tamponu A&#39;ya dokunun ve spot başına 40 μL Amplification-Polymerase karışımı ekleyin. Isıtılmış nemli bir odada 37 ° C&#39;de 100 dakika inkübe edin. </li></ol> 5. Montaj ve Görüntüleme <ol><li> 99 mL suya 1 mL Yıkama Tamponu B ekleyerek 0.01x yerinde yıkama tamponu B hazırlayın. </li><li> Amplification-Polimeraz karışımını hafifçe çalkalamak suretiyle oda sıcaklığında bir Coplin kavanozunda 1x yerinde yıkama tamponu B ile 10 dakika boyunca 2 kez yıkayın. </li><li> Slaytları 0.01x yıkama tamponu B&#39;de 1 dakika yıkayın. </li><li> Fazla 0.01x yıkama tamponu B&#39;ye dokundurun ve slaytları tüy bırakmayan bir doku ile lekeler etrafında kurutun. Noktaya değmeden veya slaydı eğerek bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla sıvı alın. </li><li> Çekirdeklerin aşırı boyanmasını önlemek için DAPI içermeyen montaj ortamında DAPI içeren montaj ortamı 1: 5 oranında seyreltilir. </li><li> Bir 24 mm x 24 mm lamel 25-30 μL 1: 5 DAPI içeren montaj medyumu ekleyin ve kapak kayma slayt ile almak, sıkışmış hava kabarcığı olmadığından emin olmak için hafif basınç uygulanır. Lambayı oje ile mühürle ve görüntülemeden önce en az 15 dakika bekle. </li><li> Slaytları bir (konfokal) floresan mikroskopu kullanarak analiz edin. <ol><li> İşlenen hücrelerde beklenen ortalama 7 ± 5 sinyali kullanarak bir güç hesaplamasına dayalı olarak, en az 4 çekim görüntü alanında (20x objektif, koşul veya antikor kombinasyonu başına en az 20 hücre sayan) hücre başına punktaki PLA sinyallerinin sayısını sayın, Ve işlenmemiş hücrelerde 2 ± 2 sinyal, 0.05&#39;lik bir tip-hata olasılığı ve daha önce bildirildiği gibi% 80&#39;lik bir güç ihtimali 15 ). NOT: En iyi çözünürlük, yazılım paketleri kullanılarak bir Z-yığını ve dekonvolüsyonun edinilmesi ile elde edilir ( örneğin , ImageJ, Leica Edinme Paketi (LAS)). SignaDAPI boyama ile tanımlandığı gibi, nükleer çevre içinde kolayca tanınmalı olmalıyım. </li><li> Çekirdeklerin dışında açıkça görülen sinyalleri saymayın. Tipik olarak, NCS tedavisi veya γ-ışınlaması hücre başına yaklaşık 5-10 phosho-p53 / ATM PLA sinyali ile sonuçlanır. &#39;Tek antikorlu&#39; kontroller bazı arka plan sinyali verebilir, ancak her 20 hücreden 1&#39;inde 1-2 PLA sinyali geçmemelidir. </li><li> Yayın ve sunum amacıyla, 40X veya 63X daldırma yağı objektifini kullanarak görüntü yakalayın. Slaytlar 4 ° C&#39;de saklanabilir ve ışık maruziyetine karşı korunmalıdır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+Sensing+by+the+ATM+and+ATR+Kinases.">DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).</li><li>Huen, M. S. Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+checkpoint+and+repair+machineries+at+DNA+damage+sites.">Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites.</a> Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).</li><li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+and+ATR+substrate+analysis+reveals+extensive+protein+networks+responsive+to+DNA+damage.">ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage.</a> Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).</li><li>Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+selectively+regulates+distinct+p53-dependent+cell-cycle+checkpoint+and+apoptotic+pathways.">Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways.</a> Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).</li><li>Tibbetts, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+ATR+in+the+DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53.">A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53.</a> Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+Multicolor+Imaging+of+the+Nuclear+Periphery+with+3D+Structured+Illumination+Microscopy.">Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).</li><li>Gullberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sense+of+closeness:+protein+detection+by+proximity+ligation.">A sense of closeness: protein detection by proximity ligation.</a> Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Dong, Y., Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+immunosensing+using+antigen+and+antibody+monolayers+on+gold+surfaces+with+electrochemical+and+scanning+probe+detection.">Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection.</a> Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li><li>Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+DNA+repair+mechanisms+in+common+hematological+malignancies.">Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies.</a> Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).</li><li>Rendleman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+DNA+repair+pathways+and+risk+of+non-Hodgkin's+lymphoma.">Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma.</a> PloS One. 9 (7), e101685 (2014).</li><li>Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Damage+Response+Regulates+RAG1/2+Expression+in+Pre-B+Cells+through+ATM-FOXO1+Signaling.">The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling.</a> J Immunol. , (2016).</li><li>Banin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+phosphorylation+of+p53+by+ATM+in+response+to+DNA+damage.">Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage.</a> Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu raporda, süspansiyon hücre kültürlerinde proteinler arasındaki spesifik etkileşimi belirlemek ve görselleştirmek için PLA&#39;nın kullanılabileceği gösterilmiştir. Not burada, burada açıklanan protokol, DNA tamir kompleksleri çalışması ile sınırlı değildir, aynı zamanda süspansiyon hücre kültürlerinde diğer protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek ve ölçmek için de geçerlidir. ATM kinazı, bir DNA hasarını tetikleyen ajana maruz bırakıldığında G1 ile tutuklanmış BC...

DNA hasarı, protein-protein etkileşimleri ve DNA&#39;nın etkin ve hızlı onarımını sağlayan translasyon sonrası modifikasyonlar içeren ve genomik bütünlüğünü koruyan, oldukça düzenlenen bir dizi olayı tetikler. Tipik olarak, DNA onarımı (konfokal) flüoresan mikroskopisi ile iyonize edici radyasyona bağlı odakların (IRIF) oluşumunu izleyerek iyonize radyasyona maruz kalan hücrelerde incelenir. Birçok DNA onarımı ve DNA hasar algılayan proteinler, DNA hasarını sürdüren kromatin bölgelerinde çekirdekleşen protein komplekslerini temsil eden IRIF&#39;leri oluşturur 2 , 3 . IRIF&#39;lerin zaman içindeki yeri ve çözünümü, DNA onarımının spatiotemporal düzenlenmesi ile ilgili önemli bilgiler verir ve farklı DNA onarım yollarının katılımını gösterebilir. Hasar görülen DNA hasarının ve hücre döngüsünün evresi hangi DNA onarım yolunun aktive edildiğini belirler. fo<html> R örneğinde aktif olarak DNA kopyalama (S fazı) yapan hücrelerde homolog rekombinasyon (HR) dominant DNA tamir yoludur, oysa hücre döngüsünün G1- veya G2 / M-fazındaki hücrelerde, Homolog son katılma (NHEJ) onarım yolu baskın. DNA hasarını takiben en erken olaylardan biri, çoğunlukla hücre döngüsünün G1 ve G2 / M fazlarında aktif olan ve NHEJ&#39;i düzenleyen DNA hasar algılayan kinazların hareketsiz kılınması olan Ataksi Telenjiektazi Mutasyonlu protein (ATM) Ve Ataxia Telangiectasia ve HR&#39;yi aktive ederek S fazında hareket eden Rad3 ile ilgili protein (ATR). Hem ATM hem de ATR, DNA onarımı, hücre ölümü ve hayatta kalma 4 ile ilgili birçok proteini fosforile eden çok pleiotropik kinazlardır. Her iki kinazın da genotoksik strese maruz kaldıktan sonra p53 tümör süpresör proteinini fosforile ettiği ve aktive ettiği gösterilmiştir; bu kinazlar, pivotal bir tümör baskılayıcı sinyal ekseni&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 . IRIF&#39;lerin oluşumu ve bileşimi tipik olarak, çift renkli immünofloresan boyama ve mikroskopi kullanılarak farklı proteinlerin birlikte lokalizasyonunun belirlenmesiyle değerlendirilir; bununla birlikte, onarım protein komplekslerinin bir parçası olan tüm proteinler, bu yaklaşımın uygulanabilirliğini sınırlayan IRIF&#39;leri oluşturmaz. Dahası, (konfokal) immünofloresan mikroskopisi, ışığın kırınım özellikleri ile sınırlandırılır ve yaklaşık 200-300 nm&#39;lik oldukça zayıf bir uzaysal çözünürlük ile sonuçlanır ve çoğu hücre içi yapının boyutunu aşar ve esasen protein-protein etkileşimlerinin doğrudan sorgulanmasını engeller Moleküler seviyesi. Bu nedenle, (konfokal) floresan mikroskopisi ile tespit edilen immünofloresan boyama modellerinin birlikte lokalizasyonu doğrudan protein-protein etkileşimleri için bir gösterge değildir. Son zamanlarda, üç boyutlu yapı gibi yeni süper çözünürlük teknolojileri geliştirildiKonfokal lazer taramalı mikroskopi 8 ile tespit edilemeyen bu proteinlerin mekansal dağılım özelliklerini ortaya çıkaran, 53BP1 ve BRCA1 IRIF oluşumunu nano ölçekli detaylı olarak incelemek için başarıyla kullanılan tüylü aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) 7&#39;yi test etti. İmmünopresipitasyon, çekme metodları ve maya iki hibrid tarama yaklaşımları gibi in vivo protein-protein etkileşimlerini saptamak için başka birçok yöntem kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknikler oldukça hantaldır, büyük miktarlarda hücre veya protein gerektirir veya deneysel eserler getiren proteinlerin aşırı ekspresyonunu içerir. Yakın bir zamanda, Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 olarak adlandırılan yerinde ( yani hücrelerde ve dokularda) protein-protein etkileşimlerinin görselleştirilmesini ve nicelenmesini sağlayan yeni bir teknik geliştirildi. PrIlgili iki proteini tanıyan immün antikorlar, oligonükleotidlere konjuge edilmiş ikincil antikorlar (PLA probları olarak adlandırılır) tarafından tespit edilir. İki farklı ikincil antikor, primer antikorlar tarafından tanınan proteinler arasındaki etkileşimler nedeniyle yeterince yakınsa, konjüge edilmiş oligonükleotidler hibridize olur ve bir kapalı dairesel DNA substratı oluşturmak üzere bağlanabilir. Bu dairesel substrat daha sonra yuvarlanan daire amplifikasyonu ile büyütülür ve florokrom-konjüge tamamlayıcı oligonükleotitler ile görselleştirilir. PLA kullanılarak, protein-protein etkileşiminin subselüler lokalizasyonu, floresan etiketli yuvarlanan daire yükseltme-ürünü PLA problarına bağlı kaldığı için korunur. Bu testin çözünürlüğü, bir antikor çapının yaklaşık 7-10 nm 11 olduğu bulgusuna dayanarak &lt;50 nm&#39;dir. Haddeleme dairesi amplifikasyonu ancak iki çift antikor (birincil + seconDary), boyutları (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm) ile tanımlanan çevre içerisinde fiziksel olarak etkileşime girer. Sinyal yükseltme basamağı, PLA tahlilinin duyarlılığını arttırır ve az miktarda eksprese edilen proteinlerin etkileşimlerinin saptanmasını sağlar. PLA, hücre bazında nicelleştirilebilen, protein-protein etkileşimlerindeki hücre içi ve hücreler arası değişimi değerlendirilebilecek noktasal, odaklar benzeri sinyal kalıpları üretir. DNA tamir kompleksleri ve IRIF&#39;lerin oluşumu ve bileşimi, insan kemik osteosarkom epitel hücre hattı U2OS, insan embriyonik böbrek hücre hattı HEK293 ve retinal pigment epitelyal hücre hattı RPE-1 gibi hızlı yapışan hücre hatlarında, Büyümek ve transfekte etmek kolaydır. Süspansiyon hücre kültürleri böyle bir lenfoid ve miyeloid hücre dizisi daha az kullanılır, çünkü bunlar transfeksiyona daha az yatkındır ve genellikle lamelleri tutmaz, bu nedenle ek / alternatif st gerektirirGörüntüleme için eps. Ancak DNA hasarının cevabı lenfoid ve miyeloid maligniteler bağlamında çok önemlidir çünkü DNA hasar tepkisi, bu tümörlerde genomik (sürücü) sapmalar tarafından sıklıkla etkilenir ve normal lenfoid ve miyeloid malign transformasyonunda önemli bir rol oynamaktadır ( Progenitör) hücreler 12 , 13 , 14 . Bu protokol, süspansiyon hücre kültürlerinde DNA hasarının indüklenmesinden sonra protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek ve ölçmek için PLA&#39;nın nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Burada, PLA, bir G1-fazlı hücre döngüsü tutuklanmasına neden olan insan B-hücresi lösemi hücrelerinde, DNA hasarı üzerine ATM ve p53 arasındaki etkileşimleri belirlemek ve görselleştirmek için gerçekleştirilir. Burada verilen protokol, G1 ile tutuklanan lösemi hücrelerinde ATM ve p53 etkileşimlerinin incelenmesi ile sınırlı değildir, ancak diğer protein-protein interaktılarını da görselleştirmek için kullanılabilirÇeşitli hücre tiplerinde ve süspansiyon hücre kültürlerinde.

<table><tbody><tr><td>BV173 cell line</td><td>DSMZ</td><td>AC-20</td><td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td></tr><tr><td>SUP-B15 cell line</td><td>DSMZ</td><td>ACC-389</td><td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>lot #: 064M3396</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>imatinib methanesulfonate</td><td>LC Laboratories</td><td>I-5508</td><td>Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution</td></tr><tr><td>neocarzinostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td>Mutagenic/teratogenic, handle with care</td></tr><tr><td>KU55933</td><td>Selleckchem</td><td>S1092</td><td>Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution</td></tr><tr><td>Starfrost Microscopy Slides</td><td>Waldemar Knittel</td><td>VA11200 003FKB</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen liquid blocker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin funnel</td><td>Q Path Labonord SAS</td><td>003411324</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DUO92105</td><td>Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green</td></tr><tr><td>goat-anti-ATM</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-136A</td><td>PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies</td></tr><tr><td>rabbit-anti-phospho-Ser15-p53</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9284</td><td>We succesfully used lot #9284-4 in our studies</td></tr><tr><td>Vectashield antifading mounting medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifading mounting medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Also available from various other vendors</td></tr></tbody></table>

detection and visualization of dna damage-induced protein complexes in suspension cell cultures using the proximity ligation assay

DNA hasarına tepki, kendiliğinden oluşan, genotoksik stresin neden olduğu DNA lezyonlarının onarımını düzenler veya lenfositlerde programlanmış DNA kopmaları bağlamında görülür. Ataksi-Telenjiektazi Mutasyona uğramış kinaz (ATM), ATM ve Rad3-İlgili kinaz (ATR) ve DNA&#39;ya bağlı Protein Kinaz&#39;ın (DNA-PKcs) katalitik altbirimi DNA hasarının indüksiyonu üzerine aktive edilen ilk maddeler arasındadır ve DNA onarımını, apoptozu ve hücre sağkalımını kontrol eden bir ağın merkezi regülatörleri. Bir tümör baskılayıcı yolağın bir parçası olarak, ATM ve ATR p53&#39;ü fosforilasyon yoluyla aktive ederek p53&#39;ün transkripsiyonel aktivitesini düzenler. DNA hasarı da, DNA hasar alanındaki birikir DNA hasar sensörü ve onarım proteinlerinin komplekslerini temsil eden iyonize edici radyasyona neden olan odakların (IRIF) oluşumuyla sonuçlanır; bunlar, floresan mikroskobu ile görselleştirilir. Bununla birlikte, IRIF&#39;lerdeki proteinlerin birlikte lokalizasyonu mutlaka dFloresan mikroskopisinin çözünürlüğü sınırlı olduğu için, protein-protein etkileşimlerini geliştirin. In situ Proximity Ligation Assay (PLA), benzeri görülmemiş özgünlük ve duyarlılıkla hücrelerdeki ve dokulardaki protein-protein etkileşimlerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlayan yeni bir tekniktir. Bu teknik ilgi proteinlerine spesifik antikorların uzaysal yakınlığına dayanır. Sorgulanan proteinler 40 nm&#39;de olduğunda, bir amplifikasyon reaksiyonu, antikorlara konjuge edilmiş oligonükleotidler tarafından tetiklenir ve amplifikasyon ürünü, etkileşen proteinlerin subselüler konumuna karşılık gelen bir sinyal veren floresan etiketleme yoluyla görselleştirilir. Örnek olarak ATM ve p53 arasında kurulan işlevsel etkileşimi kullanarak burada PLA&#39;nın DNA hasar yanıtının ayrılmaz parçaları olan proteinler arasındaki doğrudan etkileşimleri incelemek için süspansiyon hücre kültürlerinde nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Serum 15 kalıntısında p53&#39;ün fosforilasyonunun ATM kinaz aktivitesine 16 bağlı olduğu gösterildi. Süspansiyon hücre kültürlerinin sitospin preparatlarında PLA tekniğinin özgüllüğünü göstermek ve doğrulamak için, hücre döngüsünün G1 fazında tutulan BCR-ABL + B-ALL hücrelerinin 2 saat boyunca NCS ile işleme tabi tutularak DNA hasarının indüklenmesinin gösterildiği Beklendiği gibi ATM ve fosfo-Ser15-p53 arasındaki spesifik et...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) &#39;nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

detection-visualization-dna-damage-induced-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.9K Görüntüleme.  Academic Medical Center, University of Amsterdam, Lymphoma and Myeloma Center Amsterdam (LYMMCARE).  Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir. 

Video: Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Biyomühendislik

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Genetik

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Biyokimya

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by homologous recombination (HR). In addition, HR represents an important mechanism of replication fork rescue following stalling or collapse. The regulation of the many reversible and irreversible steps of this complex pathway promotes its fidelity. The physical analysis of the recombination intermediates formed during HR enables the characterization of these controls by various nucleoprotein factors and their interactors. Though there are well-established methods to assay specific events and intermediates in the recombination pathway, the detection of D-loop formation and extension, two critical steps in this pathway, has proved challenging until recently. Here, efficient methods for detecting key events in the HR pathway, namely DNA double-stranded break formation, D-loop formation, D-loop extension, and the formation of products via break-induced replication (BIR) in Saccharomyces cerevisiae are described. These assays detect their relevant recombination intermediates and products with high sensitivity and are independent of cellular viability. The detection of D-loops, D-loop extension, and the BIR product is based on proximity ligation. Together, these assays allow for the study of the kinetics of HR at the population level to finely address the functions of HR proteins and regulators at significant steps in the pathway.

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

The D-loop capture (DLC) and D-loop extension (DLE) assays utilize the principle of proximity ligation together with quantitative PCR to quantify D-loop formation, D-loop extension, and product formation at the site of an inducible double-stranded break in Saccharomyces cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Algılama<em&gt; In Situ</emEn&gt; Protein-protein kompleksleri<em&gt; Drosophila</emProximity ligasyon Testi Kullanımı&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Nörobilim

Proximity Ligation Assay to Study Oncogene-Derived Transcription-Replication Conflicts

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. Conflicts between the replication and transcription machinery, termed transcription-replication conflicts (TRCs), pose a considerable risk to genome stability, a critical factor in cancer development. While several factors regulating these collisions have been identified, pinpointing primary causes remains difficult due to limited tools for direct visualization and clear interpretation. In this study, we directly visualize TRCs using a proximity ligation assay (PLA), leveraging antibodies specific to PCNA and phosphorylated CTD of RNA polymerase II. This approach allows precise measurement of TRCs between replication and transcription processes mediated by RNA polymerase II. The method is further enhanced through DNA primers conjugated covalently to these antibodies, coupled with PCR amplification using fluorescent probes, providing a highly sensitive and specific means of detecting endogenous TRCs. Fluorescence microscopy enables the visualization of these conflicts, offering a powerful tool to study genome instability mechanisms associated with cancer. This technique addresses the gap in direct TRC visualization, allowing for a more comprehensive analysis and understanding of the underlying processes driving genome instability in cells.

Here, we present a sensitive and specific method to detect oncogene-induced transcription-replication conflicts (TRCs) using the proximity ligation assay (PLA). This approach leverages specific antibodies targeting PCNA and phospho-CTD RNAPII, enabling the assessment of TRC prevalence between RNA polymerase II transcription and DNA replication machinery.

Onkogenden Kaynaklı Transkripsiyon-Replikasyon Çatışmalarını İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. ...

Kanser Araştırmaları

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Biyoloji

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

<meta charset="utf8"></head><body>DNA hasarında protein etkileşimi ve lokalizasyonunun değerlendirilmesi

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: DNA Hasar Yanıtındaki Protein Etkileşimlerini Karakterize Etmek için Yakınlık Ligand Testini Gama-H2AX Boyama ile Birleştirme

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

Algılama

Onkogenden Kaynaklı Transkripsiyon-Replikasyon Çatışmalarını İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi