Bu araştırma T32 (CA 9686-18) ve 1 TL (TL1TR001431) doktora sonrası eğitim bursu ödülleri (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) yanı sıra tarafından desteklenmiştir U01 PAR-12-095 (Kumar) ve P30 CA051008-21 (Weiner). Örnek sabitleme, kesit ve boyama Lombardi Kapsamlı Kanser Merkezi Histoloji ve Doku Paylaşılan Kaynak gerçekleştirildi. Biz yararlı tartışmalar için Richard Schlegel teşekkür ederiz. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

3D Hücre 1. Kuruluş Kültür takın Sistemi <ol><li> Aşağı 6 kuyu plaka (Şekil 1A) bir ters yönde (yukarı filtre tarafı) 2 polikarbonat hücre kültürü ekler yerleştirin. </li><li> parçanın alt tarafına su içinde% 0.1 jelatin, ince bir tabaka halinde yayılır ve sterilliği korumak için, biyolojik bir güvenlik kabini (10-20 dakika) kurutun. </li><li> Adımı tekrar 1.2 insert% 0.1 jelatin 3 uygulama toplam iki kere daha. NOT: Jelatin kaplama odacıkları arasındaki sınır difüzyon yardımcı olacaktır. </li><li> kültür şişesi yıkamak için 5 ml PBS ekleyin standart kültür koşullarında birincil Literatürde KRK toplamak için. <ol><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika süreyle% 0.25 tripsin-EDTA (T-75 T-25 ve 2 mL için 1 mL) kullanılarak hücreler tripsinize. Yavaşça hücreleri yerinden çıkarılmasına yardımcı olmak için balonun yan dokunun. Sonra tripsin reaksiyonu durdurmak ve tam DMEM 5 ml ekleyerek hücreleri toplamak için devam edin. </li><li> Toplamak<html> 15 ml bir tüp içinde hücreleri. 4 ° C ve 188 x g&#39;de tüpü santrifüjünde ve otomatik bir hücre sayacı ya hemasitometre kullanarak sayın. </li><li> Medya (CM) klimalı 250 uL 600.000 Literatürde KRK yeniden askıya ve düzgün odaklı (filtre tarafı aşağı) kültür insert (Şekil 1B) ekleyin. Bu iç hazne olarak adlandırılır. Not: CM ışınlanmış J2 hücreleri şartlandırılmış F ortamı ve daha önce 7, 8, 9, 11 tarif edilen şekilde 10 um Y-27632 içerir. </li></ol></li><li> 6 plaka dış haznesine CM 2 mL uygulayın ve (en azından 18 saat için) gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Dikkatlice 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasının CM kaldırmak ve yavaş yavaş tam kadar 1 ml pipet ile iç odaya farklılaşma medya (DM) ekleyin. Hücre tabakası rahatsız için dikkatli olun. </li></ol>3D Kültürlerin le &quot;&gt; 2. Bakım <ol><li> Her gün kültürleri kontrol edin. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, sağlıklı hücreler görünür. </li><li> Dış odasında CM her gün ya da hücrelerin metabolizması bağlı olarak her geçen gün değiştirin. </li><li> (Sarı), iç bölme değişiklikleri renk medya, dikkatli bir 1 ml veya 200 uL pipet ile iç filtre odasının medya kaldırdığınızda. </li><li> Bir aspirasyon ucu ile dış 6 kuyu plaka odasında medya aspire. </li><li> 1 ml pipet kullanarak, yavaşça tam kadar iç odaya taze DM uygulayın. kazımak veya başka hücre tabakası çıkarmak için dikkatli olun. </li><li> Taze CM 2 mL dış odasının ortamı değiştirin. </li><li> 2 hafta kültürleri korumak ve daha sonra istenen bimolecular izolasyonu için işleme devam edin. NOT: 6 plaka her satır, altı ekler (Şekil 1B) toplam, DN için yeterli hücre elde etmek için deney başına işleme tabi tutulmalıdırAnaliz için bir RNA ya da protein. </li><li> dış odanın aspire ortam ve 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile durulayın. </li><li> Dikkatlice 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasından ortamı çıkarın ve 500 uL PBS ekleyin. kazıma veya başka membran üzerinde hücrelerin rahatsız etmemek. </li><li> Aspire dış odasından PBS ve dikkatli bir 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasından PBS kaldırmak. PBS çıkarıldı sonra, aşağıda ayrıntılı olarak uygun bir uygulama direkt olarak devam edin. Membran kurumasına izin vermeyin. Uygulama başlamaya hazır olana kadar kültür PBS kısaca tutulabilir. </li></ol> 3. Pelet Bankacılık için filtreler İşleme <ol><li> her bir iç bölmeye 100 uL% 0.25 tripsin-EDTA ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. </li><li> aşağı yukarı pipetleme ve süre Kısaca ve özenle / ajitasyon 200 uL pipet ile membran yüzeyinde hücreleri kazıyın (Punc önlemek) Membran açmadan. 37 ° C&#39;de 1 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Filtreyi durulama yavaşça ilk iç odaya CM 250 uL ekleyin ve yukarı pipet ve. </li><li> Transferi Aynı medya koşullarını içerir ve aşağı yukarı pipetleme tekrarlayın ve komşu filtre odasına hücreleri yeniden süspanse. </li><li> Tek bir durumun ekler her biri için bu işlemi tekrarlayın. Toplamak ve 1.5 ml santrifüj tüpüne hücreleri transferi. </li><li> kalan hücreleri toplamak için CM ek 100-200 uL her bir iç bölmeyi durulayın. Aşama 3.5, 1.5 ml santrifüj tüpüne ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir mikrosantrifüj içinde 423 xg&#39;de hücreleri dönerler. </li><li> Süpernatantı aspire ve 1000 uL PBS ile bir kez hücre pelet yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir mikrosantrifüj içinde 423 x g hızında tekrar Spin. </li><li> PBS aspire ve daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de dondurularak. </li></ol> 4. RNA veya DNA İzolasyon için filtreler İşleme <ol&gt; <li> İç bölmeye guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform veya benzer ekstraksiyon reaktifi, 200 uL ilave edilmekte ve kısaca bir şekilde pipetli yukan aşağı çekilerek membran yüzeyinde hücreleri çalkalayın. </li><li> Dış oda kuru ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ekstre edici reaktif olarak inkübe edin. <ol><li> filtre elemanından ayırmak gibi, yukarı ve aşağı çekme çözüm pipetleme kopuk filtre membran yıkayın. 6 plaka devirme ve herhangi bir kalıntı sıvıyı aspire mümkün olduğunca çıkarma reaktif kadar toplayın. </li></ol></li><li> saflaştırılması ve DNA, RNA ya da protein geri kazanımı için imalatçının protokolü takip edin. </li></ol> 5. Protein İzolasyonu için filtreler İşleme <ol><li> Buz üzerinde 6 plaka filtre koyunuz. İç bölmeye, 10 ul 1 mM sodyum florit (NAF), 1 mM sodyum vanadat (NAV), 100 mM dithiothre ile takviye edilmiş bir protein liziz tamponu ilaveinositol (DTT) ve anti-proteaz kokteyli 100 uL. </li><li> / Çalkalamak yukarı ve aşağı pipetleme ise 20 uL pipet ile membran yüzeyinde hücreleri kazıyın. lizis tamponunda kabarcıkları üreten kaçının. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde filtre eklenmiş 6 yuvalı plaka inkübe edin. </li><li> kazıma Tekrar sonra lizis tamponu ile membran yüzeyin durulanması. </li><li> 6 uçlar arasında lisatlan toplayın ve buz üzerinde 1.5 ml santrifüj tüpüne aktarılır. </li><li> Bir sonraki filtreye liziz tamponu ve transfer ek olarak 10 uL ilk membran durulayın. </li><li> Tüm ekler için yineleyin 5.6, herhangi bir kalıntı lizis tampon çözeltisi toplama ve 1.5 mL tüp (adım 5.5) ekleyin. </li><li> ilave bir 5 dakika boyunca buz üzerinde örnek inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika maksimum hızda (bir masa üstü santrifüjü içinde 16.873 xg) dönerler. </li><li> Taze 1.5 ml tüp içine Pipet lizat süpernatant. </li><li> protein konsantrasyonu ya da taştan analizine devam edin-80 ° C&#39;de lizatları Re. </li></ol> H &amp; E ve Immuno-boyama 6. İşleme <ol><li> İç ve dış bölmeye 500 uL% 10 1 ml NBF (nötr tamponlu formalin) ilave edin ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Dış odasından NBF aspire ve 1 mL hidroksietil agaroz (HEA), 1.5 mL santrifüj işleme jeli ilave edin. Yavaş yavaş düşük güç kullanan bir mikrodalga agaroz eritebilir ve erimiş agaroz kadar 10-20 s darbeleri tekrarladı. </li><li> Kullanıma hazır olana kadar katılaşmasını önlemek için, 37 ° C sıcak bir banyoda HEA tutun. </li><li> iç odanın NBF çıkarın ve iç bölme erimiş HEA 25 uL uygulanır ve agaroz 2-5 dakika boyunca katılaşmaya sağlar. </li><li> % 10 NBF Islak 2 köpük histoloji yastıkları ve (Şekil 3D bakınız) gömme kaset bir ped yerleştirin. </li><li> parçanın alt tarafında filtreyi skor (çok keskin, ince uçlu bir bıçak olan) bir 11. bıçak neşter kullanabilirsinizodası kısmen plastik uç haznesinden bırakmadan. </li><li> Bir Petri kabındaki NBF küçük bir miktar (100-200 ul) yerleştirin ve NBF (Şekil 3A) kısmen yerinden filtreyi batırmayın. </li><li> Bir # 10 bıçak neşter ile hafifçe tam uç haznenin (Şekil 3B) filtre çıkarmak için, uç bölmenin içinden, filtre ortasında karşı baskı. hala hazne takılı filtrenin bir kısmı olması durumunda, neşter ile sever. </li><li> 10. bıçak neşter (Şekil 3C) ile ikiye HEA kaplı filtre kesin. </li><li> Aşama 6.4 (Şekil 3D) &#39;de hazırlanan histolojik kaset köpük ped üzerine, filtrenin her yarım yerleştirin. </li><li> Filtreyi sandviç, kaset ikinci% 10 NBF batırılmış sünger ekleyin. </li><li> Yapış NBF kaseti, yer mühür ve gece inkübe edin. </li><li> kesit ve boyama olarak parafin bloklar halinde süreç filtreleriDaha önce 12 tarif. </li></ol>

<ol>
	<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis.">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li><li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development.">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li><li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+stem+cells.">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li><li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells.">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li><li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells.">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li><li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogs+of+the+Novel+Phytohormone,+Strigolactone,+Trigger+Apoptosis+and+Synergy+with+PARP1+Inhibitors+by+Inducing+DNA+Damage+and+Inhibiting+DNA+Repair.">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer.">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868 (2015).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Primer hücre hatları kanser araştırmaları için önemli ve hızla gelişen bir platform vardır. kültür insert tabanlı 3D kültür sistemi bir iki haftalık süre içinde birincil prostat CRClerin farklılaşmasını desteklemektedir. CRC filtre yöntemi prostat araştırma için yeni bir orta hacimli yöntemi temsil eder. Mevcut fare PDX modelleri zaman alıcı ve son derece pahalıdır ve PDX örneklerin birçok araştırmacı tarafından başlatılan deney ve kullanımını sınırlayan, kültür içinde yeti...

bireylere kişiselleştirilmiş kimlik ve kanser tedavilerinin kullanımı kanser araştırmalarında bir birincil hedefi vardır. Son zamanlarda, yeni yaklaşımlar potansiyel olarak her iki belirleme ve kişiye özel tedavilerin test yolları sağlayan primer hücre kültürlerinde kurulmasında daha kolay izin geliştirilmiştir. Örneğin, R-spondin bazlı prostat organoid yaklaşım 1 bir ticari hücre dışı matris içinde normal ve metastatik prostat kanseri hücrelerinin üç boyutlu (3D) kültür (ör Matrigel) için Hücrelerin Şartlı yeniden programlanması (CRC) yöntemi ise Georgetown 2 geliştirilen, 3 daha fazla standart 2D kültür koşulları kullanır. Spesifik olarak, Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ve ışınlanmış J2 fare fibroblast besleyici hücreler kombinasyonu keratinosit CRC 2 belirsiz kültür yol açar. CRC metodolojiSon derece sağlam, birincil hücre hatları başarıyla kuruldu ve prostat ve diğer birçok normal ve malign epitelyal dokuların 3 süresiz muhafaza ile. Önemlisi, bizim CRC teknolojisi önceki ilaç tedavileri bir dizi başarısız olan bir hastada tekrarlayan solunum papillomatozis için etyolojik temeli hızla tanımlanması için izin verdi. Buna ek olarak, normal ve tümör kaynaklı Literatürde KRK kullanılarak bir FDA başarılı kimlik ilk doku biyopsisi iki hafta içinde yapıldı, vorinostat ilaç onaylanmıştır. Hastalar, hastalıkları 4 başarılı bir şekilde tedavi ile sonuçlanan vorinostat yerleştirildi. Normal prostat bezi luminal, bazal ve nadir nöroendokrin hücrelerden 5 oluşmaktadır. Luminal hücrelerin bezinin kolon epitel tabakasının oluşturulması ve androjen reseptörü (AR), hem de bu sitokeratin 8 ve 18 ve ön ve diğer lümen belirteçlerdevlet-spesifik antijen (PSA) 6. Tersine, bazal hücre lümen tabakasının altında lokalize ve sitokeratinin 5 ve p63, ama AR 5 düşük seviyelerde ifade edilir. Biz 7, 8, 9 ve diğerleri 10 başarılı bir şekilde klinik öncesi mekanik ilaç duyarlılığı araştırmalarda prostat Literatürde KRK kullandık. Standart 2D doku kültürü koşullarında yetiştirilen Ancak, bu hücrelerin tam 10 sinyalizasyon AR kavrayana başarısız. bağışıklık yetersizliği olan farelerde böbrek kapsülü altına En önemlisi, CRC permisif ortamına yerleştirildiklerinde prostat CRC kendi soy kararlılığını muhafaza belirten normal prostat glandüler mimarinin ve fonksiyonu geri kazanılmaz. Burada açıklanan Filtre elemanı dayalı hücre kültür sisteminin gelişimi hızlı (2 hafta) kanıtlandığı b prostat CRC in vitro farklılaşmasını sağlarY, artan Ar ve Ar, hedef genlerin ekspresyonu da azaldıkça p63 seviyeleri. Kullanılan filtre ekler memeli hücrelerinin kültürlenmesini destekleyebilir polikarbonat zarları (gözenek boyutu, 0.4 mikron) ihtiva ederler. Sistem, geliştirilmiş olarak normal ve habis prostat CRC, 6 oyuklu kültür tabaklarında ve filtre insertlerin kullanımını sağlar. J2 hücreleri 11 ile belirlenen hücre kültür ortamı, üst bölme alt bölmesi ve prostat ayırt ortam yerleştirilir. teknikler, burada kişiselleştirilmiş tıp hedefleriyle uyumlu bir 2 hafta süre içinde prostat lümen hücre farklılaşmasını destekleyen tarif. Kültürlerin kapsamlı, moleküler genetik ve hücresel profil izin metodolojiler geliştirilmesi de zorunluluk oldu. Filtre yüzeyinden salınan hücrelerden DNA, RNA ve protein izole edilmesine yönelik yaklaşımlar geliştirilmiş ve doğru tekrar numune işleme için aerodinamik edilmiştir. FinaLly, metodoloji H &amp; E, immünohistokimyasal ve immunofluorescent boyama, gömme etkinleştirmek için filtreyi kaldırma kesit için ve gerekli, tam bir şekilde anlatılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Corning Costar Snapwell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Inserts</td><td>Millipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 Well</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin 0.1% in water</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Standard Scalpel 11 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>Fishcer Scientific</td><td>S299-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Vanadate</td><td>Fishcer Scientific</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Nutrient Mix Media</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Non-Adherent Dressing</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Sigma</td><td>SIAL0167</td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes</td><td>Crystalgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid filter insert-based 3d culture system for primary prostate cell differentiation

Şartlı yeniden programlanması hücreleri (CRC), birincil hücre kültürü ve hasta türevi hücre hatlarının geniş bir &quot;canlı biyobankalar&quot; geliştirilmesi yeteneğine için kalıcı bir yöntem sağlar. Epitel hücrelerinin pek çok türleri için, farklı üç boyutlu (3D) bir kültür yaklaşımları, geliştirilmiş bir farklılaşmış hallerinin destekleyen tarif edilmiştir. CRC de izole edildiği doku olarak soy kararlılığını muhafaza ederken, normal, iki boyutlu (2D) kültür koşulları altında yetiştirildiğinde kaynaklı doku ile ilişkili farklılaşma markörünü ifade etmiş başarısız olur. prostat kanseri araştırması için, hasta türevi CRC uygulama geliştirmek için, 3D kültür formatı, normal ve tümör türetilmiş prostat epitelial hücreleri hem de hızlı bir şekilde (2 gün toplam) lümen hücre farklılaşması sağlayan tanımlanmıştır. Burada, bir filtre elemanı tabanlı formatı, normal ve habis prostat CRC hem kültür ve farklılaşması için tarif edilmiştir. bir deimmünohistokimyasal ve immunofluorescent boyama hücre toplama ve işleme için gerekli prosedürlerin kuyruklu açıklaması verilmektedir. Topluca ilköğretim CRC hatları ile kombine tarif 3D kültür biçimi, biospecimen tabanlı prostat araştırma için verim model sistemi belirginleştirebilirsiniz önemli bir orta sağlar.

Hücre kültürü uç tabanlı sistem lümen hücre farklılaşmasını destekleyen prostat CRC 3D kültürleri üretmek için göreceli olarak basit ve hızlı bir yöntemdir. Sistemin şematik bir filtre elemanının alt yüzeyine jelatin kaplama uygulamasını öne (Şekil 1A) gösterilmektedir. dolgular yalnızca jelatin uygulanması için devrilmiştir. Şekil 1B filtreler kültürlenmesi için uygun doğrultuda bulunmaktadır. Şeffaf bir hücre ek...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation at JoVE.com

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Primer Prostat Hücre Farklılaşma için hızlı Filtre Ekle tabanlı 3D Kültür Sistemi

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

a-rapid-filter-insert-based-3d-culture-system-for-primary-prostate

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K Görüntüleme.  Lombardi Comprehensive Cancer Center. Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Video: A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement membrane (BM) during age-related pathologies and metabolic disorders (e.g. cancer, diabetes, microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy). The premise of the model is non-enzymatic crosslinking of reconstituted BM (rBM) matrix by treatment with glycolaldehyde (GLA) to promote advanced glycation endproduct (AGE) generation via the Maillard reaction. Examples of laboratory techniques that can be used to confirm AGE generation, non-enzymatic crosslinking and increased stiffness in GLA treated rBM are outlined. These include preparation of native rBM (treated with phosphate-buffered saline, PBS) and stiff rBM (treated with GLA) for determination of: its AGE content by photometric analysis and immunofluorescent microscopy, its non-enzymatic crosslinking by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) as well as confocal microscopy, and its increased stiffness using rheometry. The procedure described here can be used to increase the rigidity (elastic moduli, E) of rBM up to 3.2-fold, consistent with measurements made in healthy versus diseased human prostate tissue. To recreate the biophysical microenvironment associated with the aging and diseased prostate gland three prostate cell types were introduced on to native rBM and stiff rBM: RWPE-1, prostate epithelial cells (PECs) derived from a normal prostate gland; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by benign prostatic hyperplasia (BPH); and PC3, metastatic cells derived from a secondary bone tumor originating from prostate cancer. Multiple parameters can be measured, including the size, shape and invasive characteristics of the 3D glandular acini formed by RWPE-1 and BPH-1 on native versus stiff rBM, and average cell length, migratory velocity and persistence of cell movement of 3D spheroids formed by PC3 cells under the same conditions. Cell signaling pathways and the subcellular localization of proteins can also be assessed.

Here we explain a protocol for modelling the biophysical microenvironment where crosslinking and increased stiffness of the basement membrane (BM) induced by advanced glycation endproducts (AGEs) has pathological relevance.

Prostat Kanseri ve Diğer Yaşa bağlı Patolojilerde veya Metabolik Hastalıklarda bir Biyofiziksel Tetik olarak Bazal Membran Rijitliğinin Eğitim Nasıl

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Kanser Araştırmaları

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Kimlik, histolojik karakterizasyonu ve için fare Vitro 3D küresel kültür modelleri prostat lob diseksiyonu

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) are a rigorous method for studying mammalian development and disease. Our laboratory has developed several GEMMs of prostate cancer (PCa) that lack expression of one or multiple tumor suppressor genes using the site-specific Cre-loxP recombinase system and a prostate-specific promoter. In this article, we describe our method for necropsy of these PCa GEMMs, primarily focusing on dissection of mouse prostate tumors. New methods developed over the last decade have facilitated the culture of epithelial-derived cells to model organ systems in vitro in three dimensions. We also detail a 3D cell culture method to generate tumor organoids from mouse PCa GEMMs. Pre-clinical cancer research has been dominated by 2D cell culture and cell line-derived or patient-derived xenograft models. These methods lack tumor microenvironment, a limitation of using these techniques in pre-clinical studies. GEMMs are more physiologically-relevant for understanding tumorigenesis and cancer progression. Tumor organoid culture is an in vitro model system that recapitulates tumor architecture and cell lineage characteristics. In addition, 3D cell culture methods allow for growth of normal cells for comparison to tumor cell cultures, rarely possible using 2D cell culture techniques. In combination, use of GEMMs and 3D cell culture in pre-clinical studies has the potential to improve our understanding of cancer biology.&#160;

We show a method for necropsy and dissection of mouse prostate cancer models, focusing on prostate tumor dissection. A step-by-step protocol for generation of mouse prostate tumor organoids is also presented.

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Genetik

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate organoids are androgen responsive, three-dimensional (3D) cultures grown in a defined medium that resembles the prostatic epithelium. Prostate organoids can be established from wild-type and genetically engineered mouse models, benign human tissue, and advanced prostate cancer. Importantly, patient derived organoids closely resemble tumors in genetics and in vivo tumor biology. Moreover, organoids can be genetically manipulated using CRISPR/Cas9 and shRNA systems. These controlled genetics make the organoid culture attractive as a platform for rapidly testing the effects of genotypes and mutational profiles on pharmacological responses. However, experimental protocols must be specifically adapted to the 3D nature of organoid cultures to obtain reproducible results. Described here are detailed protocols for performing seeding assays to determine organoid formation capacity. Subsequently, this report shows how to perform drug treatments and analyze pharmacological response via viability measurements, protein isolation, and RNA isolation. Finally, the protocol describes how to prepare organoids for xenografting and subsequent in vivo growth assays using subcutaneous grafting. These protocols yield highly reproducible data and are widely applicable to 3D culture systems.

Presented here is a protocol to study pharmacological responses in prostate epithelial organoids. Organoids closely resemble in vivo biology and recapitulate patient genetics, making them attractive model systems. Prostate organoids can be established from wildtype prostates, genetically engineered mouse models, benign human tissue, and advanced prostate cancer.

Genotipleri ve Mutasyonel Profilleri Farmakolojik Tepkilere Çeviren Araçlar Olarak Prostat Organoid Kültürleri

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

3 Boyutlu Spheroid Kültürlerden Kök Benzeri Hücrelerin İzolasyon

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred to as patient-derived organoids (PDO), are an invaluable resource for studying the mechanism of tumorigenesis and metastasis of prostate cancer. Their main advantage is that they maintain the distinctive genomic and functional heterogeneity of the original tissue compared to conventional cell lines that do not. Furthermore, 3D cultures of PDO can be used to predict the effects of drug treatment on individual patients and are a step towards personalized medicine. Despite these advantages, few groups routinely use this method in part because of the extensive optimization of PDO culture conditions that may be required for different patient samples. We previously demonstrated that our prostate cancer bone metastasis PDX model, PCSD1, recapitulated the resistance of the donor patient&rsquo;s bone metastasis to anti-androgen therapy. We used PCSD1 3D organoids to characterize further the mechanisms of anti-androgen resistance. Following an overview of currently published studies of PDX and PDO models, we describe a step-by-step protocol for 3D culture of PDO using domed or floating basement membrane (e.g., Matrigel) spheres in optimized culture conditions. In vivo stitch imaging and cell processing for histology are also described. This protocol can be further optimized for other applications including western blot, co-culture, etc. and can be used to explore characteristics of 3D cultured PDO pertaining to drug resistance, tumorigenesis, metastasis and therapeutics.

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional cultures of patient BMPC specimens and xenografts of bone metastatic prostate cancer maintain the functional heterogeneity of their original tumors resulting in cysts, spheroids and complex, tumor-like organoids. This manuscript provides an optimization strategy and protocol for 3D culture of heterogeneous patient derived samples and their analysis using IFC.

Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Elde Edilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process involves seeding of epithelial cells sparsely in a 3D matrix gel on a 96-well microplate with media changes to cultivate expansion into organoids. Morphology is then assessed by whole-well capturing of z-stack images. Compression of z-stacks creates a single in-focus image from which organoids are measured to quantify a variety of outputs, including circularity, roundness, and area.DNA, RNA, and protein can be collected from organoids recovered from the matrix gel. Cell populations of interest can be assessed by organoid dissociation and flow cytometry. Formalin-fixation-paraffin-embedding (FFPE) followed by sectioning is used for the histological assessment and antibody staining. Whole-mount immunofluorescent staining preserves organoid morphology and facilitates observation of protein localization in organoids in situ. Commercial assays that are traditionally used for 2D monolayer cells can be modified for 3D organoids. Used together, the techniques in this protocol provide a robust toolbox to quantify prostate organoid growth, morphologic characteristics, and expression of differentiation markers.

Here, we present a protocol to guide human primary prostate organoid handling then suggest endpoints to assess phenotype. Seeding, culture maintenance, recovery from matrix gel, morphologic quantification, embedding and sectioning, FFPE sectioning, whole-mount staining, and application of commercial assays are described.

Kullanım ve insan birincil prostat Organoid kültürü değerlendirilmesi

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Biyomühendislik

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls and restrict access to the brain parenchyma. However, with the development of nanotechnologies, large panels of new nanomaterials were developed to improve drug delivery, highlighting the need for reliable in vitro microsystems to predict brain penetration in the frame of preclinical assays. Here is a straightforward method to set up a microphysiological system to model the BBB using solely human cells. In its configuration, the model consists of a triple culture including brain-like endothelial cells (BLECs), pericytes, and astrocytes, the three main BBB cellular actors necessary to induce and regulate the BBB properties in a more physiological manner without the requirement of tightening compounds. The model developed in a 12-well plate format, ready after 6 days of triple culture, is characterized in physical properties, gene, and protein expressions and used for polymeric nanogel transport measurement. The model can be used for an extensive range of experiments in healthy and pathological conditions and represents a valuable tool for preclinical assessments of molecule and particle transport, as well as inter-and intracellular trafficking.

This protocol describes a method to establish a human blood-brain barrier (BBB) in vitro model. The endothelial cells and pericytes are seeded on each side of an insert filter (blood compartment), and astrocytes are seeded in the bottom well (brain compartment). The model characterized was used for nanoparticles transport experiments.

İnsan Kan-Beyin Bariyerini Modelleyen Üçlü Kültür Hücre Sistemi

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Biyoloji

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

Basit 2D ve 3D hücre kültürlerini mümkün kılmak için tasarlanmış yenilikçi bir 3D baskılı ek parça

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...