Bu iş için kendi teknik destek için Reiko Kise ve Tomotsune Ameku teşekkür ederim. Ayrıca Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stok Merkezi, KYOTO Stok Merkezi (DGRC) ve hisse senedi ve reaktifler için Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası minnettarız. Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant Numarası 16K20945, Naito Vakfı ve Inoue Bilim Araştırma Ödülü dan ysn bağışları ile desteklenmiştir; ve mext KAKENHI Hibe Numarası 16H04792 dan RN bir hibe ile.

Not: protokolleri genel şeması Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 1. Larvaların halkası Gland Diseksiyon (RG) NOT: D&#39;de. cyclorrhaphous Diptera ait melanogaster, PG, bileşik endokrin organ halka bezi (RG, Şekil 2D) adı içindedir. Bu PG cerrahi (daha sonra ele alınmıştır) diğer hücre tiplerinden ayrılır, imkansız olduğu için, pratik bir hedef diseksiyon ile de dokunulmamış, hasarsız RG izole etmektir. <ol><li> Uygun gelişim aşamalarında larvalarının hazırlanması NOT: D. melanogaster larvalarının gelişim aşamalarını senkronize etmek için, dar bir zaman aralığında yumurta toplamak için ve uygun zamanlarda larvaları toplamak için gereklidir. <ol><li> 25 ° C&#39;de bir üzüm suyu agar plakası üzerinde 2 saat boyunca yumurta toplayın. </li><li> Toplayın 1 yumurtadan yeni çıkmış <sup&gt; st evre forseps ile bir mikroskop altında larva ve püresi standart maya / mısır unu sinek gıda içeren küçük şişeye aktarın. Not: larva yaş ile temsil edilir, &quot;saat yumurtlama (Hael) sonra&quot; &quot;saat kapağın sonra (Hah)&quot; ya da &quot;L3 ecdysis (hAL3E) saat sonra&quot;. </li><li> Uygun bir zaman noktasında, istenmeyen yaralanmaları önlemek için tek bir plastik döngü ile aşamalı larvaları toplamak. 3. instar larvaları gelişimsel ilerlemesinde bir fark en aza indirmek için, 70 Hael (48 Hah) fazla 2. evre larvaları toplamak ve onları 2 saat aralıklarla dökülmüyor sağlar. Daha sonra, L3 ecdysis sonra 2 saat içinde 3. instar larvaları toplamak; Bu prosedür 0-2 hAL3E larvaları verir. </li><li> fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile doldurulmuş bir tabak için aşamalı larva aktarın. </li><li> Vücuttan kalan yiyecek çıkarmak için PBS ile larva durulayın. </li></ol></li><li> Bir altında larva Kaba diseksiyondiseksiyon mikroskobu <ol><li> forseps ile larva ağzı kancasını tutun. Mikro makas kullanılarak gövde uzunluğunun ön üçte biri larva vücut Sever. </li><li> Forseps bir çift ile ön larva vücudunun kesik ucunu tutun. Forseps diğer bir çift kullanarak, yavaşça gövdenin içine doğru baş ucu itme; Bu prosedür tersyüz larva vücut döner. NOT: Bu adım 1. evre larvalar diseksiyon için atlanabilir. </li><li> adımları tekrarlayın 1.2.1-1.2.2 ek larvaları ile 5-10 dakika boyunca. NOT: larva sayısı diseksiyon için zaman kazanmak için eşit veya 20&#39;den küçük olmalıdır. </li></ol></li><li> Larvalarının Fillet diseksiyon NOT: Bu yöntem, dokuların konuma tutma bozulmadan kalmasını sağlar. <ol><li> Sadece 1 saat boyunca suda larvaları bırakın. Larvalar boğulma nedeniyle hareketsiz kılınmıştır. </li><li> bir silikon kaplı PBS bir damla bir larva dorsal tarafına koyunyemek, dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde. NOT: sırt tarafında boylamasına uzanan 2 trakeal tüpleri yer alır. </li><li> bir mikroskop altında, forseps kullanılarak larva ön ucu içine bir böcek pimi takın. arka tarafına larva vücut Stretch ve larva posterior ucu içine ikinci bir pimi koydu. Not: böcek iğneli ek olarak, tungsten telden yapılmış bir iğne 21 yararlı olabilir. Bir iğne, bir kesme iğne olarak kullanım için ısıtılarak bir pipet ucu gömülü olabilir. </li><li> bir mikroskop altında, mikro makas ile kuyruk yakın küçük bir kesi yapmak. kesi itibaren kafasına doğru dorsal orta hat boyunca uzunlamasına sırt manikür kesti. manikür altında dokuları zarar vermemeye özen gösterin. </li><li> her iki tarafta bodywall manikür gerin ve disseke bodywall her köşesindeki 4 işaretçilerine yerleştirin. </li><li> , Forseps ile ön yağ gövdesinin bir kısmını çıkarmak beyin-RG c açığayüzeyinde açığa omplex. Gerekirse, tükürük bezlerinin bir çift çıkarın. </li></ol></li><li> Sabitleme ve immünohistokimya ile doku boyama <ol><li> 500 uL (PBS içinde% 4 paraformaldehid) düzeltme çözeltisi ile doldurulmuş bir 1,5 mL&#39;lik bir mikro tüpe larva organları (aşama 1.2.2) ön üçte biri koyun. sabitleyici uygun olmayan bir seyreltme neden olabilir, aksi takdirde, PBS sabit örnekleri bağlanmış bir seferde en az 20 numune, sabitleyin. fileto diseksiyon için, PBS bir damla kaldırmak ve daha sonra düzeltme çözümün bir damla ekleyin. Not: düzeltme çözümü için,% 3.7 formaldehid veya% 4 paraformaldehit ya kullanılabilmektedir. </li><li> 4 ° C &#39;de, alternatif olarak 2 saat süre ile oda sıcaklığında (RT) ya da 30 dakika için düzeltme çözeltisinde kesildi dokuları inkübe edin. </li><li> 500 uL PBS ile düzeltme çözeltisi yerine ve hızlı bir şekilde numuneler 3 kez yıkayın. Ar bir rocker 15 dakika boyunca 500 uL% 0.3 PBT (PBS +% 0.3 oktilfenol etoksilat) ile örnekleri yıkayınT. köşe diseksiyon, böceğe iğneleri kaldırmak ve 1.5 mL&#39;lik bir mikro tüpe örnekleri aktarın. Not: dokulara antikorların geçirgenliğini artırmak için numuneler oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 1-2 saat için 500 uL% 2.0 PBT tedavi edilir. </li><li> çözeltisi (PBT içinde% 2 sığır serum albümini) ile bloke 500 uL PBT değiştirin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 1.5 saat boyunca inkübe edin. </li><li> 50 uL primer antikor çözeltisi bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş örneğin antikorlar ile bloke çözeltisi değiştirin. </li><li> gece boyunca 4 ° C&#39;de bir sallama düzeneği üzerinde inkübe edin. </li><li> 500 uL% 0.3 PBT ile primer antikor çözeltisi yerine ve hızlı bir şekilde numuneler 5 kez çalkalayın. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 15 dakika her biri için 500 uL% 0.3 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın. </li><li> 50 uL ikinci antikor çözeltisi (blokaj çözeltisi içinde seyreltilmiş boya ile konjüge edilmiş antikorlar) ile% 0.3 PBT değiştirin. nükleer boyama, 0.5 uL 4&#39; , 6-diamidino- için2-fenilindol (DAPI, 0.1 mg / mL stok solüsyonu) 50 uL çözelti ilave edilir. Oda sıcaklığında ya da seçenek olarak bir gece boyunca 4 ° C &#39;de 2 saat süre ile bir rocker inkübe edin. NOT: Karanlıkta örnekleri tutun. </li><li> 500 uL% 0.3 PBT ile antikor çözeltisi yerine ve 5 kez çalkalayın. Oda sıcaklığında 15 dakika her biri için 500 uL% 0.3 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın. </li></ol></li><li> Beyin-RG kompleksinin İnce kesme PG&#39;yi içeren ve içine monte <ol><li> % 0.3 PBT ile doldurulmuş bir tabak için immüno örnekleri aktarmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın. NOT: diseksiyon ve montaj esnasında rahatsız edici kabarcıklarını önlemek için,% 0.3 PBT PBS ile değiştirilebilir. </li><li> bir mikroskop altında, forseps bir çift üst deri veya ağız kanca tutun. Bir &quot;bıçak&quot; olarak 1 ml şırıngaya bağlanmış bir 27 G iğne kullanılarak, vücut kütikül beyin-RG-göz diski kompleksi kaldırmak için yemek borusu ve göz diskleri ön ucu kesilmiş. </li><li> Sepaforseps ile beyin-RG göz disk kompleksinden yemek borusu ve bağırsağı oranı. Yemek borusu ventral sinir kablosu (VNC), yukarıdaki beyin üzerinden geçtiğinden, arka tarafına gut çekin. NOT: örneklerinden ekstra hayali diskleri kaldırmak bir iğne bıçakla beyinde, göz diskler ve bacak diskler arasındaki bağlantıları kesmek için. </li><li> Diğer örnekler için adımlar 1.5.1-1.5.4 tekrarlayın. NOT: örnekler yapışmasını doku kalıntıları önlemek% 0.3 PBT veya PBS ile doldurulmuş farklı temiz bir tabak için tamamlanan her örnek aktarmak için. </li><li> mikropipet ile temiz bir cam slayt ortasına örnekleri aktarın. NOT: 2 nci veya 3 instar larvaları için, bir mikro pipet ucu bir jiletle kesilmiş olmalıdır. </li><li> bir mikroskop altında, forseps kullanılarak dorsal tarafına kadar olan bireysel numunelerin hizalayın. Not: RG Şekil 2A (beyin sırt tarafında yer almaktadır). Bu hizalama görüntüleme sırasında tek tek numunelerin özelliklerini kolaylaştırır. </li><li> Bir cam slayt yatırın ve mümkün olduğu kadar fazla PBT silin. slayt bir tarafında montaj reaktif bir damla koyun. damla diğer taraftan bir kapak slip kenarını ve forseps ile yavaş yavaş örnekleri kapak kayma koydu. NOT: Bu prosedür kapak kayma dışında hareket etmesini örnekleri engeller. </li><li> 4 ° C&#39;de örnekleri saklayın. Karanlıkta örnekleri tutun. </li></ol></li></ol> 2. Yumurtalık diseksiyonunda Yetişkin Dişiler <ol><li> Yetişkin kadın hazırlanması <ol><li> 3-4 gün yumurtalık kadar şişmanlatıyor Yem dişi standart maya / mısır unu sinek gıda ile uçar. 25 ° C &#39;de muhafaza edin. </li></ol></li><li> Yetişkin kadın yumurtalığı diseksiyonu <ol><li> Kadın CO2 gazı ile uçan anestezisi ve kafalarını kesti. </li><li> 3 cm&#39;lik çanak sinek organları aktarınPBS ile doldurulur. </li><li> bir mikroskop altında, forseps kullanılarak sırt tarafında göğüs kafesi tutun. Diğer forseps ile karın kademeli A5 ya da A6 tutun ve arka tarafına doğru karın kütikül soyarak. forseps ucu yapışkan kütikül silin. </li><li> Bir yumurta kanalının sıkıştırın ve vücuttan yumurtalık çıkar. </li><li> Tarak ve forseps ile yumurtalık ipuçlarını yayıldı. NOT: Bu işlem immünboyanmadan verimliliğini artırır. </li></ol></li><li> Yetişkin kadın beyninde, VNC ve üreme organlarının Diseksiyon. NOT: Bu yöntem yumurtalık inervasyonu bozulmadan muhafaza edilmesini sağlar. <ol><li> Kadın CO2 gazı ile uçan anestezisi ve PBS ile doldurulmuş bir silikon kaplı tabak aktarın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, burnumun tutun ve forseps ile beyin maruz kafa manikür soyarak. beyne bağlı trakea çıkarın. NOT: brain, beyaz ve yuvarlak bir yapıdır. Beyin toraks VNC bağlanır. </li><li> sırt tarafında toraks tutun ve forseps bir çift bacak ve kanatları kesti. Forseps diğer bir çift kullanılarak, bacakların bazlardan göğüs ventral kütikül soyarak. VNC ortaya çıktığında, VNC forseps kullanılarak bağlanmış kalan sırt kütikül ve kasların çıkarın. beyin ve VNC arasındaki bağlantıyı zarar vermemeye özen gösterin. </li><li> Karın manikür soymaya yumurtalık ve nöronlar, kırpma, gut, yumurta kanalı, rahim ve suç ortağı bezi de dahil olmak üzere interaktif organları açığa forseps kullanın. </li><li> trakea ve forseps kullanarak yağ vücutta dahil kalıntı dokuları çıkarın. </li></ol></li><li> Sabitleme ve immünohistokimya ile doku boyama <ol><li> 250 uL ile dolu bir 1,5 mL&#39;lik bir mikro için düzeltme çözeltisi yumurtalıkların yaklaşık 8-10 çift transfer (% 4 paraformaPBS içinde kulanılan) ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca numune inkübe edin. </li><li> 500 uL PBS ile düzeltme çözeltisi yerine ve hızlı bir şekilde numuneler 3 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında her biri 5 dakika için numuneler 500 uL% 0.1 PBT ile 2 kez yıkanır. </li><li> çözümü engelleme 50 uL PBT değiştirin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 1 saat inkübe edin. </li><li> 50 uL primer antikor çözeltisi ile bloke çözeltisi değiştirin. </li><li> gece boyunca 4 ° C&#39;de bir sallama düzeneği üzerinde inkübe edin. </li><li> 500 uL% 0.1 PBT ile primer antikor çözeltisi değiştirin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 15 dakika her biri için 500 uL% 0.1 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın. </li><li> 50 uL ikinci antikor çözeltisi ile% 0.1 PBT değiştirin. nükleer boyama için, 50 uL çözelti 0.5 uL DAPI ekleyin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 2 saat inkübe edin. </li><li> 500 uL% 0.1 PBT ile ikincil antikor çözeltisinin değiştirin. 500 uL% 0.1 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın<html> Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 15 dakika her biri için. Not: yıkama prosedürü bir gece boyunca 4 ° C&#39;de yapılabilir. Karanlıkta örnekleri tutun. </li></ol></li><li> Cam slaytlar üzerine örnekleri Montaj <ol><li> % 0.1 PBT bir mikropipet kullanılarak bir cam slayt örnekleri aktarın. NOT: diseksiyon ve montaj esnasında rahatsız edici kabarcıklarını önlemek için,% 0.1 PBT PBS ile değiştirilebilir. </li><li> yumurtalık, bir mikroskop altında forseps ile birbirinden ovarioles dizilerini ayırır. germaria içeren ovarioles uçlarını zarar vermeyin. beyin VNC-üreme organı kompleksi için, artık kütikül kaldırmak ve bir cam slayt pozisyonu sağlayabilir. </li><li> mümkün olduğu kadar fazla PBT silin ve numunelerin merkezi montaj reaktif bir damla koymak. yavaşça forseps kullanarak bir kapak kayma yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de örnekleri saklayın. Karanlıkta örnekleri tutun. </li></ol></li></ol>Bir odaklı lazer tarama mikroskopu ile &quot;&gt; 3. Görüntüleme <ol><li> mikroskop altında örnekleri gözlemleyin ve görüş alanında steroidojenik organları getir. görünüm düzeltildikten sonra, görüntü elde etme moduna görüntüleme sistemini açmak. NOT: 10-20X objektif lensler beyin-RG kompleksi veya tüm yumurtalığı görüntülerini elde etmek için kullanılır. Seçenek olarak ise, 40-63X objektifler (su ya da yağ daldırma) GSC &#39;lerin veya PG ve yumurtalık nöronal innervasyon proteinlerin hücre içi lokalizasyonu görselleştirmek için kullanılır. </li><li> ekli yazılıma görüntü elde etme parametrelerini ayarlayın. Floresan kombinasyonu (örneğin GFP ve RFP) seçin. hızlı tarama prosedürü ile, lazer gücü, detektörlerin duyarlılığı (kazanç / ofset) ve iğne deliği boyutunu ayarlamak. NOT: Yüksek kalitede görüntü elde etmek için, tarama lazer gücü ve dedektör (Kazanç) duyarlılığı her numune için optimize edilmelidir. şeklinin ana hattını içindokuların, iletilen ışık görüntü bir floresan görüntü ek olarak alınabilir. </li><li> Görüntülerin Z yığınlarını atın. Sürekli hızlı tarama sırasında mikroskop odağı sürücüsüyle odak düzlemi taşımak ve başlangıç ​​konumunu ve son konumu ayarlayabilirsiniz. dilim sayısı ve dilimler arasındaki aralık mesafe buna göre ayarlanır. </li><li> Tarama hızı, tarama yöntemi ve çift yönlü tarama modunu seçin. </li><li> görüntü elde etmek için &quot;gerçek taramalar başlat&quot;. </li><li> ekli yazılımın formatı ile görüntü kaydetme. NOT: Orijinal resim dosyaları görüntü elde etme parametreleri ve ölçeklerin bilgiler içerir. Dışa görüntüler bilgisayara 22 bir görüntü işleme yazılımı kullanılarak işlenebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Miller, W. L., Auchus, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Biology,+Biochemistry,+and+Physiology+of+Human+Steroidogenesis+and+Its+Disorders.">The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders.</a> Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).</li><li>Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+years+ago:+The+quest+for+steroid+hormone+receptors.">Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).</li><li>Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+biochemical+nature+of+the+ecdysteroidogenic+pathway.">Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).</li><li>Niwa, R., Niwa, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymes+for+ecdysteroid+biosynthesis:+their+biological+functions+in+insects+and+beyond.">Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).</li><li>Kozlova, T., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+regulation+of+postembryonic+development+and+reproduction+in+drosophila.">Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila.</a> Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).</li><li>Ishimoto, H., Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+molting-roles+of+the+steroid+molting+hormone+ecdysone+in+regulation+of+memory+and+sleep+in+adult+Drosophila.">Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila.</a> Fly. 5 (3), 215-220 (2011).</li><li>Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+signaling+regulates+the+formation+of+long-term+courtship+memory+in+adult+Drosophila+melanogaster.">Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).</li><li>Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+control+of+longevity+in+Drosophila+melanogaster.">Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster.</a> Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).</li><li>Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Ecdysone+response+genes+govern+egg+chamber+development+during+mid-oogenesis+in+Drosophila.">a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila.</a> Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).</li><li>Carney, G. E., Bender, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+drosophila+ecdysone+receptor+(EcR)+gene+is+required+maternally+for+normal+oogenesis.">The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis.</a> Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).</li><li>Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+the+role+of+ecdysteroids+in+adult+insects:+Germline+development+and+circadian+clock+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Zoological Lett. 1, 32 (2015).</li><li>Ameku, T., Niwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating-Induced+Increase+in+Germline+Stem+Cells+via+the+Neuroendocrine+System+in+Female+Drosophila.">Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila.</a> PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).</li><li>Danielsen, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+Genome-Wide+Screen+Identifies+Regulators+of+Steroid+Hormone+Production+and+Developmental+Timing.">A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing.</a> Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).</li><li>Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Prothoracic+Gland+as+a+Model+for+Steroid+Hormone+Biosynthesis+and+Regulation.">The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation.</a> Cell Rep. , (2016).</li><li>Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+control+of+developmental+transitions:+lessons+from+Drosophila+research.">Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research.</a> Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).</li><li>Niwa, Y. S., Niwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+insect+steroid+hormone+biosynthesis+and+its+role+in+controlling+timing+of+molting+and+metamorphosis.">Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis.</a> Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).</li><li>Monastirioti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+octopamine+cell+population+residing+in+the+CNS+abdominal+ganglion+controls+ovulation+in+Drosophila+melanogaster.">Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).</li><li>Siegmund, T., Korge, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+the+ring+gland+of+Drosophila+melanogaster.">Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).</li><li>McBrayer, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prothoracicotropic+Hormone+Regulates+Developmental+Timing+and+Body+Size+in+Drosophila.">Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila.</a> Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).</li><li>Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonergic+neurons+respond+to+nutrients+and+regulate+the+timing+of+steroid+hormone+biosynthesis+in+Drosophila.">Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila.</a> Nat. Commun. 5, 5778 (2014).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Abramoff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).</li><li>Ohhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+ecdysone+synthesis+by+&#946;3-octopamine+receptor+in+the+prothoracic+gland+is+essential+for+Drosophila+metamorphosis.">Autocrine regulation of ecdysone synthesis by &#946;3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).</li><li>Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+regulation+of+Drosophila+metamorphosis+requires+TGFbeta/Activin+signaling.">Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling.</a> Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).</li><li>Parvy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+&#946;FTZ-F1+in+regulating+ecdysteroid+titers+during+post-embryonic+development+in+Drosophila+melanogaster.">A role for &#946;FTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).</li><li>Parvy, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+feedback+regulation+of+cyclic+steroid+production+in+Drosophila+melanogaster.">Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster.</a> Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Neuropeptide+PTTH+Activates+Receptor+Tyrosine+Kinase+Torso+to+Initiate+Metamorphosis.">The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis.</a> Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).</li><li>Li, H. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GAL4+driver+resource+for+developmental+and+behavioral+studies+on+the+larval+CNS+of+Drosophila.">A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila.</a> Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).</li><li>Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+manipulation+of+serotonergic+neurotransmission+affects+the+escalation+of+aggression+in+adult+male+Drosophila+melanogaster.">Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster.</a> PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).</li><li>Domanitskaya, E., Anllo, L., Sch&#252;pbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phantom,+a+cytochrome+P450+enzyme+essential+for+ecdysone+biosynthesis,+plays+a+critical+role+in+the+control+of+border+cell+migration+in+in+Drosophila.">Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila.</a> Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).</li><li>Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+anchored+by+adherens+junctions+in+the+Drosophila+ovary+niches.">Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.</a> Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).</li><li>Niwa, Y. S., Niwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+control+of+steroid+hormone+biosynthesis+during+development+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).</li><li>Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+Rieske+oxygenase+DAF-36/Neverland+is+a+novel+cholesterol-metabolizing+enzyme.">The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme.</a> J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).</li><li>Niwa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-molting+glossy/shroud+encodes+a+short-chain+dehydrogenase/reductase+that+functions+in+the+&amp;#34;Black+Box&amp;#34;+of+the+ecdysteroid+biosynthesis+pathway.">Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the &amp;#34;Black Box&amp;#34; of the ecdysteroid biosynthesis pathway.</a> Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).</li><li>Komura-Kawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Zinc+Finger+Transcription+Factor+Ouija+Board+Controls+Ecdysteroid+Biosynthesis+through+Specific+Regulation+of+spookier.">The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier.</a> PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).</li><li>Yamanaka, N., Marqu&#233;s, G., O'Connor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle-Mediated+Steroid+Hormone+Secretion+in+Drosophila+melanogaster.">Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster.</a> Cell. 163 (4), 907-919 (2015).</li><li>Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+in+the+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster.</a> BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li><li>Owald, D., Lin, S., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light,+heat,+action:+neural+control+of+fruit+fly+behavior.">Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior.</a> Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz ekdisteroid biyosentezi ve D. melanogaster düzenleyici mekanizma inceledi ve diseksiyon ve immün için bir protokol geliştirmiştir. Ekdisteroid biyosentezi zamanlaması nöronal girişler 33 boyunca çevresel olaylara etkilenir, nedenle diseksiyon sırasında beyin, VNC ve diğer dokuları ile birlikte ecdysteroidogenic organların innervasyon korumak için esastır. Yukarıda tarif edildiği gibi, D. melanogaster PG korpus allata (C...

çok hücreli organizmalarda, bir grup hücre tüm vücut için gerekli olan kendi biyojenik aktivitesinde özel fonksiyonu ile donatılmıştır. görevlerini yerine getirmek için, her bir doku ya da organ işlevleri ile ilişkili genlerin bir dizi ifade eden ve gelişme bağlamında kendi faaliyetlerinin düzenlemek için başka doku ile iletişim kurar. Böyle özel hücresel fonksiyonları ve arası Organ etkileşimlerini karakterize etmek için, hücrelerin diğer türleri çok hücreli mimarisinde bozulmadan tutuluyor ile birlikte bir hücre grubu belirtmek gerekir. Gibi özel organların bir örneği birçok biyosentetik enzimleri aktif steroid hormonları 1 kolesterolden dönüşüm basamaklarını aracılık bir steroidojenik organdır. Bu enzim genlerinin çoğu özel olarak steroidojenik organlarda eksprese edilir ve biyosentez yolu sıkıca hümoral giriş ve nöronal girişleri yoluyla çok sayıda dış uyaranlarla düzenlenir. bir Zamanlarsentez, steroid hormonlar hemolimf içine salgılanır ve gen 2, çeşitli ekspresyonunun düzenlenmesi için bir çok doku ve organların hedeflenir. Bu nedenle, bir steroid hormonunun hareketini homeostazı, büyüme ve üreme korumak için sistemik bir yanıtı indükler. Steroid hormon biyosentezindeki fonksiyonlarını ve steroid hormon pleiotropik etkilerin araştırılması için, Drosophila melanogaster, uygun bir model sistem olarak da kullanılabilir. Larva aşamalarında, böcek steroid hormonu, ekdisteroid, özel bir endokrin organa biyosentezlenir prothoracic bezi (PG) 3 çağırdı. PG, çeşitli ecdysteroidogenic enzimler, özel olarak uygun bir gelişim aşamalarında 4 de deri değiştirme ve başkalaşım kontrol eden, ekdison kolesterol birden fazla dönüşüm basamaklarını katalize ederler. Bu nedenle, ekdisteroid titre içindeki dinamik değişim düzenlenirçevresel uyaranlara yanıt olarak birçok sinyal yollarının tarafından. Öte yandan, yetişkin safhasında, ekdisteroid üreme, uyku, hafıza ve ömrü 5, 6, 7, 8 dahil olmak üzere fizyolojisinde önemli rol oynar. Ekdisteroid aktif oogenez 6, 7, 8, 9, 10, 11 ilerlemesini düzenleyen, yumurtalık biyosentezlenmiş olduğu bilinmektedir. Yakın zamanda tohum çizgisi kök hücreleri (GSC&#39;ler) sayısı çiftleşme yanıt olarak ekdisteroid ve cinsiyete peptid sinyal etkilenir bildirmiştir 12 uyarıcıya sahip. D. güçlü araçlar iyi açıklamalı genom bilgileri de dahil olmak genetik ve hücre biyolojisi, melanogaster, ikili gensentezleme sistemleri ve transgenik RNAi teknikleri, PG ve yumurtalık 13, 14, 15&#39;te biyosentezini ekdisteroid için gerekli genleri tanımlamak için sağlamıştır. Ecdysteroidogenic genler tespit edildikten sonra, bu genlerin ve gen ürünlerinin dinamik lokalizasyonunun transkripsiyonel düzenleme biyosentez yolunun 16 incelenebilir. Bu amaç için, nicel-ters transkripsiyon-PCR, in situ hibridizasyon ve immünohistolojik analizi RNA yürütülmektedir. Bu tekniklerin uygulanması zor bir görev içerir; PG veya yumurtalık ayrıntılı diseksiyon. Özellikle meyve sineği PG diğer böcekler bu göreceli olarak daha küçük olan (örneğin ipek böceği ve darbe sineği), bu nedenle bir meyve hayati bir beceri örnekleme için diseksiyon sinek uygulama gerekir. Ayrıca, her iki ecdysteroidogenic organlar innervasyon almakMerkezi sinir sisteminde (MSS) 17, 18, 19, 20 s. Bu nedenle, doğru anatomik analizler için, ecdysteroidogenic organlar CNS ve diğer organlarda, bunların nöronal bağlantıları bozmak için birlikte sağlam tutulmalıdır. Burada diseksiyon ve D Sterpidojenik organların görüntülenmesi için protokoller sağlamaktadır. melanogaster. diseksiyon tekniğini öğrenmek bu deneyler için anahtar bir başlangıç ​​noktasıdır. Buna ek olarak, bir başarıyla birkaç antikorlar ve GAL4 sürücü hatları ile steroidogenik organları yanı sıra interaktif organları etiketleyebilirsiniz. bu teknikler, malzeme ve genetik yararlanarak, bir steroid hormon biyosentezindeki kapsamlı mekanizmaları incelemek için.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;egg collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tissue culture dish (55 mm)</td><td>AS ONE</td><td>1-8549-02</td><td>&amp;nbsp;for grape-juice agar plates</td></tr><tr><td>collection cup</td><td>HIKARI KAGAKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>yeast paste</td><td>Oriental dry yeast, Tokyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% grape juice</td><td>Welch Food Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;rearing larvae&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>small vials (12ml, 40&amp;times;23.5 mm, PS)</td><td>SARSTEDT</td><td>58.487</td><td></td></tr><tr><td>disposable loop</td><td>AS ONE</td><td>6-488-01</td><td></td></tr><tr><td>standard fly food</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;the recepi us on the website of Blooington stock center.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;dissection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>S8 AP0</td><td></td></tr><tr><td>tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>TORAY</td><td></td><td>coarting silicon inside dishes</td></tr><tr><td>Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)&amp;nbsp;</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td>A &quot;knife&quot; to cut the tissue</td></tr><tr><td>forceps, Inox, #5</td><td>Dumont, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>insect pin (0.18 mm in diameter)</td><td>Shiga Brand</td><td></td><td>for fillet dissection</td></tr><tr><td>micro scissors</td><td>NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.&amp;nbsp;</td><td>MB-50-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;fixation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>16222-65</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>02890-45</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1.5 ml)</td><td>INA OPTIKA</td><td>CF-0150</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Incubation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>As one swist mixer TM-300 (rocker)</td><td>As one</td><td>TM-300</td><td>rocker</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;primary antibody&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Sro (guinea pig), 1:1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP (rabbit), 1:1000</td><td>Molecular Probes</td><td>A6455</td><td>Shimada-Niwa ans Niwa, 2014</td></tr><tr><td>anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100</td><td>Nakarai tesque</td><td>04363-66</td><td></td></tr><tr><td>anti-5HT (rabbit), 1:500</td><td>SIGMA</td><td>S5545</td><td></td></tr><tr><td>anti-Hts 1B1 (mouse)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>1B1</td><td></td></tr><tr><td>anti-DE-cadherin (rat), 1:20</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td></td></tr><tr><td>anti-nc82 (mouse), 1:50</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;secondary antibody&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A-22283</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mounting reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro slide glass</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>SS7213</td><td></td></tr><tr><td>Square microscope cover glass</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>C218181</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave reagent (Mounting reagent)</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)</td><td>WATSON</td><td>5660-222-1S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;imaging&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 laser scanning microscope system</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>inverted Axio Observer. Z1 SP left</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;image processing&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly stocks&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; GMR45C06-GAL4</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)</td></tr><tr><td>UAS&amp;ndash;GFP; UAS&amp;ndash;mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>gifts from K. Ito, The University of Tokyo.</td></tr><tr><td>w[1118]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4</td><td></td><td></td><td>see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. &amp;amp; Kravitz, E. A.(2010)</td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)</td></tr><tr><td>yw;; nSyb-GAL4</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)</td></tr></tbody></table>

protocols for visualizing steroidogenic organs and their interactive organs with immunostaining in the fruit fly drosophila melanogaster

Çok hücreli organizmalarda, hücre küçük bir grup, büyüme ve üreme sistemik tepkisine sebep olarak, bunların biyojenik aktiviteye özel bir fonksiyon ile donatılmıştır. böceklerde, larva prothoracic bezi (PG) ve ekdisteoidlerden adlandırılan ana steroid hormonları-üreten mutantı ya yetişkin kadın yumurtalık oyun temel roller. Bu ecdysteroidogenic organlar biyosentezi zamanlaması çevresel işaret tarafından etkilendiğini sinir sistemi, gelen innerve. Burada steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmak için uygun bir model sistemi sağlar Drosophila melanogaster, sinek ecdysteroidogenic organları ve larva kendi interaktif organları ve meyve yetişkinleri görselleştirilmesi için bir protokol açıklar. Usta diseksiyon bize beynin ventral sinir kordonu ve diğer dokularda da dahil ecdysteroidogenic organların konumlarını ve interaktif organlarını korumak sağlar. Bir ile immün boyamaecdysteroidogenic enzimlerine karşı ntibodies, dokuya özel promoterler tarafından tahrik edilen transgenik floresan proteinleri ile birlikte, ecdysteroidogenic hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Üstelik ecdysteroidogenic organların inervasyonları da spesifik antikorların veya nöronların çeşitli GAL4 sürücülerin bir koleksiyon ile etiketli olabilir. Bu nedenle, ecdysteroidogenic organları ve nöronal bağlantıları immün ve transgenik teknikler ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Son olarak, kimin çoğalması ve bakım ekdisteoidlerden tarafından kontrol edilir germ hattı kök hücreleri, görselleştirmek için nasıl açıklar. Bu yöntem steroid hormon biyosentezi ve nöronal düzenleyici mekanizmanın kapsamlı anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.

Biz steroidogenik organları ve D. melanogaster larvaları ve yetişkin kadınlarda onların interaktif organ incelemeleri için yukarıdaki protokoller kullanılır. Protokolleri genel şeması Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. PG (Şekil 2D), beyin göre daha küçük ve daha şeffaf olduğu ve beyin (Şekil 2A-C ve 3A-E) ön-sırt tarafında yer de dahil olmak üzere, RG,. PG hücreleri etiketlemek için, çeşitli gruplar ecdysteroidogenic enzimlerine ...

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster at JoVE.com

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Biz diseksiyon, tespit ve steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmaya Drosophila larvaları ve yetişkin kadınlarda Sterpidojenik organların immün için bir protokol açıklar. steroidojenik organlara ek olarak, böyle germ çizgili kök hücreleri gibi steroidojenik organların innervasyon olarak steroidojenik hedef hücreleri görselleştirmek.

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

protocols-for-visualizing-steroidogenic-organs-their-interactive

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

10.3K Görüntüleme.  University of Tsukuba.  Biz diseksiyon, tespit ve steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmaya Drosophila larvaları ve yetişkin kadınlarda Sterpidojenik organların immün için bir protokol açıklar. steroidojenik organlara ek olarak, böyle germ çizgili kök hücreleri gibi steroidojenik organların innervasyon olarak steroidojenik hedef hücreleri görselleştirmek. 

Video: Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Nörobilim

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Gelişim Biyolojisi

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Diseksiyon ve boyanması Drosophila Larvaların Yumurtalıkların

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Biyoloji

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm development. However, immunolabeling of the whole Drosophila testis is often associated with significant non-uniformity of staining due to antibody penetration. Squashed preparations only partially overcome the problem since it decreases the 3D quality of the analyses. Herein, we describe a whole-mount protocol using NP40 and heptane during fixation together with immunolabeling in liquid media. It preserves the volume suitable for confocal microscopy together with reproducible and reliable labeling. We show different examples of 3D reconstitution of spermatocyte nuclei from confocal sections. The intra- and inter-testes reproducibility allows 3D quantification and comparison of fluorescence between single cells from different genotypes. We used different components of the intranuclear MINT structure (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) as well as two components associated with the nuclear pore complex to illustrate this protocol and its applications on the largest cells of the testis, the S4-S5 spermatocytes.

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

We present here an improved protocol for the whole-mount preparation and immunostaining of Drosophila testes, suitable for confocal microscopy and also allowing reproducible and reliable labeling. We illustrate this protocol by 3D representation and quantification of colocalization experiments on the large S4-S5 spermatocytes.

Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Drosophila Larval IHC

Immunohistochemistry (IHC) is a technique used to visualize the presence and location of proteins within tissues. Drosophila larvae are particularly amenable to IHC because of the ease with which they can be processed for staining. Additionally, the larvae are transparent, meaning that some tissues can be visualized without the need for dissection.
In IHC, proteins are ultimately detected with antibodies that specifically bind to &ldquo;epitopes&rdquo; within the protein of interest. In order to preserve these epitopes, tissues must be fixed prior to staining. Furthermore, in order for antibodies to penetrate membranes, cells must be permeabilized with detergents. This video article offers a detailed view of the reagents, tools, and procedures necessary for the staining of dissected larval tissues, including fixation, blocking, and staining steps. Also featured is a demonstration of tissue mounting techniques for fluorescence microscopy. Finally, examples of the broad range of applications for these techniques (and some variations upon them) are provided.

Drosophila melanogaster Larval Immunohistochemistry IHC

Immunohistochemistry (IHC) is a technique used to visualize the presence and location of proteins within tissues. Drosophila larvae are particularly ...

Education

JoVE Science Education

Temel Biyoloji

Biyoloji I: Maya, Drosophila ve C. elegans

Visualizing Mushroom Body Neurons in Drosophila Brains via Immunostaining

Source: Kelly, S. M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56174">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a detailed immunostaining protocol to visualize phenotypic defects in the mushroom bodies of mutant Drosophila brains. The protocol involves using antibodies against Fas2, a protein involved in axonal guidance that facilitates the proper morphological and functional development of the mushroom body.

Drosophila Beyinlerindeki Mantar Vücut Nöronlarının İmmün Boyama ile Görüntülenmesi

1. Fixation and Immunofluorescent Staining Procedure

	Using a p200 pipette, transfer dissected brains from the 9-well dish to a 0.5 mL microcentrifuge ...

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi