Bu çalışma kısmen Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitülerinden (CIHR) hibeler tarafından desteklenmektedir. Winnipeg&#39;daki Victoria Genel Hastanesi&#39;ndeki Uygulamalı Araştırma ve Eğitim Klinik Enstitüsüne ve Winnipeg&#39;taki Seven Oaks Genel Hastanesine, insan deneklerinden klinik örnekleri yönettikleri için teşekkür ediyoruz. Tahlil operasyon stratejileri hakkında yararlı tartışmalar için Dr. Hagit Peretz-Soroka&#39;ya teşekkür ederiz. <style type="text/css">
</style> Çekimler sürecine cömertçe destek verdikleri için Waterloo Üniversitesi&#39;nden Profesör Carolyn Ren ve Dr. Xiaoming (Cody) Chen&#39;e teşekkür ediyoruz.

Tüm insan numunesi toplama protokolleri, Winnipeg Manitoba Üniversitesi&#39;nde Ortak Fakülte Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı. 1. Mikroakışkan Cihaz Üretimi ( Şekil 1A ) <ol><li> Şeffaflık maskesi tasarlayın ve yazdırın. <ol><li> Aygıtı daha önce ayrıntılı olarak tasarlayın 25 . Bkz. Şekil 1A . NOT: Cihaz iki kat içerir. İlk katman (4 μm yüksekliğinde) hücrenin yerleştirme bariyer kanalını, degrade kanalın yanındaki hücreleri yakalamak için tanımlar. İkinci kat (60 μm yüksekliğindeki) gradyan oluşturan kanal, hücre yüklemesi için port ve kanal, kimyasal giriş rezervuarları ve atık çıkışı tanımlanmaktadır. Hizalama işaretleri iki katman için tasarlanmıştır. İkinci kat için sıralı serpantin giriş kanalının uzunluğu ve genişliği sırasıyla 60 mm ve 200 μm&#39;dir; Akışaşağısının uzunluğu ve genişliğiSerpantin giriş kanalı sırasıyla 6 mm ve 280 um&#39;dir. </li><li> Birinci ve ikinci katman özelliklerini, yüksek çözünürlüklü bir yazıcı kullanarak şeffaflık maskesine basın. NOT: Baskı çözünürlüğü, tasarımdaki minimum özelliklere bağlıdır. Mevcut tasarımda, minimum 10 μm boyutunda minimum 32.000 dpi seçilmiştir. </li></ol></li><li> Silisyum gofreti temizleyin. <ol><li> Plazma temizleyicisine 3 inç silikon gofret yerleştirin. 3 dakika vakum uygulayın. </li><li> Plazma gücünü açın ve seviyeyi YÜKSEK olarak ayarlayın. 30 dakika süreyle silikon gofreti muamele etmek için oksijen plazma kullanın. </li><li> Plazma temizleyicisini kapatın ve silikon gofreti çıkarın; Silikon gofret cihaz kalıbının imalatı için hazırdır. </li></ol></li><li> Bir temiz oda tesisinde fotolitografi ile ilk katmanı hazırlayın. NOT: Kesin imalat parametreleri imalat tesisine bağlı olarak değişebilir. <ol><li> 10 mL SU-8 2025&#39;i 10 mL SU-8 2000&#39;de tasarlanmış bir foto rezistansı hazırlamak için bir cam kırıcıda. Kabarcıklar kaybolana kadar karışımı duman kaputunda 10 dakika bırakın. </li><li> Temizlenmiş silikon gofreti uygun torna aynası ile eğiriciye dikkatlice yerleştirin ve silikon gofreti hareketsiz hale getirmek için vakum uygulayın. </li><li> Dikkatle silikon gofretin merkezine 3 mL fotorezist karışım dökün. 500 rpm&#39;de 5 sn hızında döndürün. Daha sonra, silikon gofret üzerinde son 4 μm kalınlıkta bir fotorezist kaplama elde etmek için 3000 rpm&#39;de 30 saniye boyunca döndürün. </li><li> Silindirli gofreti eğiriciden dikkatlice çıkarın ve 95 ° C&#39;de 4 dakika boyunca bir ocak plakasında silikon gofreti fırında pişirin. </li><li> Silikonlu gofreti bir maske ayarlayıcıya dikkatlice yerleştirin ve UV&#39;ye maruz kalma süresini 6 saniyeye ayarlayın. Yapışkan bant kullanarak saydam bir cam plaka üzerine birinci katın asetat maskesini dikkatlice takın. </li><li> Ekli maske ile şeffaf cam plakayı hafifçe hizalayıcıya yerleştirin ve maskeyi silikon gofretle hizalayın. Si&#39;yi açığa vurmaHücre yuvası yapısını şekillendirmek için UV&#39;ye licon wafer yerleştirin. </li><li> Cam plakayı dikkatlice çıkarın ve maruz kalmış silikon levhayı çıkarın. Silikon gofreti, 95 ° C&#39;de 4 dakika boyunca bir ocak gözüne fırında pişirin. </li><li> Silikonlu gofreti bir duman davlumbazına aktarın ve SU-8 geliştiricisini içeren bir cam kaba yerleştirin. 30 saniye boyunca hafifçe çalkalayın. </li><li> Silikonlu gofreti, tazyikli davlumbazın içindeki SU-8 geliştiricisini takiben izopropil alkol (IPA) kullanarak temizleyin. Duman kaputunun içindeki azot gazı ile silikon gofreti kurutun; Ilk kat hazır. </li></ol></li><li> İlk katmanda ikinci katmanı hazırlayın. <ol><li> İlk katmandaki hizalama işaretlerini örtmek için yapışkan bant kullanın. İlk tabakalı silikonlu gofreti eğiricinin vakum mandreline dikkatle yerleştirin ve silikon gofreti hareketsiz hale getirmek için vakum uygulayın. </li><li> Silikon gofret üzerine 3 mL SU-8 2025 fotorezisti dökün. Silikon gofreti 500 rpm&#39;de 5 saniye döndürün. Daha sonra 2000 dev / dak&#39;da 30S ile silikon gofret üzerinde son 60 μm kalınlıkta bir fotorezist kaplama elde edildi. </li><li> Silikon gofreti döndürücüden dikkatlice çıkarın ve bir ısı plakasına aktarın; 65 ° C&#39;de 2 dakika fırında pişirin. </li><li> İlk katmandaki hizalama işaretlerini ortaya çıkarmak için yapışkan bandı hafifçe çıkarın. Bir ısıtma plakasına silikon gofret koyun ve 6 dakika boyunca 95 ° C&#39;de fırında. </li><li> Silikonlu gofreti bir maske ayarlayıcıya dikkatlice yerleştirin ve UV pozlama süresini 18 saniyeye ayarlayın. </li><li> Yapışkan bant kullanarak şeffaf cam plaka üzerine ikinci tabakanın saydamlık maskesini dikkatlice takın. </li><li> Ekli maske ile birlikte cam plakayı dikkatlice hizalayıcıya yerleştirin ve hizalayıcı denetim mikroskopunu kullanarak çapraz hizalama işaretleri ile maskeyi ve ilk katmanı silikon gofret üzerinde hizalayın. </li><li> Hücre yükleme ve degradasyon kanallarını şekillendirmek için UV&#39;ye fotorezist kaplı silikon gofreti maruz bırakın. </li><li> Cam plakayı dikkatlice çıkarın ve silikonu çıkarın wafer. 65 ° C&#39;de 2 dk&#39;lık bir ısı plakası üzerine silikonlu gofret fırında pişirin ve daha sonra başka bir 95 ° C&#39;lik sıcak plaka üzerine silikonlu gofreti aktarın ve 6 dakika fırında pişirin. </li><li> Silisyum gofreti duman kabına aktarın ve SU-8 geliştiricisini içeren bir cam kaba koyun. Bunu hafifçe 6 dakika sallayın. </li><li> Silikonlu gofreti, taze SU-8 geliştiricisini kullanarak ve ardından davlumbazın içinde IPA ile temizleyin. </li><li> Duman kaputunun içindeki azot gazı kullanarak silikon gofreti kurutun. Bir ısıtma plakası üzerine silikon gofret yerleştirin ve sert kalıp 150 ° C&#39;de 30 dakika pişirin; Ikinci kat hazır. </li></ol></li><li> Ana kalıp yüzey modifikasyonu. NOT: Yumuşak litografide kalıptan polidimetilsiloksan (PDMS) serbest bırakılmasını kolaylaştırmak için SU-8 kalıba bir silanasyon yüzey değiştirme adımı uygulanır. <ol><li> Bir mikropipet ucu içinde 10 uL tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil (triklorosilan) solüsyonu alın. Mikro pipet ucunu 15 mL&#39;lik bir plastik tüp içine yerleştirin.Tüpün kapağını gevşetin. </li><li> Tüp ve SU-8 desenli silikon gofreti bir desikatör içine yerleştirin ve vakumu 1 saat boyunca uygulayın; Maske kalıp PDMS cihaz imalatı için hazırdır. </li></ol></li><li> PDMS cihazını hazırla. <ol><li> Plastik bir behere 40 gr PDMS tabanı ve 4 gr sertleştirici madde karıştırılarak PDMS solüsyonu hazırlayın. Hazırlanmış SU-8 ana kalıbı bir Petri kabına yerleştirin ve kalıba 44 gr PDMS çözeltisi dökün. </li><li> Petri kabını bir desikatöre yerleştirin ve 20 dakika süreyle PDMS solüsyonunu boşaltmak için vakum uygulayın. Daha sonra Petri kabını bir fırına yerleştirin ve 2 saat boyunca 80 ° C&#39;de PDMS&#39;yi tedavi edin. </li><li> Pişirdikten sonra, Petri kabını çıkarın ve temiz bir tezgah üzerine yerleştirin. Dikkatle PDMS döşeme SU-8 kalıp kesme ve soyma. </li><li> 3 mm çapında bir delici kullanarak hücre yükleme portunu delin. 6 mm çapında bir delici kullanarak kimyasal giriş rezervuarlarını ve atık çıkışını delin. </li><li> Üzerindeki tozu çıkarın.Yapışkan bant kullanarak PDMS levhanın yüzeyini. PDMS levhasını ve temiz bir cam slaytını plazma makinesine yerleştirin. Vakumu vakit 3 dk uygulayın. </li><li> Plazma gücünü açın ve seviyeyi YÜKSEK olarak ayarlayın. Hava valfını yavaşça ayarlayın ve PDMS levhasını ve cam slaydını 3 dakika boyunca plazma ile işleme sokun. </li><li> Plazma gücünü kapatın ve vakumu açın. PDMS levhasını ve cam slaydı cımbızla dikkatlice çıkarın. </li><li> PDMS levhasını (kanal yapıları aşağı bakacak şekilde) cam slaytın üzerine derhal yerleştirin; Cama yapıştırmak için PDMS levhasına hafifçe bastırın. Mikroakışkan kanalı hemen deiyonize su ile doldurun; Mikroakışkan aygıt imalatı ve montajı tamamlanır. </li></ol></li></ol> 2. Mikroakışkan Hücre Geçiş Testi Hazırlama <ol><li> Mikroakışkan aygıt hazırlığı. <ol><li> 950&#39;ye kadar stok fibronektin solüsyonundan (1 mg / mL) 50 μL seyrelterek 50 μg / mL fibronektin solüsyonu hazırlayın81; Biyogüvenlik kabininde Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu salin (DPBS). </li><li> 9 mL Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI-1640) ve% 4 sığır serumu albumin (BSA) ile 1 mL RPMI-1640 karıştırarak göç ortamı hazırlayın. </li><li> Deiyonize suyu cihazdan çıkarın. </li><li> Cihaza 100 μL fibronektin solüsyonu ilave edin. Tüm kanalların fibronektin çözeltisi ile dolduğundan emin olmak için 3 dakika bekleyin. Mikroakışkan cihazı kapalı bir Petri kabına oda sıcaklığında 1 saat süreyle yerleştirin. </li><li> Fibronektin solüsyonunu cihazdan çıkarın. Prizden 100 μL geçiş ortamı ekleyin. Tüm kanalların geçiş medyasıyla dolu olduğundan emin olmak için 3 dakika bekleyin. </li><li> Cihazı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin; Cihaz daha sonra kemotaksis denemesi için hazırdır. </li></ol></li><li> Kemotaksis deneyi için kemoatraktan çözeltisi preparatı. <ol><li> 100 nM fMLP çözeltisi hazırlayın1 mL migrasyon ortamı. 1.5 mL tüp içinde fMLP çözeltisi ile 5 μL stok FITC-Dekstran (10 kDa, 1 mM) karıştırın. NOT: Degrade ölçümü için FITC-Dextran kullanılır. Alternatif olarak degradasyon göstergesi olarak Rhodamine kullanın. FMLP kemoatraktan çözeltisi daha sonra kemotaks deneyi için hazırdır. </li></ol></li><li> Balgam numunesinin hazırlanması. NOT: KOAH hastalarından balgam numunesi gradiyenti ile indüklenen nötrofil kemotaksis, bu all-on-chip yönteminin klinik tanı uygulaması olarak test edilmiştir. <ol><li> KOAH hastalarından balgam numuneleri toplamak için bir insan etik protokolü edinin. NOT: Winnipeg&#39;deki Seven Oaks Genel Hastanesinde (Manitoba Üniversitesi tarafından onaylanan) numune toplamak için onaylar aldık. </li><li> Bilgilendirilmiş yazılı onay formlarını tüm konulardan elde edin. </li><li> KOAH hastalarının spontan balgam numunelerini toplayın. 1,5 mL tüp içine 500 mcL balgam örneği yerleştirin. </li><li> 500 uL% 0.1 di1.5 mL tüp içinde tiyotreitol ilave edin ve hafifçe karıştırın. Tüp 37 ° C&#39;de 15 dakika su banyosuna yerleştirilir. </li><li> Numuneyi, 753 xg&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı toplamayın. Süpernatantı 865 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve son süpernatanı toplayın. Toplanan süpernatanı, kullanmadan önce bir -80 ° C dondurucuda saklayın. </li><li> Kemotaksis denemesi için hazır olunca, balgam çözeltisini çözdürün; 900 mcL migrasyon ortamını 1.5 mL&#39;lik bir tüpe aktarın ve biyogüvenlik kabini içinde 100 μL balgam karışımı ile karıştırın; Balgam çözeltisi daha sonra kemotaksis deneyi için hazırdır. </li></ol></li><li> Kan örneği toplanması. <ol><li> Sağlıklı bağışçılardan kan örnekleri toplamak için bir insan etik protokolü edinin. Bilgilendirilmiş yazılı onay formlarını tüm kan bağışçılarından edinin. NOT: Burada örnekler Winnipeg&#39;deki Victoria Genel Hastanesi&#39;nde (Manit Üniversitesi, Ortak Fakülte Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır)OBA). </li><li> Kan örneğini damar tıkanıklığı ile alın ve numuneyi bir EDTA kaplı tüp içine koyun. Deneyden önce tüpü biyogüvenlik kabininde tutun. </li></ol></li></ol> 3. Tümüyle çipte Kemotaksis Testi Çalışması <ol><li> Çip üstü hücre izolasyonu ( Şekil 1B ). <ol><li> Biyogüvenlik kabini içinde 1.5 mL&#39;lik bir tüpe 10 mcL tam kanı yerleştirin. NOT: Kan örneğinin toplanması ile ilgili ayrıntılar bölüm 2.4&#39;te verilmiştir. </li><li> 1.5 mL tüp içine nötrofil izolasyon kitinden (materyal tablosuna bakın) 2 μL antikor kokteyli (Ab) ve 2 μL manyetik parçacıklar (MP) ekleyin ve hafifçe karıştırın; Bu, nötrofiller haricinde kandaki hücreleri işaretleyecektir. </li><li> Kan-Ab-MP karışımını oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. NOT: Bu, kandaki antikor etiketli hücreleri manyetik olarak etiketleyecektir. </li><li> Hücrenin iki tarafına iki küçük manyetik disk takın.Cihazın ortası. Ortamı, cihazın tüm portlarından aspire edin. </li><li> Hücre yükleme limanından mikro-akışkan cihaza yavaşça 2 mcL&#39;lik kan-Ab-MP karışımı pipetleyin. NOT: Manyetik olarak işaretlenmiş hücreler, hücre yükleme portunun yan duvarlarına sıkışırken nötrofiller cihaza akar ve hücre yerleştirme yapısında sıkışırlar. </li><li> Yeterli nötrofiller hücrenin yerleştirme alanına sıkışana kadar birkaç dakika bekleyin. </li></ol></li><li> Kemotaksis tahlili ( Şekil 1C ). <ol><li> Mikroakışkan cihazı 37 ° C&#39;de sıcaklık kontrollü mikroskop sahnesine yerleştirin. </li><li> İki pipetleyici kullanarak belirlenmiş giriş rezervuarlarına 100 μL kemoatraktan solüsyonu (fMLP veya balgam solüsyonu) ve 100 μL migrasyon ortamı ekleyin; Bu, gradyan kanalında, sürekli bir laminer akışa dayalı kimyasal karışımın, bir basınç uygulamanın yardımıyla bir kemoatraktan gradyanı oluşturacaktırE dengeleme yapısı. NOT: KOAH&#39;lı hastalardan alınan balgam toplama detayları 2.3. Bölümde verilmiştir. <ol><li> Orta kontrol deneyi için, sadece giriş haznelerinin her ikisine de göç ortamı ekleyin. </li></ol></li><li> Gradient kanalında FITC-Dextran&#39;ın floresan görüntüsünü elde edin. </li><li> &quot;File | Open&quot; komutunu kullanarak görüntüyü ImageJ yazılımına aktarın. </li><li> &quot;Analyze | Plot Profile&quot; komutunu kullanarak degrade kanalı boyunca floresans yoğunluğunu ölçün. </li><li> Daha fazla çizim yapmak için ölçüm verilerini bir elektronik tabloya verin. </li><li> Cihazı, sıcaklık kontrollü mikroskop aşamasında veya 15 dakika geleneksel hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. </li><li> Degrade kanalı, hücrelerin veri analizi için son konumlarını kaydetmek için 10X&#39;lik bir objektif kullanarak görüntüler. </li><li> Gerekirse, zaman atlamalı mikroskopi ile cıhazdaki hücre göçünü kaydedin. </li></ol></li></ol> 4. Hücre Göçü DAta Analizi ( Şekil 1C ) <ol><li> Kemotaksis tahlilini aşağıda tarif edildiği gibi yerleştirme yapısından hücre göç mesafesini hesaplayarak analiz edin. Bkz. Şekil 1C . </li><li> Görüntüyü NIH ImageJ yazılımına alın (ver 1.45). </li><li> Degrade kanala hareket eden her hücrenin merkezini seçin. </li><li> Seçilen hücrelerin son konumları için koordinatlarını ölçün. Kenetleme yapısının kenarındaki bir noktanın koordinatını başlangıç ​​referans konumu olarak ölçün. </li><li> Ölçülen koordinat verilerini elektronik tablo yazılımına aktarın ( örn. Excel). Hücrenin son konumu ile degrade yönü boyunca başlangıçtaki referans konumu arasındaki fark olarak hücrelerin göç mesafelerini hesaplayın. </li><li> Bir mikrometreye kadar olan mesafeyi kalibre edin. Tüm hücrelerin migrasyon mesafesinin ortalama ve sapmasını, kemotaksisin bir ölçüsü olarak hesaplayın. </li><li> Mig karşılaştırOrtam kontrol deneyi için bir kemoatraktan degrade varlığında, Student t testini kullanarak rasyon mesafesi. </li><li> Hücrenin göç zamanlama görüntüleri kaydedilirse, hücre göçü ve kemotaksis, hücre izleme analizi 15 ile daha da analiz edilebilir. NOT: Tüm yongada kemotaksis tahlilini oluşturmak ve gerçekleştirmek için gerekli materyaller, malzeme tabloda ayrıntılı olarak verilmektedir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+trafficking+in+tissue+development,+growth,+and+disease.">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132 (4), 612-630 (2008).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Kruger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+between+host+defence,+immune+modulation,+and+tissue+injury.">Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury.</a> PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).</li><li>M&#243;csai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+novel+functions+of+neutrophils+in+immunity,+inflammation,+and+beyond.">Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond.</a> J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).</li><li>Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+navigation+and+the+combinatorial+control+of+leukocyte+chemotaxis.">Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis.</a> J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).</li><li>Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+tumour+angiogenesis:+subversion+of+immune+responses+to+promote+tumour+growth.">Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth.</a> Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Wu, J., Wu, X., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+microfluidics-based+chemotaxis+studies.">Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies.</a> Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).</li><li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research.">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+of+microfluidic+gradient+devices.">Biological applications of microfluidic gradient devices.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).</li><li>Irimia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+measuring+neutrophil+migratory+responses+to+fast+switches+of+chemical+gradients.">Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients.</a> Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+opposing+chemoattractant+gradients+using+microfluidic+chemotaxis+devices.">Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices.</a> Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).</li><li>Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+decisions+during+neutrophil+chemotaxis+inside+bifurcating+channels.">Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+neutrophil+migration+patterns+during+sepsis+after+major+burns.">Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns.</a> PloS One. 9 (12), e114509 (2014).</li><li>Butler, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices.">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS One. 5 (7), e11921 (2010).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+evaluating+neutrophil+chemotaxis+induced+by+sputum+from+COPD+patients.">A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients.</a> PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).</li><li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+kit-on-a-lid:+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays.">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).</li><li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood.">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+measuring+neutrophil+chemotaxis+from+unprocessed+human+whole+blood.">Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+precise+measurements+of+mouse,+rat,+and+human+neutrophil+chemotaxis+in+whole-blood+droplets.">Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets.</a> J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).</li><li>Sackmann, E. K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+asthma+from+a+drop+of+blood+using+neutrophil+chemotaxis.">Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis.</a> P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-on-chip+method+for+testing+neutrophil+chemotaxis+induced+by+fMLP+and+COPD+patient's+sputum.">An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum.</a> Technology. 04 (02), 104-109 (2016).</li></ol>

Açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu yazıda, doğrudan tek bir mikroakışkan yonga üzerinde kemotaksis testi ile tam kandan nötrofilleri doğrudan izole etmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem, kolay çalışması, yüksek saflıktaki nötrofillerin negatif seçimi, hızlı numuneden sonuç toplayan kemotaks testi, indirgenmiş reaktifler ve numune tüketimi ve doğru hücre göç verileri analizi için yararlı özellikler sunar. Kaba bir tahmini olarak, giren tam kan örneğindeki nötrofillerin en az% 25&#39;i aygıtt...

Kemotaksis, çözünür kimyasal konsantrasyon gradiyentine yönlendirilmiş bir hücre migrasyon süreci, bağışıklık yanıtı 1 , 2 , 3 , doku gelişimi 4 ve kanser metastazı 5 dahil olmak üzere birçok biyolojik proseste kritik rol oynar. Nötrofiller, en bol beyaz kan hücresi altkümesidir ve vücudun doğal konakçı savunma işlevlerinin sağlanmasında, ayrıca adaptif bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesinde 6 , 7 önemli rol oynamaktadır. Nötrofiller, bu hareketli bağışıklık hücrelerinin hem patojenden türetilen kemoatraktanlara ( örn ., FMLP) ve hem de konaktan türetilen kemoatraktanlara ( örn ., Interlökin-8) karşı kemotaksis 8&#39;e cevap verebilmelerini sağlayan oldukça düzenlenmiş kemotaktik makinelerle donatılmıştır. Nötrofil göçü ve kemotaksi çeşitli fizyolojik sorunlara aracılık ederVe inflamasyon ve kanserler 1 , 9 gibi hastalıklar. Böylece, nötrofil kemotaksisinin doğru olarak değerlendirilmesi nötrofil biyolojisi ve ilişkili hastalıkların çalışılması için önemli bir işlevsel okuma sağlar. Yaygın olarak kullanılan kemotaksis tahlilleriyle ( örn., Transwell assay 10 ) karşılaştırıldığında, mikro akışkan cihazlar, hassas kontrol edilen kimyasal gradyan oluşumu ve minyatürleştirme sayesinde, hücre göçü ve kemotaksisin kantitatif değerlendirmesi için büyük bir vaat göstermektedir. 11 , 12 , 13 . Son yirmi yılda, farklı biyolojik hücre tiplerinin, özellikle de nötrofillerin kemotaksisini incelemek için çeşitli mikroakışkan cihazlar geliştirildi. Spatiyotik olarak kompleks che&#39;de nötrofil göçü karakterize etmek için önemli çaba sarf edildi<html> Mikroakışkan cihazlarda 14 , 15 yapılandırılmış olan mical gradyanlar. Nötrofiller tarafından mikroakışkan cihazlar 16 kullanılarak yönsel karar verme eğitimi için ilginç stratejiler geliştirildi. Biyolojik yönelimli araştırmanın yanı sıra, mikroakışkan cihazların uygulamaları hastalığın değerlendirilmesi için klinik örneklerin test edilmesi için genişletildi 17 , 18 , 19 . Bununla birlikte, birçok mikroakışkan cihazın kullanımı uzmanlaşmış araştırma laboratuvarlarıyla sınırlıdır ve büyük miktarda kan numunesinden uzun süre nötrofil izolasyonu gerektirir. Bu nedenle, hızlı bir şekilde nötrofil kemotaksis analizi için entegre mikroakışkan cihazlar geliştiren büyümekte olan bir eğilim, tam damla bir damla 20 , 21 , 22 ,Ef &quot;&gt; 23 , 24 . Bu yönde, manyetik negatif nötrofil saflaştırma ve takip eden kemotaksis analizini tek bir mikroakışkan cihaz üzerinde bütünleştiren all-on-chip metodu geliştirildi. Bu all-on-chip yöntemi aşağıdaki yeni özelliklere sahiptir: 1) nötrofilleri yapışkan tabanlı hücre yakalama veya hücre boyutuna dayanan filtreleme 20 , 22 ile kandan izole eden önceki çipli stratejilerin aksine, bu yeni yöntem, Saflık, nötrofillerin küçük hacimlerde tam kandaki manyetik ayrımının yanı sıra kemoatraktan uyarımı üzerine kemotaksis ölçümü; 2) hücre yerleştirme yapısı nötrofillerin başlangıç ​​konumlarını kimyasal gradyan kanalına yakınlaştırmaya yardımcı olur ve tek hücre izlemesi olmaksızın basit kemotaks analizi yapılmasına izin verir; 3) nötrofil izolasyonu ve kemoterapiEksen tayini, deneysel adımlar arasında herhangi bir kesinti olmadığında, 25 dakika içinde hızlı örnek-sonuç kemotaksis analizine olanak tanır. Bu yazı, all-on-chip chemotaxis testinin yapımı, çalışması ve veri analizi yöntemi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu makale, bilinen bir rekombinant kemoatraktan ve kompleks kemotaktik numuneleri hastalardan test ederek nötrofil kemotaksisi gerçekleştirmek için gelişmiş yöntemin etkin kullanımını ve bunu takiben sorun giderme stratejileri, sınırlamaları ve gelecekteki yönergeler üzerine bir tartışma ortaya koymaktadır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Device fabrication&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>ABM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Solitec</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>VWR</td><td>11301-022</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum dessicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Digital scale</td><td>Ohaus</td><td>CS200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 thinner</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 photoresist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Microchem</td><td>SU-8 developer</td><td></td></tr><tr><td>Si wafer</td><td>Silicon, Inc</td><td>LG2065</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane&lt;br/&gt; (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Cutting pad</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>Punchers</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Source&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;On-chip cell isolation and chemotaxis assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025502</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&lt;br/&gt; (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>VWR</td><td>CACB356008</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic disks</td><td>Indigo Instruments</td><td>44202-1</td><td>5 mm in diameter,&lt;br/&gt; 1 mm thick</td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>&lt;br/&gt; Sigma-Aldrich</td><td>R4127-5G</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa stain solution</td><td>Rowley Biochemical Inc.</td><td>G-472-1-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Direct Human&lt;br/&gt; Neutrophil Isolation&lt;br/&gt; Kit</td><td>STEMCELL&lt;br/&gt; Technologies Inc</td><td>19666</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Microscope environmental chamber.</td><td>InVivo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td></td></tr></tbody></table>

an all-on-chip method for rapid neutrophil chemotaxis analysis directly from a drop of blood

Nötrofil göçü ve kemotaksis, vücudumuzun bağışıklık sistemi için kritik öneme sahiptir. Mikroakışkan cihazlar, gerçek zamanlı görselleştirme, kimyasal konsantrasyon gradyanı üretiminin hassas kontrolü ve reaktif ve numune tüketiminin azaltılması gibi avantajlarından ötürü nötrofil göçünü ve kemotaksiyi araştırmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Son zamanlarda, doğrudan doğruya kandan, mikroakışkan araştırmacılar tarafından entegre ve kolaylıkla çalıştırılan mikroakışkan kemotaks analizi sistemlerine yönelik büyüyen bir çaba gösterildi. Bu yönde, nötrofillerin manyetik negatif arıtımını ve küçük kan hacmi numunelerindeki kemotaksis tahlilini bütünleştirmek için ilk all-on-chip yöntemi geliştirildi. Bu yeni yöntem, 25 dakika içinde hızlı numune-sonuç nötrofil kemotaksisi testine izin verir. Bu yazıda, sorun giderme stratejileri üzerine bir tartışma ile bu all-on-chip chemotaxis tahlilinin detaylı inşası, işletimi ve veri analizi yöntemi sunulmaktadır.Tations ve gelecekteki yönergeler. Tanımlanmış bir kemoatraktan, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) hastasından alınan balgamın bu all-on-chip yöntemini kullanarak test eden nötrofil kemotaksis testinin temsilci sonuçları gösterilmiştir. Bu yöntem birçok hücre göçüyle ilgili araştırmalar ve klinik uygulamalar için geçerlidir.

Nötrofiller mikroflüidik aygıta doğrudan tam damla bir damla seçilir. İzole edilmiş nötrofillerin saflığı çip üzerinde Giemsa boyaması ile doğrulandı ve sonuçlar nötrofillerin tipik halka şeklindeki ve lob şeklindeki çekirdeklerini gösterdi ( Şekil 2A ) 25 . Bu, küçük bir hacimdeki tüm kandan yüksek saflıkta etkili bir çipte nötrofil izolasyonu olduğunu gösterir. Ayrıca, yerleştirme yapısı, kimyasa...

Watch this Scientific Journal Video about An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood at JoVE.com

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

an-all-on-chip-method-for-rapid-neutrophil-chemotaxis-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K Görüntüleme.  Chinese Academy of Sciences.  Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır. 

Video: An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Biyomühendislik

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

İnsan Nötrofil Swarming in vitro Kemotaktik ve Moleküler Analizi için Biyopartikül Mikrodizileri

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

İnsan Nötrofillerinde β2 İntegrin Aktivasyon İnhibitörlerinin Taranması

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

Yazar Spotlight: β2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini tanımlamak için bir yöntemin geliştirilmesi 

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Nicel

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

İnsan Nötrofil Swarming in vitro Kemotaktik ve Moleküler Analizi için Biyopartikül Mikrodizileri

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli