This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

Süpernatan hazırlanması 1. Aktivite için test edilecek <ol><li> Steril 0.1 M MgSO 4 tampon (örneğin 1 mg mitomisin C / 2 ml tampon), uygun bir miktarda çözülmesi mitomisin C 0.5 mg / ml stok çözelti hazırlayın. Bir ışık korumalı bir kapta 4 ° C&#39;de saklayın stok (mitomisin C duyarlı ışık). </li><li> King aracı maddesi B (KB) suyu 14 3 ml P. syringae&#39;nin tek bir koloni inoküle. Oda sıcaklığında (200 rpm) çalkalama ile gece boyunca inkübe (21-25 ° C). </li><li> Sonraki sabah, taze KB suyu 3 ml çorba kültürünün 1/100 seyreltin. Oda sıcaklığında çalkalanarak 3-4 saat süreyle inkübe edin. mitomisin C (0.5 ug / ml, son konsantrasyon) eklenir. Oda sıcaklığında çalkalanarak gece boyunca kültür inkübe edin. Not: Mitomisin C ve böylece bakteriyofaj ve bakteriyosinlerin hem üretimine yol açan, hücrenin SOS tepkisine uyarıcı iki iplikçikli DNA kırılmaları neden olur. </li><li> Pelet 1-2 ml mitomisin C, bir tezgah üstü mikrosantrifüjde 5 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüj ile kültürleri uyardı. </li><li> Çıkarın ve 0.22 um gözenek boyutlu filtreden geçirilerek süpernatan geçirilmesiyle veya kloroform ile süpernatant (1 ml süpernatant başına 100 ul kloroform) muamele yoluyla, kültür süpernatantlar sterilize edin. <ol><li> kloroform kullanılarak takdirde, yaklaşık 15 saniye boyunca vorteks karışımı 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 5 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüj karışımı. NOT: Kloroform etkin bir şekilde membranlar çözülmesi ile hücreleri öldürür. filtre sterilizasyonu üzerinde kloroform kullanılarak yararı daha ucuz ve ölçek-up daha kolay olduğunu ise bir anda birçok (&gt; 20) örnekleri işleme. Belirli bir öldürme aktivitesi organik faza bölümleme sonucu kloroform tedaviden sonra kaybolur ihtimali söz konusu olabilir. </li><li> taze, steril bir 1.5 veya 2.0 ml 1 mL pipet kullanılarak, üst sulu faz kaldırmamikrofuge&#39;ye tüp. Alt kloroform tabakasının herhangi aktarmak için dikkatli olun (taşınmasını önlemek için sulu fazın az kaldırmak için daha iyidir). </li><li> Kalıntı kloroform (birkaç saat) buharlaşmaya izin vermek için bir çeker ocak içinde kapağını açıp transfer süpernatant inkübe edin. 4 ° C&#39;de saklayın süpernatantlar. </li></ol></li></ol> Polietilen glikol (PEG) çökelmesiyle Yüksek Moleküler Ağırlıklı Bakterisit Bileşiklerin 2. Ayırma ve konsantre <ol><li> Steril süpernatan, sırasıyla, 1 ve% 10 son konsantrasyonlara NaCl ve PEG 8000 ekleyin. NaCl ve PEG de tamamen çözülür kadar art arda örnek ters çevirin. 1 saat ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta bir buz banyosu içinde inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüj örnekleri. Bir pelet santrifüj tüpünün dibinde oluşturmalıdır. süpernatant süzün ve (örneğin 1/10 ya da orijinal süpernatant vol 1/100 olarak istenilen hacimde peletume) tekrar pipetleme tamponu (10 mM Tris, 10 mM MgSO 4, pH 7.0). </li><li> kloroform, eşit hacimde iki ardışık ayrıştırma kalıntı PEG çıkarın. <ol><li> 10 ila 15 saniye boyunca yeniden süspanse pelet ve vorteks ile kloroform birleştirin, daha sonra 5 dakika için 20,000 x g&#39;de karışımı santrifüj. yeni bir mikrofüj tüpe üst, sulu faz transfer. sulu ve organik faz arasında beyaz bir arayüz görünene kadar, bu çıkarma tekrarlayın (genellikle 2 ekstraksiyon toplam) hazırlandı. Kalıntı kloroform davlumbaz ekstre süpernatanlarından buharlaşmasına izin verin. </li></ol></li></ol> Aktivitesi, kaplama ve test süpernatanların 3. hazırlanması <ol><li> P. syringae soyunun tek bir koloni KB 3 ml duyarlılığı bakımından test edilecek inoküle, oda sıcaklığında çalkalanarak gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Ertesi sabah, geri taze KB içine kültürü 1/100 sulandırmak. Oda temperatu çalkalayarak 3-4 saat bekletinyeniden. </li><li> ultra saf su içinde agar (w / v) bir süspansiyon 0,35-0,7% otoklav ile sterilize su agarı hazırlayın. Not: Yumuşak su agarı bir stok bir mikrodalga fırında eritilir ve tekrar tekrar yeniden kullanılabilen, yeni bindirme her bir deney için hazır olmasına gerek yoktur. su-agar yeniden kullanılır, tamamen mikrodalga aşağıdaki erimiş emin olmak için önemlidir. Değilse, bindirme yorumlanması zor hale getirecek katılaşmadan üzerine grenli doku olacak. Bu durum ortaya çıkarsa, uzun önceden yapılması daha mikrodalgada birkaç dakika agar eritebilir. </li><li> Kullanımdan önce 60 ° C&#39;lik bir su banyosu içinde, erimiş yumuşak agar koruyun. Bir steril kültür tüpüne transfer yumuşak agar 3 ml steril serolojik pipeti kullanarak. Bir eriyik halinde tutmak için su banyosuna kültür tüpü geri dönün. </li><li> İlk (sıcak ama dokunmak sıcak değil hissetmeniz gerekir) erimiş agar soğumasını bekleyin, kaplamayı dökmek için, ancak katılaşmaya izin vermez. </li><li> steril bir başlık olarak, 100 ul inoküleyumuşak ağar ve girdap içine test suşu kültür karıştırın. Bir alt Agar (KB ağan) üzerine dökün, ardından 10-15 saniye elle kültür döndürün. yumuşak agar eşit alt agar kapsar sağlamak için her yöne plaka eğin. NOT: Alt agar testi suşu şiddetle büyür hangi herhangi katılaşmış (% 1.5 ağar) bir araç olabilir. Standart 100 mm çaplı Petri kabı için ~ 20 ml orta eridi kullanın. (Kurutulmadan 4 ° C de muhafaza) veya aynı gün hazırlanabilir taban agar vaktinden birkaç hafta hazırlanabilir. bindirme yapmadan aynı gün hazırlanan ise, 3.4 adıma kadar önce yapmak en iyisidir. </li><li> plaka örtün ve 20-30 dakika katılaşmaya izin verir. sertleşirken plaka rahatsız etmemek için dikkatli olun. </li><li> Bir kez süpernatan 2-5 ul nokta, katılaşmış bindirme üzerinde (bölümleri, yukarıda 1 ve 2, elde edilmektedir). Plakalar, oda sıcaklığında gece boyunca inkübe izin verin. Incelenir ve kaydedilir sonuçları ertesi sabah. Bunu not etyapar ve süpernatan, bir seri seyreltme nokta için yararlı olabilir. Bu araştırmacılar bakteriyofaj ve bakteriyosin takas etkinliği ayırt sağlayacaktır. 5 ya da 1:10 seyreltiler Bu durumda, 1 gerçekleştirmek tavsiye edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriocins+and+their+position+in+the+next+wave+of+conventional+antibiotics.">Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics.</a> Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).</li><li>Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+Predictive+Understanding+of+Earth's+Microbiomes+to+Address+21st+Century+Challenges.">Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges.</a> MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Michel-Briand, Y., Baysse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pyocins+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The pyocins of Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).</li><li>Ghequire, M. G. K., De Mot, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomally+encoded+antibacterial+proteins+and+peptides+from+Pseudomonas.">Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas.</a> FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).</li><li>Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicin+Biology.">Colicin Biology.</a> Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).</li><li>Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+Microbial+Invasions:+Amplification+Allows+Virus+Carriers+to+Invade+More+Rapidly+When+Rare.">Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare.</a> Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).</li><li>Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crystal+Structure+of+the+Lipid+II-degrading+Bacteriocin+Syringacin+M+Suggests+Unexpected+Evolutionary+Relationships+between+Colicin+M-like+Bacteriocins.">The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins.</a> J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).</li><li>Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Co-Option+of+a+Tailed+Bacteriophage+into+a+Killing+Complex+in+Pseudomonas.">Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas.</a> MBio. 6 (4), (2015).</li><li>Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytotoxic+properties+of+Pseudomonas+syringae+pv.+syringae+toxins.">Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).</li><li>Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+Genomics+of+Pseudomonas+syringae.">Ecological Genomics of Pseudomonas syringae.</a> Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).</li><li>Gratia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+Relationships+between+Lysogenic+Bacteria+and+Particles+of+Bacteriophage.">Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage.</a> Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).</li><li>Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diversity+of+Bacteriocins+in+Gram-Positive+Bacteria+.">The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria .</a> Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).</li><li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces.">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada açıklanan yumuşak agar bindirme tekniği yaygın olarak bakteriyofajlar veya bakteriyosinlere ilgilenen araştırmacılar tarafından on yıllar boyunca uygulanmıştır. Bu yaklaşımın temel yararları, basit, ucuz ve yorumlamak nispeten kolay olmasıdır. PEG çökeltme ve seri dilüsyonu ile yumuşak agar kalıbı birleştirerek, antimikrobiyal ajanlar (örneğin bakteriofaj genel tailocin sırasıyla) replikatif olmayan genel düşük moleküler ağırlıklı maddeler genel yüksek ve replikatif maddeler ayrılabilir. Son olarak, farazi bakteriyosin veya profajından loci hedeflenen genetik manipülasyon (silme ve tamamlama) birleştirilmesi sıkıca belirli bir antagonistik bileşiğin kimliğini kurabilir. Biz son zamanlarda yeni bir bakteriyofaj türevi Pseudomonas syringae arasında yaygın bakteriyosin 9 suşları tanımlamak için bu yöntemi kullanmışlardır. Pseudomonas sy için iyi bu protokol çalışmalarında gösterilen büyüme ortamı ve koşullarıringae ve büyük olasılıkla, bu koşullar altında kuvvetli bir şekilde büyümesi için diğer Gram-negatif bakteriler için yeterli olacaktır. Ancak, bu yöntemi kullanarak araştırmacılar kendi sistemi için zamanlama, kültür ortamı, indüksiyon yöntemi ve inkübasyon sıcaklığı optimize etmek isteyeceksiniz. kritik parametreler, logaritmik büyüme fazı sırasında üretim kültürü doğurma, hem de düzgün bir bakteriyel dağılımını sağlamak için yeterli Logaritmik faz kültürü ile yumuşak agar kalıbı tohum, ancak potansiyel temizleme bölgeleri belirsiz olacaktır aşırı derecede kültürü içerir. Orada SOS cevabının bir parçası olarak bağlı olmayan birçok bakteriyosinler, daha çok bu gibi peptid bazlı çekirdek algılama sistemleri, bu şekilde, bir araştırmacı, birkaç farklı indüksiyonu taranması için isteyebilir (15, özellikle Gram-pozitif bakteriyosinlerin) (aracılığıyla indüklenir uyarıcı ortam, ya da üreten bir suşundan uzun inkübasyon) sağlayan besin içeriğinin değiştirilmesi. KullanırkenBu teknik, yumuşak agar katlamalı önce iyice tohumlama gerginlik ilavesinden 55-60 ° C&#39;de eritilir ve muhafaza edilmelidir. Biz (görsel olarak ortaya çıktı gerçi) ve grenli görünüme sahip bir bindirme sonuçlandı yumuşak agar iyice erimiş değildi çeşitli deneyler vardı. grenli kaplama sonuçları hala ancak bu (gözlemlemek daha zor olacaktır zayıf inhibisyon) inhibe gücüne bağlıdır, genellikle yorumlanabilir olabilir. Bu teknik kullanılarak, erimiş agar sıcaklığı tohumlama gerginlik öldürme önlemek için, önceden tohumlama suşu ile aşılama soğumaya için yeterli bir zaman izin verilen zaman son bir, karıştırıcı bir değişken dikkate. Bu sorunu önlemek için, biz yumuşak agar dokunmak, sıcak, sıcak, ama olmadığından emin olun. Bu doğrultuda, biz de erimiş agar ACCLIMATE bir tohumlama kültürü için yetersiz zaman vermek durumunda, bindirme dökülmesinden önce, biz genellikle kötü bakteri g kurtarmak olduğunu gözlemledimBelirli engelleme zor veya imkansız yorumlanması yorumlamak için yapar rowth. Biz vorteks ve bindirme dökme arasındaki inkübasyon 10-15 ek süre bekleyin nedeni budur. Tamamen erimiş halde agar muhafaza arasındaki ticaret-off (sıcak değil daha iyidir) muhtemelen deneme yanılma yoluyla bir araştırmacı tarafından belirlenecek gerekecektir biridir tohumlama zorlanma değil öldürücü (sıcak iyidir). PEG ile çöktürme kademesi kullanılırsa, steril sıvı ortamı kültür yüzey ile aynı şekilde işlenen bir negatif kontrol dahil etmek yararlı olacaktır. Bu aktiviteyi öldürme örnek süpernatant içinde kalan PEG veya kloroform sonucu olmadığını sağlayacaktır. bakteriyofajlar ve bakteriyosinler hem son derece spesifik olma eğilimi de, soyların, belirli bir kombinasyonu ile belirgin bir öldürme aktivitesini karşılaşmaya bir durum değildir. Bu soy spesifik yeniden çeşitli kaynaklanabilirdirencin mekanizmaları, bir test suşu yoksun veya belirli bir bakteriyosin veya bakteriyofaj göre hedefleme için gerekli reseptörünün tanınmayan bir sürümü vardır ya varlık. Alternatif bir yöntem, bakteriyosin tarama yöntemi Kawai ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. Ama mahzurlar ve yaygın 16 kabul edilmemiştir. Özel olarak, bu teknik, külfetli olabilir zaman aralıklarında suyu örnekleri görülmesini gerektirmektedir ve türetilmiş-bakteriyofaj ve bakteriyosin türetilmiş öldürme faaliyetleri arasındaki ayrım izin vermez. Bu tekniğin temel sınırlamaları iyi sağlam büyümek değil (ve böylece kolayca ayırt edilebilir takas bölgeleri olacak eksikliği) ya da sağlam laboratuvar koşullarında üretilmiş olmadığını liman prophages veya bakteriyosinleri organizmalar için uygun değildir olmasıdır. Bu tekniğin adaptasyon programı genişletmek istiyorum, hem çevresel örneklerde üretilen bakteriyosinleri tespit etmek içinve bu tekniğin doğal ortamlarında bakteriyosinlerin rolüne daha fazla fikir kolaylaştırır.

Son zamanlarda, antibiyotiğe dirençli patojenlerin 1,2 mücadelede kullanmak için mikrobiyal ekoloji anlayışı (çeşitli ortamlarda özellikle microbiomes) yanı sıra, yeni antibakteriyel bileşikler derinleştirilmesi önemli ilgi olmuştur. Bu çıkarları arasında bir ara bağlantı teması doğal ortamda bakteri türleri arasında uzlaşmaz etkileşimleri anlamaktır. Bakteri rakipleri 3 antagonize ettiği sayısız yolu vardır. Bakteriyosinler, proteinli, antibakteriyel bileşiklerin çeşitli bir grup, uzun Pseudomonas aeruginosa 4,5 ve Escherichia coli 6, önemli insan patojenleri olmanın en çok çalışılan türlerin ikisi ile, interbacterial antagonizma aracılık rolleri nedeniyle çalışılmıştır. Bakteriyosinlerin ek olarak, indüklenen prophages da soyu önceden 7 kolonize olan bir niş işgal sağlayan anticompetitor maddeler olarak işlev görebilir. Pseudomonas syringae tek bir protein bakteriyosinlerin 8, bakteriyofaj kuyruk türetilmiş bakteriyosinlerin 9 (adlandırılır tailocins), hem de non-protein ikincil metabolitlerin 10 de dahil olmak üzere antimikrobiyal maddeler, bir dizi üretmek için bilinen bir bitki patojendir. Son zamanlarda bu antimikrobiyaller onlar bitki hastalığı 11 kontrol olmak üzere kullanılabilecek nasıl yanı sıra, bu organizmanın ekolojisini nasıl etkilediğini anlamada ilgi olmuştur. bakteriyosinler ve bakteriyofaj hem araştırılması için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, yumuşak agar katlamalı bir tekniktir. Bu yöntem ilk olarak bakteriyofaj 12,13 numaralandırma yardımına 1936 yılında Gratia tarafından tarif edilmiştir. Burada (üç farklı antimikrobiyal maddeler arasında bakteriyofaj ayırt, hedeflenen gen teknolojisi ve polietilen glikol (PEG) çöktürme ile kombinasyon halinde, yumuşak agar katlamalı yönteminin uygulanmasını tarif yüksek molekül ağırlıklı bir bactTek bir bakteri suşu tarafından üretilen eriocin ve düşük molekül ağırlıklı bir bakteriyosin). Bu yaklaşımın faydası o kesinlikle olmak &#39;düşük teknoloji&#39; rağmen, hala yaygın olarak kullanılmaktadır neden olan nispeten basit ve ucuz olmasıdır.

<table><tbody><tr><td>Mitomycin C</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3514</td><td>Carcinogenic. use appropriate PPE (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34854</td><td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol (PEG)</td><td>Amresco</td><td>0159</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological grade agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td></td></tr></tbody></table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

yumuşak agar bindirme tekniği aslında 70 yıl önce geliştirilmiş ve yaygın olarak bakteriyofajların ve bakteriyosinlere, proteinli antibakteriyel ajanlar ile çalışmak da dahil olmak üzere mikrobiyolojik araştırmalar birkaç alanlarda kullanılmaktadır. Bu yaklaşım en az kaynak gereksinimleri ile, nispeten ucuzdur. Bu teknik, (toksik bir bileşik (ler) e potansiyel olarak hassas) bakteriyel test türünün tohumlanır katılaştırılmış yumuşak agar bindirme üzerinde (ve potansiyel olarak toksik bileşik (ler) barındıran) bir verici suşundan süpernatan tespit oluşur. Biz Pseudomonas syringae bir kütüphane intraspecific öldürülmesi için suşlarının taranması için bu tekniği kullanılmıştır. bir çökeltme aşaması ve hedeflenen gen delesyonlu bu yaklaşımı birleştirerek, aynı suşu tarafından üretilen çok sayıda toksik bileşikler ayrıştırılabilir. genellikle bu tekniği kullanarak kurtarılan iki karşıt ajanlar bakteriyofajlar ve bakteriyosinler vardır. Bu iki ajan kullanılarak ayırt edilebiliriki basit ek testler. bakteriyofaj içeren bir süpernatan bir seri seyreltme yapılarak, daha fazla seyreltme ile orantılı az hale tek tek plaklar neden olur, oysa daha yüksek seyreltme üniform daha bulanık olan bir temizleme bölgesine neden olur bakteriyosin ihtiva eden bir yüzer seri dilüsyon. bakteriyosin seyreltme sayesinde taze yumuşak agar çim transfer zaman bakteriyosin bir temizleme bölgesini üretmeyecektir ise, aynı suşu ile tohumlanır taze yumuşak agar bindirme üzerine noktalar Ayrıca, bir bakteriyofaj bir temizleme bölgesi üretir.

yumuşak agar kaplama ve PEG çökeltme kombinasyonu aynı suşu tarafından üretilen farklı antimikrobiyal maddelerin belirlenmesi ve karakterize etmek için kullanılabilir. Şekil 1, aynı türün, bir üçüncü türü tarafından inhibe edilir, P. syringae (A ve B) iki soy gösterir. iki suş, bununla birlikte farklı bakteriosin ile inhibe edilir. suşu A takas bölge gerilme B takas alanı daha büyüktür, keskin kenar sergileyen ve olmayan keskin sınır sergiler. Özellikle A ve B belirgin bakteriyosinlerin duyarlı suşları (bakteriyosin eksikliği) teyit bakteriyosin (eksikliği tailocin) tailocin veya düşük molekül ağırlığına ya da inaktive üreten suş olan genetik manipülasyonlar. Şekil 2, bakteriyofaj aracılı öldürmeyi bir seyreltme serisi karşılaştırarak diğer replikatif olmayan antimikrobiyal ayırt edilebilir olduğunu göstermektedir. Her iki bakteriyosinlere çünküprofajından mitomisin C işlenerek indüklenebilir, bu iki ajan faaliyetleri yakın (aktif faj bol özellikle) birbirine benzer olabilir. bakteriyosin aracılı temizleme gibi plaklar içine çözmek olmaz ise bakteriyofaj aracılı temizleme durumunda, süpernatanın seyreltme bireysel plakların (takas bölgeleri) içine çözecektir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Şekil 1: Aynı suşu tarafından üretilen çoklu antimikrobiyal ajanların fenotipik ayrım. tailocin eksikliği suşunda temizleme eksikliği, ama bakteriyosin eksikliği suşu ile kanıtlandığı gibi, bu ortamda, alternatif bir düşük molekül ağırlıklı bakteriyosin yüksek moleküler ağırlıklı bir bakteriyosin (tailocin), ancak duyarlıdır. Bunun aksine, suş B tailocin hassas olmayan, ancak düşük molekül ağırlıklı bakteriyosin duyarlıdır. tailocin effic olandüşük molekül ağırlıklı bakteriyosinler değil ise iently PEG çökeltme gerilemiştir. WT vahşi tip =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Şekil 2: replikatif olmayan antimikrobiyal ve bakteriyofajlar arasında ayrım. Daha az sayıda olmak bireysel plaklarda bakteriyofaj sonuçları (yüksek titre üst, düşük titre alt) yüksek titre (A) Sulandırma. Bireysel plaklar içine gidermez eşit az açıklıkta bakteriyosinler sonuçları (B) Sulandırma. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds at JoVE.com

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.1K Görüntüleme.  University of Arizona. We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria. 

Video: Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

Aseptik Laboratuvar Teknikleri: Kaplama Yöntemleri

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biyoloji

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to develop practical technologies that couple microscopic cell screening with cell isolation at high purity for downstream genetic analysis. Here, the use of photodegradable poly(ethylene glycol) hydrogels for screening and isolation of bacteria with unique growth phenotypes from heterogeneous cell populations is described. The method relies on encapsulating or entrapping cells with the hydrogel, followed by culture, microscopic screening, then use of a high-resolution light patterning tool for spatiotemporal control of hydrogel degradation and release of selected cells into a solution for retrieval. Applying different light patterns allows for control over the morphology of the extracted cell, and patterns such as rings or crosses can be used to retrieve cells with minimal direct UV light exposure to mitigate DNA damage to the isolates. Moreover, the light patterning tool delivers an adjustable light dose to achieve various degradation and cell release rates. It allows for degradation at high resolution, enabling cell retrieval with micron-scale spatial precision. Here, the use of this material to screen and retrieve bacteria from both bulk hydrogels and microfabricated lab-on-a-chip devices is demonstrated. The method is inexpensive, simple, and can be used for common and emerging applications in microbiology, including isolation of bacterial strains with rare growth profiles from mutant libraries and isolation of bacterial consortia with emergent phenotypes for genomic characterizations.

The use of photodegradable hydrogels to isolate bacterial cells by utilizing a high-resolution light pattering tool is reported. Essential experimental procedures, results, and advantages of the process are reviewed. The method enables rapid and inexpensive isolation of targeted bacteria showing rare or unique functions from heterogeneous communities or populations.

Bakteri Taraması, Seçimi ve İzolasyonu için Fotobozunur Hidrojel Arayüzleri

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Biyomühendislik

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Rekabet Bakteri kaynaklı Antimikrobiyal Etkisi belirlememize

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

Source: Dalecki, A. G., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53925">Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates an assay for screening antimicrobial compounds that efficiently eliminate biofilms using a peg-plate. The methodology monitors the biofilm&#39;s metabolic state after treatment with antimicrobial compounds, facilitating the determination of the minimum biofilm eradication concentration.

Antibakteriyel Ajanların Talınması için Bir Peg Plaka Biyofilm Testi

1. Biofilm Initiation

	Grow a culture of biofilm-producing organisms in a nutrient-rich medium. Inoculate&#160;Staphylococcus aureus&#160;strain Newman ...

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler