Name: triggering cell stress and death using conventional uv laser confocal microscopy
Uploaded: 2017-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy at JoVE.com

This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.

NOT: Hayvan deneylerinde tasarımı, yürütülmesi ve raporlama güncel kılavuzlarda 15 dikkate almak zorundadır. Böyle bir çalışma, yerel hayvan koruma otorite tarafından önceden onaylanmış olmalıdır (bizim durumumuzda, Macquarie Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Komitesi). 1. Montaj ve UV Hücre Ablasyon için Zebra balığı hazırlayın <ol><li> Zebrafish (Danio rerio) floresan proteinleri ifade oluşturun. <ol><li> , Zebra balığı ilgi floresan proteinleri ifade Zebra balığı yumurta tek hücreli aşamaya plazmid enjeksiyonları gerçekleştirmek (başka yerde 16 açıklandığı gibi) ya da floresan transgenik hatları kullanın. Birden fazla hücre tiplerini etiketlemek için, ilgi soruya uygun kurulmuş transgenik hatları geçerek bileşik transgenik zebrafish hatları oluşturmak. Akşamları bir yanlış alt çifti çiftleşme tankının her iki tarafında bir erkek ve bir kadın zebrafish yerleştirin ve ışığın başlangıcı ile bölücü kaldırmak(başka yerde 17 ayrıntılı olarak) Ertesi sabah. 28 ° C zebrafish tutmak ve kurulan protokolleri 17, 18 göre bunları idare. </li><li> plastik çay süzgecinden embriyoları içeren tankı suyun süzme başarılı yumurtlama sonrası embriyolar toplayın. Sistem su ile yumurta durulayın ve bir Petri kabındaki yumurta su içine aktarabilirsiniz. </li><li> döllenmeyi belirlemek için bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Mağaza bir Petri kabındaki yumurta döllenir ve 28 ° C 18 bir inkübatör koyun. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı: Belirli hücre popülasyonlarının etiket bir mikroenjeksiyon gerçekleştirin. Not: Bu, stabil transgenik çizgiler yükseltmek gerek kalmadan, ifade ve protein görünüm için izin veren bir alternatif bir yöntemdir. İlgili protein, toksik olan ve dengeli bir trans üretilmesini engeller, bu yöntem de avantajlıdırgen çizgiler. <ol><li> Başka bir yerde 19, 20, 21 tarif edilen şekilde, zebra balığı embriyoların tek hücreli aşamada plazmid yapıları enjekte edilir. Not: Bu yöntem, ilgilenilen proteinin mozaik ifadesi ile sonuçlanır. İlgili protein seçim promotöründen yapılır Tol2 çevrili (örneğin, 25 ya da MPEG1 26 araya 24, -3mnx1 23 22 islet1) tekrarlar 20 ters. </li></ol></li><li> İstenilen büyüklükte balık yaş. <ol><li> 3 balık yükseltmek - 5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) ve floresan bileşik mikroskop altında koyun. Uygun fluorofor ifade hayvanları Ekran ve parlak etiketli balık seçin. Geç gömmek için yumurta su ile başka bir çanak içine uygun larvaları ayırın(28 ° C inkübatör deposunda) üzerine r. İsteğe bağlı: Embriyolar pigmentasyon oluşumunu inhibe 24 saat sonra döllenme (HPF) bir 0.2 mM 1-fenil-2-thioures (PTU) Ringer çözeltisi içine yerleştirilebilir. toksik ve yan fizyolojik, genetik veya morfolojik etkileri olabilir olarak bakım, PTU ile alınmalıdır. </li><li> Erken gelişim aşamasında çalışmalar için (&lt;2 dpf), elle keskin forseps kullanarak embriyolar dechorionate. enzimatik olarak yumurta su pronase (2 mg / ml) eklenmesi ve 28 ° C &#39;de 10 dakika boyunca inkübe edilerek embriyo sayıda Dechorionate. </li><li> dechorionation kolaylaştırmak için plastik Pasteur pipeti ile periyodik embriyolar geçirin. embriyoların çoğunluğu yumurta su ile onları birkaç kez yıkayarak kendi chorions ortaya çıkmıştır zaman süreci sonlandırmak. </li></ol></li><li> agaroz Zebra balığı gömme için çözümler hazırlayın. <ol><li> 4 g / L MS222 ekleyerek anestezi solüsyonu hazırlayın (tricaine stok çözeltisi, pH 7.0)Yumurta su içeren bir Petri kabı ilave edildi. 50 mg / ml dozu ile, tavsiye edilen bir başlangıç noktası (Şekil 1A) &#39;dir. </li><li> yumurta suda - (% 1.5 0.8) ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler içine bölmeyin düşük erime agaroz bir stok hazırlayın. Önceden ısıtılmış bir ısıtma bloğu içinde bir kısım yerleştirin (38-40 ° C) ve bu ayar sıcaklığına gelmesini sağlar (~ 30 dak; Şekil 1B). </li><li> İsteğe bağlı: uzun vadeli görüntüleme (&gt; 4 saat) için, 35 mm cam alt Petri kabı içinde küçük bir agaroz daire hazırlamak ve (Ek Şekil 1) ayarlamanıza olanak verir. NOT: Bu fazladan adım daha uzun zaman dilimlerinde üzerinde zebrabalıkları ile tüm agaroz damla herhangi bir hareketi önlenmesinde etkili oldu. <ol><li> Bunu yapmak için, cam alt çanak iç çemberin boyunca agaroz yer ~ 300 uL balık yerleştirmek için hangi ortasında küçük bir açıklığı olan bir halka şekilli daire hazırlamak için (adım 1.5.3; Ek Şekil 1) . </li></ol></li></ol></li><li> mikroskopi için agaroz zebrafish monte edin. <ol><li> Seç 1 - ablasyon ön elemeden balık 3 ve anestezi solüsyonu ile bir çanak içine (bir transfer pipet kullanarak) onlara aktararak larvaları uyutmak (adım 1.4.1; Şekil 1C, yaklaşık 5 dakika). NOT: balıklar sığ solungaç hareketi ve azalmış kalp hızı gösterdiğinizde anestezi ve artık dokunmatik uyarılmış kaçış tepkisi sergilerler (teer; başarısızlık uzakta sonra yavaşça yüzmek bir fırça ile kendi kuyruk dokunmadan). balık etik tedavisi için uygun anestezi sağlamak ve floresan ışığa agaroz veya maruz içine transfer edildiği seğirmesi önlemek için. </li><li> Anestezi onaylandıktan sonra (için ~ 30 uL set cut-off 200 mcL ucu ile) ayarlanabilir bir pipet kullanarak bir larva emmek ve ucu dibine çöker edelim. ile sıvı bir damla bırakarak önceden ısıtılmış agaroz (adım 1.4.2) içine larva transferiagaroz içine larva (agaroz girmeden yumurta su miktarını en aza indirmeye çalışın; Şekil 1D). </li><li> agaroz çevrili balık emmek. önceden hazırlanmış cam alt 35 mm çanak içine hızlı bir şekilde dağıtın. </li><li> Tarafında (solda kafa) böylece vücut ve kuyruk düz (Şekil 1E) agaroz içinde hayvan konumlandırmak için bir diseksiyon mikroskobu ve standart bir boya fırçası (uzun astar, boyut 1) kullanın. Birden çok balık ile çalışan, bunlar daha sonra kolayca konfokal mikroskop kullanılarak bulunan, böylece çanak tüm balık hizalayın. NOT: Hızla konumlandırma ve hizalama bu yordamı gerçekleştirmek (agaroz soğuk sıcaklıklara maruz kaldıktan sonra hemen ayarlamak başlar gibi, bazı pratik gerekebilir). </li><li> Agaroz sıkıca ayarlanana kadar 15 dakika - 10 agaroz gömülü balık bırakın. Dikkatle ~ 2 mL yumurta su içeren tricaine (Şekil 1F) ile 35 mm Petri kabı kontör. </li></ol></li></ol> 2. Konfokal Mikroskop ve Görüntüleme parametreleri ayarlama <ol><li> konfokal mikroskop sahnede gömülü larva ile Petri kabı yerleştirin ve (parlak alanını kullanarak) hayvan omurilik dorsal tarafına odaklanmak. Uygun büyütme (40X) ve floresan ayarı altında hayvan inceleyin ve ilgi yapısını görselleştirmek (örneğin, etiketli nöronların veya mikroglial hareketin floresan yoğunluğu) sonraki ablasyonu (Şekil 2) için gerekli tüm görüntüleme parametreleri onaylamak için. Biz rutin zaman atlamalı çalışmalar yapmak 40X objektif kullanın. </li><li> İsteğe bağlı: birkaç saat boyunca zaman atlamalı çalışma gerçekleştirmek için, bu hücrenin ve çevresinin soğukkanlı fizyolojik yanıtı kurmak için ablasyona tek ya da birkaç zaman noktaları öncesinde kayıt tavsiye edilir (örneğin, mikroglial hareket bazal hız kurmak ve hareketliliği). </li><li> yapının kalınlığını belirlemekUV lazer ablasyon ilgi ure. <ol><li> Z-sürücü kullanarak, manuel olarak odaklama ve aşağı tarafından ilgiyle yapısı (örneğin, hücre soma) üst ve alt doğrulayın. Ablasyon edilecek z-düzlemi not edin (örneğin, hücrenin merkezi). NOT: deneyim, bu yöntem parlak etiketli omurilik nöronlar (ablasyon sonrası kolay time-lapse görselleştirme sağlayan yüksek sinyal-gürültü oranı, örneğin, Şekil 4) hedefleyerek en etkili ve orta ablasyon ile hücre soma. Hücre çekirdeği floresan doğru hedefleme ve yüksek ablasyon etkinliğini sağlamak için avantajlı olabilir. </li></ol></li></ol> 3. Lazer Ablasyon Zebra balığı Omurilik Bireysel Hücreler Hedefli gerçekleştirin NOT: Bu ablasyon ve görselleştirme yaklaşımı için, bir konfokal mikroskop (Leica SP5) kullanıldı. hücreye özel dest için 405 nm diyot kullanarak ablasyon işlemiruction yazılımı (Leica Application Suite, v2.7.3.9723) göre ayrıntılı. Ancak, 405-nm lazer ve sıkı bağlamak (photobleaching sonra floresan kurtarma) ya da ağartıcı modülü ile donatılmış herhangi bir geleneksel konfokal mikroskop ancak potansiyel biraz farklı ayarlar parametreleri ve isimleri ile, aynı hücre manipülasyonlar performansını sağlayacaktır. <ol><li> Yazılım menüsü (Şekil 3A, 1 ve 2) üstündeki açılır menüden üzerine tıklayarak sıkı bağlamak sihirbazını başlatın. Lazer ablasyon için spesifik parametreler kurulumunu izin veren farklı adımlarla yeni bir pencere gözlemlemek (Şekil 3B, 3). </li><li> Biçimi, tarama hızı (Şekil 3B, 4) seçerek ve ortalamasını alarak ablasyon yaklaşım görüntü parametreleri belirlemek (Şekil 3B, 5). 400 Hz ve bir çizgi tarama hızında 1024 x 1.024 bir resim biçimi4 ortalama en uygun oldu. NOT: önceki edinme olarak belirlenmiştir (örneğin uyarma veya emisyon parametreleri gibi) spektral algılama değiştirmeye gerek, genellikle vardır. <ol><li> (Adım 2.4 açıklandığı gibi.) Ablasyon z-düzlemi zaten seçili değilse, &quot;Canlı&quot; butonuna basın ve floresan yapı veya kesilip olacak istenen z-düzlemi kadar numune ile odak odakta. </li></ol></li><li> Genel görüntü parametreleri ayarlandıktan sonra, &quot;Bleach&quot; adımı (Şekil 3C, 6) özel ablasyon bileşenlerini kontrol etmek erişir. Not: Lazer yoğunluğunun kombinasyonu (Şekil 3C, 8), tarama hızı ve aşama 3,2 (Şekil 3B, 4 ve 5) &#39;de ayarlanır tekrarlama, sayısı olarak ayarlanmış olan ortalama 3.5 (Şekil 3E adım12), bu nedenle ağartma verimliliği ROI UV lazer toplam bekleme zamanını belirlemek ve edecektir. <ol><li> Ağartma prosedürü (Şekil 3C, 8) için aktive ederek 405-nm lazer Engage. NOT: - Bizim deney düzeneği içinde% 80 yukarıda belirtilen ayarlarla çoğu başarı 60 arasında 405 nm lazer yoğunlukları ile elde edilmiştir. Bu lazer güç çıkışı enstrüman özgüdür ve her konfokal kurulum için farklı olacağını unutmayın. </li><li> Bu nedenle bekleme süresini maksimize tarama alanını azaltarak seçilen ROI ağartma yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için bir seçenek &quot;zoom&quot; (Şekil 3C, 7) kullanın. Alternatif olarak, bu işlem için seçim yazılımı &quot;Bleach noktası&quot; seçeneğini kullanın. </li></ol></li><li> Görüntü elde etme rüzgarda çizim araçlarından birini kullanarak ablasyonu için bir ya da birden fazla ROI&#39;leri (Şekil 3B, 10) seçinizOw (Şekil 3D, 9). 8 mikron - yaklaşık 4 dairesel çizim aracı ile, örneğin, akson tepecik hedefleyin. NOT: ablasyon alan uygulamaya bağlı olarak daha geniş bir alana tek bir pikselin, ayarlanabilir. </li><li> ROI kurduktan sonra, &quot;Zaman Kursu&quot; tuşuna (Şekil 3E, 11) seçin ve ROI (Şekil 3E, 12) ablasyon / taranır döngü sayısını onaylayın. ağartma işleminden sonra hemen önce ve hemen tüm görüntünün bir bakış izin istendiği gibi &quot;Ön Bleach&quot; ve &quot;Post-Bleach&quot; kare seçin. </li><li> Gerekli tüm ablasyon parametreleri, basın &quot;Run Experiment&quot; (Şekil 3E, 13) ve ablasyon etkinliğini izlemek kurduktan sonra. NOT: Bizim sıkı bağlamak kurulumunda, tek bir görüntü öncesi ve uygun lazer e sıkı bağlamak devrinden sonra alınacakxcitation (EGFP ifade eden hücreler için, örneğin, 488 nm eksitasyon). Bunlar öncesi ve sonrası ablasyon resimler seçilen ablasyon parametreleri ne kadar tatmin edici ROI ağartılmış ve ne kadar etkili bir hızlı bir yargıya izin verir. </li><li> Lazer yoğunluğu ayarlanarak tekrarlayın (Şekil 3C, 8), bir tarama hızı ve ortalama (Şekil 3B, 4 ve 5) ve bir durumda tekrar (Şekil 3E, 12) seçilen YG de tamamlanmasından sonra, yüksek floresans yoğunluğunu gösterir sıkı bağlamak çevrimi. </li></ol> 4. &quot;Rescue&quot; veya Bertaraf balık dahil, Takip Prosedürü uygulayın <ol><li> Deney terminali ise, Tricaine aşırı dozda hayvan euthanize. Yumurta suyu çıkarmak ve 10 dakika boyunca anestezi stok solüsyonu ile değiştirin. ötenazi sağlamak için, kalp atışı kesilmesi için mikroskop altında kontrol edin. </li><li> İsteğe bağlı:Deney terminali değilse, ince forseps ve bir fırça ile agaroz dikkatlice balık çıkarın. Taze yumurta suda balık yerleştirin ve 15 dakika boyunca gözlem altında kurtarmak için izin verir. Normal yüzme davranışı dönerse, inkübatör balık dönün. </li><li> Kurumun onaylanan GDO&#39;lu atık akımının göre transgenik hayvanlar imha ediniz. </li></ol>

<ol>
	<li>Becker, T. S., Rinkwitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+genomics+model+for+human+neurological+and+polygenic+disorders.">Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders.</a> Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).</li><li>Wilt, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+light+microscopy+for+neuroscience.">Advances in light microscopy for neuroscience.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).</li><li>Philips, T., Robberecht, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+in+amyotrophic+lateral+sclerosis:+role+of+glial+activation+in+motor+neuron+disease.">Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease.</a> Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).</li><li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).</li><li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish.">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62 (3), 232-240 (2013).</li><li>Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+thrombosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+genetic+screening+method+for+thrombosis.">Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis.</a> Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> J Vis Exp. (54), e2845 (2011).</li><li>Matrone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle:+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair.">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li><li>Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+Ca2++waves+transmit+brain-damage+signals+to+microglia.">Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia.</a> Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).</li><li>Lewis, G. M., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+nerve+transection+and+time-lapse+imaging+of+glial+cell+behaviors+in+live+zebrafish.">Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).</li><li>Villegas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Dev. 7, 19 (2012).</li><li>O'Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+laser+mediated+cell+selective+destruction+by+confocal+microscopy.">UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy.</a> Neural Dev. 3, 11 (2008).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed. , (2000).</li><li>Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+using+transposable+elements.">Transgenic zebrafish using transposable elements.</a> Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cranial+motor+neurons+in+live+transgenic+zebrafish+expressing+green+fluorescent+protein+under+the+control+of+the+islet-1+promoter/enhancer.">Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer.</a> J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).</li><li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+the+hb9/mnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish.">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).</li><li>Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synapses+can+form+in+vivo+by+incorporation+of+initially+aneural+postsynaptic+specializations.">Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations.</a> Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).</li><li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord.">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front. Cell. Neurosci. , (2015).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+--+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish -- emergence of a new model vertebrate.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Lele, Z., Krone, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+in+developmental,+toxicological+and+transgenic+research.">The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research.</a> Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).</li><li>Veldman, M. B., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research.">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).</li><li>Kabashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+and+loss+of+function+of+ALS-related+mutations+of+TARDBP+(TDP-43)+cause+motor+deficits+in+vivo.">Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo.</a> Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).</li><li>Laird, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progranulin+is+neurotrophic+in+vivo+and+protects+against+a+mutant+TDP-43+induced+axonopathy.">Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy.</a> PLoS One. 5 (10), 13368 (2010).</li><li>Lemmens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+mutant+superoxide+dismutase+1+causes+a+motor+axonopathy+in+the+zebrafish.">Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).</li><li>Ramesh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+in+zebrafish+displays+phenotypic+hallmarks+of+motoneuron+disease.">A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease.</a> Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).</li><li>Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+pattern+of+development+of+the+hindbrain+and+spinal+cord+of+the+zebrafish+embryo.">Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo.</a> Development. 103 (1), 49-58 (1988).</li><li>Lewis, K. E., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+circuits:+development+of+the+zebrafish+spinal+cord.">From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord.</a> Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).</li><li>Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell+autonomous+toxicity+in+neurodegenerative+disorders:+ALS+and+beyond.">Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond.</a> J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).</li><li>Philips, T., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Exp Neurol. 262, 111-120 (2014).</li><li>Mazaheri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+BAI1+and+TIM-4+in+the+engulfment+of+dying+neurons+by+microglia.">Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia.</a> Nat Commun. 5, 4046 (2014).</li><li>van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+are+cleared+by+directional+migration+and+elmo1-+dependent+macrophage+engulfment.">Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment.</a> Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).</li><li>Radford, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+established+and+emerging+roles+of+astrocytes+and+microglia+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Front Cell Neurosci. 9, 414 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Lazer Ablasyon Yaklaşımlar Lazer destekli ablasyon teknikleri hücrelerin bireysel ya da küçük gruplar hassas hedefleme sağlar. yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve zebrabalıkları gibi hayvan modellerinde görülen genetik manipülasyonlar ile birleştirme tekniği araştırmacılar sistematik tek bir hücre kaderine ve yaralanma sonrası etkileşimleri çalışma sağlar. Burada tarif edilen UV (405 nm) lazer ile kesip alma protokolü tek tek hücreler stresli veya öldürülmüş seçici (doza bağlı bir şekilde), nöronlar, glia komşu iken, aksonlar zarar görmeden kalır nasıl özetlenmektedir. Biz başarıyla hücre kültürü deneylerinde bu yaklaşımı kullanılmıştır ve burada Zebra balığı omurilik ayrıntılı bir yaklaşım açıklar var. Biz seçici diğer hücreler (Şekil 5, A ve bir ağ içinde tek bir nöron vurgulayarak Zebra balığı omurilikteki bu yaklaşımın uygulanmasını göstermek <strong&gt; B) ya da hemen ve kurtarma olmayan tek bir nöronu öldürerek (Şekil 5, C ve D). Daha önce, bu tür darbeli azot lazer ya da iki-fotonlu lazer sistemleri gibi özel lazer sistemleri, doku hasarı ve motor sinir transection 10, 11, 12, 13 oluşturmak için gereken edildi. Bu lazer sistemleri başarıyla tür arterler ve venler 6 tromboz, akut böbrek hasarı 7, kardiyak hasar 8 gibi hücre hasarına, neden ve kalsiyum dalgaları ve beyin hasarı 9 sonra mikrogliyal tepkisini incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, Soustelle ve arkadaşları Drosophila 14 &lt;içinde epitel hasarı ve glial hücreler ikna etmek için geleneksel bir konfokal kurulum (351 nm ve 364 nm UV lazerler) kullanılır/ Sup&gt;. ALS Anlamak için Zebra balığı Modeller Uygunluk (ve Diğer İnsan Hastalıkları) Balığı, özellikle gelişim çalışmalarında 28, 29, 30 için, yaygın olarak kullanılan bir model organizma olarak. belli sınırlamalar varken, insan hastalığı modellemek ve patojenik moleküler mekanizmaları bir anlayış vermek için kendi potansiyeli çok büyüktür. Balığı modeller MSB&#39;nin çalışma için iyi kurulmuş ve önemli moleküler Insights 31, 32, 33, 34 yol açmıştır. Transgenik zebrafish hatları hızla oluşturulabilir (4-5 ay) ve belirli bir hücre tipi, onları ALS mevcut hayvan modellerinde değerli bir katkı yapmak özelliklerin seçici izleme sağlar. Zebra balığı embriyolar / larva optik şeffaf ve benzersiz bu deneyimlerden teklifbeyin veya kolayca kemirgen modellerinde elde edilen (ya da insanlarda) olamaz omurilik, tek hücre düzeyinde uzun vadeli canlı görüntüleme sağlayan zihinsel avantajları. Bu tür tek hücreli ablasyonu gibi moleküler teknikler ile kombine edildiğinde, bu in vivo kesin moleküler mekanizmaları çalışmak için eşsiz bir deneysel bir platform sağlar. Motor Nöronlar Seçici UV Lazer Ablasyonunu kullanma Hedefli Olabilir Zebra balığı spinal nöronlar doğumdan sonraki 10 saat içinde gelişmeye başlar ve sonra yaklaşık 48 saat 35 36 kurulmuştur. Bu hızlı gelişme, kısa zaman dilimlerinde ve yüksek verimlilik ile bu nöronların görselleştirme sağlar. Motor nöronlar ALS, motor korteks (üst motor nöronlar), beyin sapı ve omurilik (alt motor nöronlar) etkilendiğini, beyin ve kaslar arasında gerekli bağlantıyı sağlamak ve. Bu nöronların kaybı kaçınılmaz mu yol açarSistemik lupus atrofi ve güçsüzlük. Zebrafish omurilikteki motor nöronlar, ayırt edici projeksiyonları tarafından ve -3MNX1 gibi motor-nöron özel promoterlerin kullanımı ile tespit edilebilir. Bu tür çıkıntı nöronların hücre soma Hedefleme zaman (Şekil 4 ve Video 1) üzerinden aksonal projeksiyon boyunca ileriye dejenerasyon saptandı. Spinal motor nöronlarının Tek hücreli çözünürlüklü görüntüleme ayrıca lazer ablasyon (Şekil 4 ve Referans 27 Ek video 3&#39;e bakınız) sonra fosfatidilserin translokasyon ve buna bağlı olarak Annexin V-etiketleme doğruladı. Bizim UV lazer ablasyon yaklaşımı sonra nöronlar ölüyor içinde Annexin V aktivasyonunu rapor olmasına rağmen bu hızlandırılmış süreçte tetiklenir ölüm kaskad tam nörodejenerasyon veya normal hücre homeostazında sırasında meydana nöron ölümünü eşleştiğini, belli olamaz. Bu ablasyon yaklaşımı son derece tekrarlanabilir ikenve özel, farklı gömme stratejileri de UV ablasyon verimliliğini etkileyebilir. bizim deneyim, biz bizim balık gömülü agaroz katmanı en aza indirmek için en başarılı oldu. nedeniyle zayıflama ve meydana gelen saçılma etkileri sonuçta hücre tarafından alınan UV gücünü azaltabilir yumurta su ilave tabaka ile orta gömme kalın tabakalar ışın yolu boyunca. Gelecekte, farklı transjenik balık hatlarının kesiştiği lazerle indüklenen hücre yıkımı için, örneğin glia gibi etkilenmiş hücrelerin, tepkileri (12 saat kadar) anında ve kısa dönem gözlenmesi için izin verir. Örneğin, ALS gibi nörodejeneratif hastalıklarda astrosit olmayan hücreli bağımsız toksisite araştırması spot edilmiş ve büyük ölçüde düzensiz ve ailesel ALS 37, 38 arasında patojenite rol oynar. Bununla birlikte, mekanizma glial toksisite ve seçicilik yatanMotorun doğru nöronlar belirsizliğini koruyor. Biz ve diğerleri son zamanlarda mikroglia tarafından nöronları ölen yutulmasına incelemek için bu yaklaşımın yararlandı ve nöronal kalıntıları 27, 39, 40 temizlenmesini görüntülendi. yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve nöro için işaretleri ile ablasyon tekniği birleştiren gelecekte araştırmacılar tek hücre fonksiyonu ve birbirine pili sistemlerinin anlaşılmasını genişletmek için izin verecektir. In vivo ortamda bu işlemlerin karakterizasyonu gelişim ortamlarda hem de hücresel etkileşimler 3 bozulmuş olabilir MSB, 41 dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların, modellerinde, sadece önemlidir.

Floresan mikroskobu uzun zebrabalıkları MSS transgenlerin, kalkınma 1 özellikle etkileri etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi beyin gelişimi, kas üretimi, ve diğer birçok gelişimsel olayların 2 katılan hücresel süreçlerin detaylı haritalama izin verdi. Tek bir hücrenin ölümünü incelenmesi esas olarak standart görüntüleme işlemleri sırasında seçici hücre ölümünü teşvik teknik zorluklar, daha zor olmuştur. Ancak, tek hücreli çözünürlükte görüntüleme ve yüksek hedefli ablasyon tekniklerinin birleşimi sonucu hücre-hücre etkileşimleri yanı sıra, stres ve yaralanma anında hücresel yanıtları soruşturma sağlar. Bu süreçlerin daha iyi anlaşılması, özellikle, nöron glia etkileşimleri ilerlemesine katkıda bulunduğu gösterilmiştir motor nöron hastalığı (MSB), nörodejeneratif hastalıklar, kritikHastalığın 3. MSB, ya da Amyotrofik lateral skleroz (ALS), beyin sapı, motor korteks ve omurilikteki motor nöronlarını etkileyen yıkıcı bir nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu nöronların kaybı, kas kaybına yol açar ve hastalar 3 içinde ölür - tanı 4 5 yıl. kas lifleri omurilik renkli motor nöron ve kas kasılması kolaylaştıran bir rol oynamaktadır. Bu nöronların bu iletişim veya ölüm başarısızlığı giderek kasları zayıflatır ve yutmak yürümek, konuşmak ve nefes hastanın yeteneğini etkiler. canlı bir hayvanda bir motor nöron ve kısa vadeli sonuçların ölümünü görselleştirme daha normal hücre homeostazında ve hastalıkta rol dinamik süreçleri anlamak için mükemmel bir fırsat sağlar. Balığı nörodejeneratif hastalıklar 1 çalışma için cazip bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. BuBu dış döllenme kısa gelişim süresi, sinir sistemine bir optik erişim ve transgenesis kolaylığı gibi, bu model organizma sunduğu avantajlardan kaynaklanmaktadır. Buna ek olarak, kolay bileşiği, transjenik zebrafish oluşturma yeteneği, farklı hücre tipleri çok markalama stratejileri sağlar. Genetik ablasyon spesifik hücre tipleri oldukça geniş rahatsızlık verir, ancak tek tek hücrelerin 5 hedefleme iyi denetim eksikliği öldürmek için yaklaşımlar. Lazer destekli teknikleri, diğer taraftan, ince geçici ve aralıklı kontrolünün sağlar ve farklı hayvan modellerinde kullanılmıştır. Iken gibi çoğu yaklaşımlar kullanmak özel ekipman, lazer yazıcılarını 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ya da iki-foton set-up&#39;lar 13 darbeliaraştırma grupları son zamanlarda geleneksel konfokal mikroskoplar 14 UV lazer avantajı almış. Burada anlatılan teknik, seçilen motor nöronlarda doza bağlı bir şekilde hücre stres veya ölüme neden UV lazer kaynaklı yaklaşım yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi birleştirir. Bu, hücre kültüründe ve yaşam hayvanlarda başarıyla test edilmiştir yaygın olarak yüklenmiş 405-nm lazer kullanımına dayanır ve bu nöronal ölümünden sonra mikrogliyal açıklık gibi hücresel etkileşimleri, detaylı karakterizasyonu sağlar.

<table><tbody><tr><td>Agarose low melting</td><td>Fisher-Scientific</td><td></td><td>Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8 - 1.5%</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td>0.02%</td></tr><tr><td>Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>GC100F-10 (short)&lt;br/&gt; GC100F-15 (long)</td><td>Pull to a resistance of 2 - 7 M&amp;Omega;</td></tr><tr><td>Egg water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.6 g Instant Ocean sea salt, 4 mL of 1 mg/mL methylene blue in 10 L deionized water</td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Select BioProducts</td><td>Digital block heater (SBD110_)</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection apparatus</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation)</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Leica</td><td></td><td>Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica)</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass bottom dish</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

triggering cell stress and death using conventional uv laser confocal microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Burada tarif edilen yöntem, ticari konfokal mikroskop FRAP modülü kullanılarak zebra balığı omurilikteki motor nöron ablasyon sağlar. Gibi özel promotörlerin kontrolü altında nöronlarda yeşil floresan protein ifade eden bir transjenik zebra balığı hatları - 3mnx1, islet1 veya araya kullanılmıştır. (Örneğin -3mnx1 veya tanıştığımız) motor nöron organizatörü tarafından tahrik GFP ifade hücre gövdeleri, ana akson ve kaslara uzanan çevresel dalları (Şekil 4 ve Video 1) yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlar. 3. Başarılı ablasyon olduğunu adımda açıklanan% 70 ~ bir lazer gücü ve genel ayarlarda 80 sn - 3- 5 gün yaşlı balıkların omurilikte Nöronlar başarıyla 60 genel bir bekleme süresi ile ablasyon edilmiştir floresan ablasyonu sonrası hemen kaybolur zaman eldeve asla (Şekil 5, C ve D) devam eder. (Örneğin 488 nm lazer çizgisi gibi) diğer lazer hatları ile ablasyon girişimleri kalıcı solma neden olmadı, ve floresan kısa zaman dilimleri içinde restore edilmiştir. Önemli olarak, bu yöntem, Annexin V varlığında lizozomal dejenerasyon görünen morfolojik değişiklikler ve ablasyon nöron 27 aksonal blebbing UV ablasyon nöronların apoptotik hücre ölümünün karakteristik özelliklerini ortaya koymuştur. Bu yaklaşımın özgüllük hücresel belirtileri olmadan tek bir hedef sinir dönüştürüldü photoconvertible fluorofor Kaede (yani, UV ışığına maruz kaldıktan sonra yeşilden kırmızıya olan emisyonunu geçer), (Şekil 5 A ve B) kullanılarak yapılan deneyler ile teyit edilir birkaç saat içinde yok. Daha yüksek lazer gücü kullanımı yerine t açarO, kesip çıkarılacak bölgede (Şekil 5, C ve D) yakın hücreler (~ 20 mm) hedeflenen nöron (ölüm olmaksızın) (Resim Fotoçevrim veya floresan yeniden ortaya çıkma) ve Fotoçevrim yok oluşu. Bu lazer kaynaklı ablasyon tekniğinin önemli bir avantajı yaklaşım doz bağımlılığı. Farklı yoğunluklarda ile hedef hücrelere, ince ayar çok katmanlı (8 Şekil 3C), tarama hızı ve hat ortalama (Şekil 3B, 4 ve 5), ROI boyutu ablasyon için lazer gücünü ayarlayarak kullanılabilir (Şekil 3D, 10) ve tekrar (Şekil 3E, 12). Özellikle, bu yaklaşım aynı zamanda, hücrenin ölümünü teşvik bireysel hücrelerin hücresel stresi uygulamak için kullanılabilir. Örneğin, ince ayar olmuşturBir nöronun ölümüne sırasında hücresel süreçleri değerlendirmek için oldukça değerli. Düşük UV lazer yoğunlukları ile ablasyon yapıldı uzun akson projeksiyonlar motor nöronların karakteristik &quot;blebbing&quot; hedefli soma de başlamış ve zamanla akson boyunca (40 devam etmiştir (oluşumu ve hücresel veziküllerin parçalanması), ortaya - 90 dakika; Şekil 4 ; 3D) video 1 Bu ablasyon filmi render. Sonuç olarak, farklı lazer ablasyon parametreler ve dolayısıyla indüklenen hücre stresi ve ölüm zaman sürecini modüle araştırmacılara deney esneklik, yüksek düzeyde sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig1.jpg" /> Şekil 1: canlı görüntüleme için zebrafish gömülmesi. (AF) canlı görüntüleme prosedürü gömülmesi: (A) Tricaine zebra balığı A uyuşturan yumurta suya eklenir<html> 50 mg / L ta başlangıç ​​doz oranı. (B), düşük ısıda eriyen agaroz (0,8-1,5%) hazırlanmış ve 38 kadar ısıtılır - 40 ° C. Bir transfer pipeti kullanarak (C), filtrelenmiş ve seçilen zebra balığı tricaine çözeltisi ile bir çanak içine aktarılmaktadır. Başarılı sedasyon sonra, balık önceden ısıtılmış agaroz (D) aktarılır (sığ solungaç hareketi, kalp hızı, dokunmatik uyarılmış yanıt eksikliği azalma). sonraki seyreltme önlemek için agaroz aktarılır yumurta su miktarını en aza indirin. Bir cam alt 35 mm tabak üzerine zebrafish ihtiva eden - (50 uL ~ 30) (E) agaroz bir damla aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirin ve yavaşça tercih yönelimine zebrafish hizalamak için bir fırça kullanın. Agaroz ayarlamak kadar 15 dakika ve çanak (F) tricaine çözeltinin ~ 2 mL ekleyin - 10 bekleyin.ank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig2.jpg" /> Şekil 2: 3-dpf&#39;e zebrafish omurilik nöronların görselleştirilmesi ve mikroglia. 3 günlük eski transgenik zebrafish omurilikte mikroglia ve nöronlar görselleştirme ifade (A) GFP pozitif nöronlar (islet1: GFP) ve (B) mCherry-pozitif mikroglia (MPEG1: GAL4, UAS: mCherry). (C) birlikte parlak alan görüntü ile nöron ve mikroglia kanalının Kompozit görüntü. (C) şematik uç balık yönünü göstermektedir ve sunulan bölgeyi özetliyor. Ölçek çubuğu 30 mikron =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3: (protokolde tarif edilen, aşama 3), UV lazer ablasyon işleminde Adım. Adımlar konfokal yazılımı (Leica Application Suite) FRAP yazılım modülünü kontrol etmek. (A) UV lazer ablasyon gerçekleştirmek için bir araç olarak sıkı bağlamak modülü başlatılıyor. Lazerin bekleme süresi belirleyecek biçimi, hız ve ortalama alma gibi ablasyon ve diğer sıkı bağlamak ayarları z-düzlemi kurma (B). Lazer yoğunluğu ve ağartma verimliliği maksimize etmek &quot;seçeneği yakınlaş&quot; (C) Kontrol. Ablasyon olacaktır (D) (ROI), bir ya da birden fazla bölgelerin seçimi. Beyazlatma zaman sürecini ayarlanması (E) ağartıcı döngüleri ve ROI de genel lazer bekleme süresini belirler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig3large.jpg" target="_blank">Onu tıklayınız</a><html> E bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54983/54983fig4.jpg" /> Şekil 4: UV ablasyon nöronun anterograd dejenerasyon. UV-ablasyon spinal nöronun nörodejenerasyonun Time-lapse görüntüleme. (AF), tek bir omurga nöronun UV ışınlaması (buluştu: GAL4, UAS: EGFP; A; daire) aksonal parçalanma, ardından (AC) daralma ve zamanla yuvarlama nöronun soma sonuçlandı (CF; ok başları) . Aksonal dejenerasyon soma (ablasyon sitesi) başlayan ve nihayet, soma floresan kayboldu ve tüm akson &quot;blebbing&quot; (DF) gösterene kadar akson uzak ucuna doğru anterograd ilerledi. Ölçek çubukları 20 mikron =. Bu ablasyon 3D render time-lapse film video 1&#39;de gösterilmiştir.es / ftp_upload / 54983 / 54983fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54983/54983fig5.jpg" /> Şekil 5: Bir motor nöron bir photoconvertible flüorofor (Kaede) ile tek hücreli UV ışıması etkisinin doğrulanması. Bir nöron içinde photoconvertible fluorofor Kaede aktivasyonu yoluyla tek hücreli UV ışınlaması Doğrulama. Kaede ile etiketlenmiş nöronların (AD), UV ışınlama. 10 saniye için% 30 bir lazer gücü ile tek bir nöron (daire) (A) Fotoçevrim sadece hedeflenen tek tek nöron (B) (yeşilden kırmızıya) Kaede bir Fotoçevrim yol açtı. dönüştürülmüş hücre birkaç saat hayatta ve bozulma hiçbir görsel işaretler, örneğin blebbing olarak veya yukarı yuvarlama gösterdi unutmayın. Tek bir nöronun Ablasyon (Cı<html> ; daha yüksek bir lazer gücünün (10 s için% 95) olan bir daire), yaklaşık 20 um&#39;lik bir yarıçaptaki nöronların küçük bir sayı olduğu nöron (D hemen yok olması) ve Kaede sonraki Fotoçevrim sonuçlandı. Ölçek çubukları 20 mikron =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983vid1.jpg" /> Video 1: Şekil 4&#39;te gösterildiği UV ablasyon nöronun 3D yüzey render (Imaris). Şekil 4&#39;te gösterilen nöron time-lapse video görselleştirme yazılımı (Imaris, Bitplane) kullanılarak işlenen yüzeydir. Bu anterogradely hücrenin uzak ucuna doğru aksonal parçalanma ardından ablasyon soma küçülme sürecini vurgular.euron_ablation-3D_rendered.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu dosyayı indirmek için tıklayınız. Ek Şekil 1: Uzun süre görüntüleme için isteğe bağlı agaroz döküm. uzun vadeli satın alma sırasında balık ve agaroz hareketini önlemek için bir donut cam alt 35 mm çanak (A) ortasında kenarları boyunca agaroz şeklindeki daire hazırlar. 10 dakika ~ için agaroz set edelim ve agaroz (B) bir damla iç daire içine balık transfer. katıştırma için agaroz miktarını en aza indirmek (balık yönlendirici sonra dışarıya aşırı agaroz fırça) deneyin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy at JoVE.com

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

triggering-cell-stress-death-using-conventional-uv-laser-confocal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Görüntüleme.  Macquarie University. Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Video: Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Kanser Araştırmaları

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Genetik

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first to be activated in these pathways. This group includes caspase-2, -8, and -9, as well as the inflammatory caspases, caspase-1, -4, and -5. The initiator caspases are all activated by dimerization following recruitment to specific multiprotein complexes called activation platforms. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an imaging-based approach where split fluorescent proteins fused to initiator caspases are used to visualize the recruitment of initiator caspases to their activation platforms and the resulting induced proximity. This fluorescence provides a readout of one of the earliest steps required for initiator caspase activation. Using a number of different microscopy-based approaches, this technique can provide quantitative data on the efficiency of caspase activation on a population level as well as the kinetics of caspase activation and the size and number of caspase activating complexes on a per cell basis.

This protocol describes caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC); an imaging-based method that can be used to visualize induced proximity of initiator caspases, which is the first step in their activation.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Biyokimya

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper tissue penetration. However, the existing instrumentation on the market is not readily compatible with upconversion application. Therefore, modifying the commercially available instrument is essential for this research. In this paper, we first illustrate the modifications of a conventional fluorimeter and fluorescence microscope to make them compatible for photon upconversion experiments. We then describe the synthesis of a near-infrared (NIR)-triggered caged protein kinase A catalytic subunit (PKA) immobilized on a UCNP complex. Parameters for microinjection and NIR photoactivation procedures are also reported. After the caged PKA-UCNP is microinjected into REF52 fibroblast cells, the NIR irradiation, which is significantly superior to conventional UV irradiation, efficiently triggers the PKA signal transduction pathway in living cells. In addition, positive and negative control experiments confirm that the PKA-induced pathway leading to the disintegration of stress fibers is specifically triggered by NIR irradiation. Thus, the use of protein-modified UCNP provides an innovative approach to remotely control light-modulated cellular experiments, in which direct exposure to UV light must be avoided.

In this protocol, caged protein kinase A (PKA), a cellular signal transduction bioeffector, was immobilized on a nanoparticle surface, microinjected into the cytosol, and activated by the upconverted UV light from near-infrared (NIR) irradiation, inducing downstream stress fiber disintegration in the cytosol.

Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper ...

Biyomühendislik

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Biyoloji

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation can simultaneously activate multiple cellular molecular signaling pathways. In this protocol, we show that through coupling femtosecond laser into a confocal microscope, cells can be stimulated precisely by the tightly-focused laser. Some molecular processes that can be simultaneously observed are subsequently activated. We present detailed protocols of the photostimulation to activate extracellular signal regulated kinase (ERK) signaling pathway in Hela cells. Mitochondrial flashes of reactive oxygen species (ROS) and other mitochondrial events can be also stimulated if focusing the femtosecond laser pulse on a certain mitochondrial tubular structure. This protocol includes pretreating cells before photostimulation, delivering the photostimulation by a femtosecond laser flash onto the target, and observing/identifying molecular changes afterwards. This protocol represents an all-optical tool for related biological researches.

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Tightly-focused femtosecond laser can deliver precise stimulation to cells by being coupled into a confocal microscopy enabling the real-time observation and photostimulation. The photostimulation can activate cell molecular events including ERK signaling pathway and mitochondrial flashes of reactive oxygen species.

Femtosecond lazer tarafından fotostimulasyon hedef hücrelerde Ekstrelüler-sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon veya mitokondriyal olayları etkinleştirir

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both endogenous and exogenous sources such as metabolic activities or UV radiation. Without DNA repair, the cell's genetic code becomes compromised, undermining the structures and functions of proteins and potentially causing disease. 
Understanding the spatiotemporal dynamics of the different DNA repair pathways in various cell cycle phases is crucial in the field of DNA damage repair. Current fluorescent microscopy techniques provide great tools to measure the recruitment kinetics of different repair proteins after DNA damage induction. DNA synthesis during the S phase of the cell cycle is a peculiar point in cell fate regarding DNA repair. It provides a unique window to screen the entire genome for mistakes. At the same time, DNA synthesis errors also pose a threat to DNA integrity that is not encountered in non-dividing cells. Therefore, DNA repair processes differ significantly in S phase as compared to other phases of the cell cycle, and those differences are poorly understood. 
The following protocol describes the preparation of cell lines and the measurement of dynamics of DNA repair proteins in S phase at locally induced DNA damage sites, using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Tagged PCNA (with mPlum) is used as a cell cycle marker combined with an AcGFP-labeled repair protein of interest (i.e., EXO1b) to measure the DNA damage recruitment in S phase.

This protocol describes a non-invasive method to efficiently identify S-phase cells for downstream microscopy studies, such as measuring DNA repair protein recruitment by laser micro-irradiation.

S Aşamasında DNA İşe Alımını İncelemek için Lazer Mikro Işınlama

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...