Bu çalışma VA Anvers Üniversitesi&#39;nden bir doktora bursu ile desteklenmiştir; KS Flamanca Bilim Vakfı (FWO, 11ZI916N) bir doktora bursu; FWO (G0D0514N) proje hibeleri; uyumlu bir araştırma faaliyeti (GOA) Araştırma hibe, Antwerp Üniversitesi araştırma konseyinden &quot;Yaprak Morfogenez A Sistem Biyolojisi Yaklaşımı&quot;; ve Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar (IUAP VII / 29, MARS), tüm video katkıda GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani ve Hamada AbdElgawad için Belçika Federal Bilim Politikası Dairesi (BELSPO) den &quot;Mısır ve Arabidopsis Kök ve Büyüme Vur&quot; .

NOT: kinematik analiz için aşağıdaki protokol kararlı durum büyüme sırasında yaprakları için geçerlidir. Bu, birkaç gün 6 bir süre boyunca sabit bir yaprak uzama oranı ve hücre boyu ve yaprak genişlemesinin uzamsal desen anlamına gelmektedir. 1. Bitki Büyüme ve Yaprak Uzama Oranı Ölçümleri (LER) <ol><li> kararlı hal büyümesinde bir yaprak ve ilgi gelişimsel aşaması seçin. NOT: Aynı eksen üzerinde ardışık yapraklar üzerinde benzer mekansal kalıpları ima kararlı durum büyüme ve tekrarlayan büyüme arasında bir fark yoktur. Fide büyümesinin ilk aşamalarında, ardışık yaprakları genellikle büyüme bölgesi 7 artan boyutu giderek daha hızlı nedeniyle büyür. Bir kaç yüksek yaprak pozisyonları benzer bir büyüme modeli 8 olabilir, ancak bu soruşturma kapsamında tedavi etkilenebilir geçici aşamasıdır. Çizgiler ve tr karşılaştırmak için önemlidir<html> farklı bir zamanda gelişen olabilir olsa bile, kesinlikle aynı yaprak pozisyonunda eatments. Hatta sabit bir uzama hızında, büyüme hızı profili mutlaka farklı gelişim aşamalarında aynı değildir. Nedenle, tipik olarak ortaya çıkması gün sonra sayısı ile tanımlanan aynı gelişim aşamasında 8, yaprakları analiz etmek önemlidir. </li><li> büyüme odasında kontrollü koşullar altında her tedavi ve genotip için en az 15 bitki büyümesi, monokotlarda yaprak büyüme tam kinematik analizini yapmak. </li><li> Yaprak tamamen (Şekil 1i) genişletilmiş kadar ilgi yaprak (çevreleyen yaprakların ağırşak gelen ortaya çıkması) belirir anda bir cetvel ile günlük yaprak uzunluğu ölçme başlar. Yaprak uzunluğu yaprak ucuna toprak seviyesinden uzunluğunu ifade eder. Bu büyümesini değiştirebilecek beri, kırmak veya yaprak zarar vermemek için dikkatli olun. </li></ol>1 re &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1:. Mısır yapraklarından bir kinematik analiz şematik bakış ilgi yaprak Yaprak Uzama Oranı (LER) hesaplamak için üç gün boyunca bir cetvel ile ölçülür. Bundan sonra, yaprak hasat edilir ve üç santimetre kademeli bir meristem boyutunun saptanması için kullanılmaktadır. Bu DAPI boyama sonra en uzak mitotik rakam tabanından yukarıya doğru uzunluğu ölçülerek yapılır. Proliferatif mitoz ve (B) biçimlendirici mitoz (A) örnekler. ortası ven diğer tarafında yaprak tabanından ilk on santimetre hücre boyu ölçümleri için 1001 santimetre kesimleri kesmek için kullanılmaktadır. Bu ölçümler olgun hücre uzunluğu (l mat) ve meristem (l div) ayrılan hücrelerin uzunluğunu belirlemek için hizmet veren hücre uzunluğu profili oluşturmak için temel sağlar. <el div ve L mer meristem (N mer) hücrelerin sayısını hesaplamak için kullanılır ise m&gt; Ler ve l mat, hücre üretim oranı (P) hesaplanması için kullanılır. Buna karşılık, P ve N mer, hücre döngüsü süresi (T c) tersi olan ortalama hücre bölünmesi oranı (D) hesaplamak için kullanılır. Aynı renkteki oklar bu oklara aşağıdaki parametreyi hesaplamak için kullanılan parametreleri gösterir. Ölçek çubukları 40 mikron =. Roma sayılar protokol açıklanan spesifik deneysel yöntemlere başvurmak için kullanılır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2. Hasat <ol><li> Ilgi gelişim aşamasında (örneğin, çıktıktan sonra, üçüncü gün), en az beş Örnek p tercihpartiden lants hangi kinematik analiz yapmak için. Nihai yaprak uzunluğunu belirlemek için adım 1.3 açıklandığı gibi bitkilerin dinlenme ölçüm devam edin. </li><li> Bitkinin toprak üstü bölümünü kesmek. Köklerine mümkün olduğunca yakın kesim, bozulmamış (Şekil 1ii) meristematik bölümünü tutmak için. </li><li> dış yaprakları itibaren yavaşça teker teker unrolling tüm ilgi yaprak kadar bırakır kaldırın. Gerekirse, yaprakları ayırmak için tabanından birkaç ekstra milimetre kaldırın. Ayrıca faiz (Şekil 1iii) yaprak çevrelediği apeks ve küçük yaprakları temizleyin. </li><li> ortası damarın bir tarafta tabandan başlayan bir 3 cm bölümü kesmek ve 3 ile doldurulmuş bir 1.5 mi test tüpü içinde saklayın: 1 (hacim: hacim) mutlak etanol: asetik asit solüsyonu (DİKKAT: eldiven giymek) de birkaç ay 24 saat kadar, 4 ° C (Şekil 1iv). Bu bölüm daha sonra meristem uzunluğunu belirlemek için kullanılır. </li><li> itibarendamar diğer tarafında, tabandan 11 cm bir bölümü kesilmiş (Şekil 1 V) ve pigmentlerin (Şekil 1 vi) çıkarmak için en az 6 saat boyunca 4 ° C&#39;de mutlak etanol ile doldurulmuş bir 15 ml tüp içine koyun. NOT: Daha sonra, (Tartışma) hücre uzunluğu profilini belirlemek için sadece ilk 10 cm kullanın. </li><li> En az 24 saat (Şekil 1vi) 4 ° C &#39;de temizlik bir tur için mutlak etanol yenileyin. </li><li> Son olarak, saf laktik asit ile mutlak etanol yerine (DİKKAT: eldiven giymek) temizleme ve depolama için, 4 ° C&#39;de 24 saat süre ile ya da daha sonra kullanmak (Şekil 1vi kadar). </li></ol> 3. Meristem Uzunluk Ölçümleri <ol><li> 50 mM sodyum klorür (NaCl), 5 mM etilendiamintetraasetik asit içeren bir yıkama tamponu hazırlayın (EDTA, DİKKAT: eldiven aşınma) ve 10 mM Tris (hidroksimetil) aminometan-hidroklorik asit (Tris-HCI, pH 7). </li><li> bölüm 2.4 ve böylece 3 cm segmenti alın20 dakika (Şekil 1vii) için tampon içinde ak. </li><li> beklerken, buz üzerinde ve karanlıkta tutarak, 1 ug / ml&#39;lik bir 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama solüsyonu hazırlamak için durulama tamponu kullanın. </li><li> DAPI boyama çözeltisi 2-5 dakika boyunca, meristem segmenti yerleştirerek çekirdekleri leke. Buz üzerinde ve koyu (Şekil 1vii) çalışın. </li><li> hızlı bir şekilde mikroskop camına segmenti montaj ve cam kapak ile kaplayıp floresan sinyal olup olmadığını kontrol edin. epidermal hücreler ise altta yatan hücre tabakaları olmamalı, floresan göstermelidir. </li><li> boyama yeterli değilse, bazı ekstra dakika için DAPI boyama çözeltisi geri segmenti koydu. </li><li> , Lekelenmeye durdurmak kapak camı ile bir mikroskop lamı ve kapağında tampon durulama bir damla segmentleri monte etmek için. </li><li> 1.000 Epiderm görselleştirme için izin veren bir 20X büyütmede UV floresan ile donatılmış bir mikroskop kullanınal hücreleri bir kerede. Segmenti boyunca ilerleyin ve proliferatif mitoz (metafaz, anafaz, telofaz ve sitokinez) için bakmak, ama gelişmekte olan stoma (Şekil 1viii) biçimlendirici hücre bölünmesini önlemek 9. En uzak mitotik figür bulunduğu tanımlayın. </li><li> yaprak tabanı ve en distal epidermal mitotik figür arasındaki mesafeyi ölçerek meristem uzunluğunu belirler. Resim çerçevesi tam uzunluğunu ölçmek için bir görüntü analiz yazılımı (örneğin, ImageJ) kullanın. <ol><li> (En uzak mitotik rakam yaprak tabanından) tam meristem uzunluğunu kapsayan kare sayısını ve tam meristem uzunluğu (Şekil 1IX) elde etmek için bir çerçeve uzunluğu çarpın. </li></ol></li></ol> 4. Hücre Uzunluğu Profili <ol><li> laktik asit (adım 2.5) saklanır segmenti alın ve bankta dikkatlice yerleştirin. segmentler zekâ Cut1 cm her (Şekil 1x) 10 segmentlerinde ha neşter. </li><li> laktik asit, küçük bir damla bir mikroskop lamı üzerine birbirini takip eden yaprak segmentleri monte edin. sürekli polar taraf veya eksen dışı tarafı yukarı ya yüz emin olun. Prensip olarak, belirli bir tarafı için bir tercih edilmektedir. </li><li> Yaprak tabanından başlayarak, segmentleri analiz diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik ile donatılmış bir mikroskop kullanarak. sürekli aynı hücre tipini seçmek için bir görüntü analiz yazılımı ile stoma dosyalara doğrudan bitişik dosyaları en az 20 tekrarlı epidermal hücrelerin uzunluğunu ölçün. <ol><li> Segmentler (segment yeterli olurken başına 4 pozisyon) her biri boyunca eşit aralıklı pozisyonlarda bunu ve yaprak (Şekil 1xi) boyunca her ölçüm için ilgili pozisyon yazmak emin olun. </li></ol></li><li> Yerel bir polinom düzeltme s kullanarak yaprak ekseni boyunca her mm ortalama hücre uzunluğunu belirlemekrocedure, R-script (; Ek Dosya 1 Şekil 1xii) uygulanan. NOT: R-komut yumuşatma artan veri bir dizi sağlar. Gerekli düzgünleştirme miktarı sadece yerel gürültü çıkarmak, ama genel eğri etkilememelidir ideal biraz keyfi ve. bir deney içinde tüm örnekler için yumuşatma aynı miktarda kullanmaya dikkat edin. </li><li> bitkiler arasındaki her pozisyonda hücre uzunluğu ortalama ve yaprak ekseni boyunca bir hücre uzunluğu profili oluşturmak için standart hata hesaplayın. </li></ol> Kinematik Parametrelerinin 5. Hesaplamaları (Ek Dosya 2 bakınız) <ol><li> (Adım 1.3 olarak örneğin 24 saat) iki ardışık zaman noktaları arasında yaprak uzunluğu değişimi alarak ve zaman aralığı bölünerek LER hesaplayın. </li><li> Hücreler kendi olgun ce% 95 ulaşır nerede tabanından pozisyon distaline karşılık gelen büyüme bölgesi (L gz) uzunluğunu hesaplamakdüzeltilir hücre uzunluğu profilde ll uzunluğu. <ol><li> Bu konumda (Şekil 2) Aşağıdaki tüm hücre uzunluklarının ortalama düzeltilir hücre uzunluğu profili% 95 üzerindeki her pozisyon için atın. </li><li> Her pozisyonda hesaplanan% 95 hücre uzunluğu ile düzeltilir hücre uzunluklarını (adım 4.4) karşılaştırın. (; Ek Veriler 2&#39;ye bakınız Şekil 2) yaprağın tabanından başlayarak, büyüme bölgesi gerçek hücre uzunluğu aşağıdaki hücre uzunlukları% 95 eşit konumda biter. </li></ol></li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> Şekil 2:. Büyüme bölgesinin son belirleme meristem: yıldız simgesi ile gösterilen pozisyonda, gerçek hücre boyutu% 95&#39;inden daha az, bu konumu, aşağıdaki tüm hücrelerin ortalama hücre boyutuna (kırmızı çizgi) (kırmızı katı hat). Büyüme bölgesi (L gz sonu; ab ile gösterilir% 95 bu pozisyonda (katı mavi çizgi izleyen tüm hücrelerin ortalama hücre boyutu (noktalı mavi çizgi)) gerçek hücre boyutunu eşittir lue yıldızı) yer almaktadır. Küme bölgesi (D), uzama bölgesi (E), ve olgun bölgesi (M). Kesikli oklar, yerel boyut ve yaprak ucu bazal pozisyonlarda hareket yaprak uzak kısmı üzerinde ortalama büyüklüğü% 95 arasında yakınlaşmayı gösteriyor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="3"><li> Büyüme bölgesi (L gz) ve meristem boyutu uzunluğu arasındaki fark olarak uzama bölgesi (L el) uzunluğunu hesaplamak (L mer; 3. adımda belirlenen). </li><li> Olgun bölgede ortalama hücre uzunluğu gibi olgun hücre uzunluğu (l mat) hesaplayın. </li><li> Elde etmek için l mat LER bölünHücre üretim hızı (P). </li><li> N GZ ve N mer arasındaki fark olarak uzama bölgesi (N El) hücre sayısını hesaplayın. Meristem (N mer) hücre sayısı meristem mukabil aralıklarla yer alan hücrelerin toplam sayısına eşittir. Büyüme bölgesi (N gz) hücrelerin sayısı büyüme bölgesine tekabül eden aralıklarda bulunan hücrelerin toplam sayısına eşittir. </li><li> P / N mer olarak ortalama hücre bölünmesi oranı (D) hesaplayın. Hücre döngüsü süresi (T c) ln (2) / D eşittir. </li><li> P N el bölerek uzama bölgesi (T el) zamanı hesaplayın. Bölünme bölgesinde zaman günlüğü 2 (N mer) * T c eşittir. Meristemi ayrılan hücrelerin uzunluğu (l div)meristem sonunda düzeltilir hücre uzunluğu profilinden hücre uzunluğuna eşittir. </li><li> Ln (l mat) -ln (l div)] / T el: ortalama aşağıdaki formül kullanılarak hücre genişleme oranı (R el) hesaplayın. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

mısır yapraklarında tam kinematik analiz yaprak büyüme hücresel bazda tespitine imkan ve verimli örnekleme stratejilerinin tasarımı için izin verir. protokol nispeten basit olmasına rağmen, bazı dikkatli takip kritik adımlarda tavsiye edilir: (1) meristem uzunluğu tayini (adım 3) beri, meristemi zarar vermeden genç, kapalı yaprakları (2.3 adım) ayırmak için önemlidir tam gerektirir meristem mevcut olması. Bazı uygulama önceden gerekebilir. (2) Meristematik uzunluğu tayini mitoz yorumuna dayanm...

Büyüme analizi yaygın çevresel faktörlere genotipi belirlenmiş büyüme farklılıkları ve / veya fenotipik yanıtları tanımlamak için bitki bilim adamları tarafından kullanılan araçlar bir dizi bağlıdır. Onlar büyümenin altında yatan mekanizmaları keşfetmek için boyut ve ağırlık tüm tesisin ölçümleri veya uzuv ve büyüme oranları hesaplamalarını içerir. Organ büyümesi hücresel düzeyde hücre bölünmesi ve genişleme ile belirlenir. Bu nedenle, analiz büyüme bu iki sürecin ölçümü de dahil olmak üzere tüm organ büyümesi 1. farklılıkları anlamanın anahtarıdır. Sonuç olarak, uzman olmayan laboratuvarlar tarafından kullanımı nispeten kolaydır hücresel büyüme parametrelerini belirlemek için uygun bir yöntem olması çok önemlidir. Kinematik analiz zaten Organ büyüme modelleri 2 geliştirilmesi için güçlü bir çerçeve sağlayarak bir yaklaşım olarak kurulmuştur. teknik lineer sistemler için optimize edilmiştir,Bu Arabidopsis thaliana kökleri ve monokotiledon yapraklar gibi, aynı zamanda bu tür çift filizli yaprak 3 arasındaki doğrusal olmayan sistemleri de olabilir. Günümüzde bu yöntem giderek nasıl genetik, hormonal, gelişimsel incelemek için kullanılıyor, ve çevresel faktörler, hücre bölünmesini ve çeşitli organlarda genişleme (Tablo 1) etkilemektedir. Sınırlamalar bitki materyali yüksek miktarda gerektiren teknikler (örneğin, metaboliti organ büyüklüğü ve mekansal organizasyon tarafından empoze edilebilir, ancak Ayrıca, aynı zamanda, bunların altında yatan, biyokimyasal, moleküler ve fizyolojik düzenlemelere (Tablo 2) hücresel süreçleri bağlamak için bir çerçeve sağlar ölçümler, proteomik, vs.). Mısır (Zea mays), yaprak, gibi monokotiledonlu yapraklar, ardışık olarak, olgun ulaşmak meristem ve uzama bölgesi boyunca geçen hücreler, uca doğru yaprak tabanından hareket içinde lineer sistemleri temsil ederbölge. Bu büyüme 4 mekansal desen nicel çalışmalar için ideal bir model sistem yapar. Ayrıca, mısır yaprağı (birkaç santimetre 5 yayılan meristemi ve uzama bölgesi) büyük büyüme bölgeleri ve diğer örgütsel düzeyde çalışmalar için olanaklar sağlar. Bu moleküler teknikler fizyolojik ölçümler, hücre biyolojisi yaklaşımları (Tablo 2), bir dizi aracılığıyla kinematik analizi ile saptanır hücre bölünmesini ve genişleme, kontrol (farazi) düzenleyici mekanizmalardan incelenmesi için izin verir. Burada, monokot yaprakları bir kinematik analizi yapmak için bir protokol sağlar. İlk olarak, biz yaprak ekseni boyunca pozisyon ve nasıl kinematik parametreleri hesaplamak için bir fonksiyonu olarak, hücre bölünmesi ve hücre uzaması hem uygun bir analiz yapmak için nasıl açıklar. İkinci olarak, bu örnekleme dizaynı için bir temel olarak kullanılabilir şeklini göstermektedir. Burada, iki vakayı tartışmak: yüksek çözünürlüklü örneklemesid sırasıyla geliştirilmiş veri yorumlama ve zaman / para tasarrufu sağlayan, örnekleme duruldu. Kinematik Tablo 1. Genel hücre bölünmesi ve çeşitli organlarda genleşme ölçümü için analiz yöntemleri. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> organ </td><td> referans </td></tr><tr><td> çenekli yapraklar </td><td> 16, 20, 21, 22 </td></tr><tr><td> kök uçları </td><td> 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 </td></tr><tr><td> iki çenekli yapraklar </td><td> 21, 30, 31 </td></tr><tr><td> apikal meristemi ateş </td><td> 32 </td></tr></tbody></table> Kinematik Tablo 1. Genel hücre bölünmesi ve çeşitli organlarda genleşme ölçümü için analiz yöntemleri. Moleküler düzeyde düzenlemeye kinematik analizi ile saptanır hücresel süreçleri arasındaki Tablo 2. bağlantı. Çeşitli türlerde ve organlarda biyokimyasal ve moleküler deneyleri sonuçlarına hücresel süreçlerin ölçümü bağlayan çeşitli çalışmalar yapılan atıflar. Eksiloglukan endotransglucosylase (XET), malondialdehit (MDA), siklin bağımlı kinazlar (CDK). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>Pots</td><td>Any</td><td>Any</td><td>We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.</td></tr><tr><td>Planting substrate</td><td>Any</td><td>Any</td><td>We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Any</td><td>Any</td><td>An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.</td></tr><tr><td>Seeds</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Seeds can be ordered from a breeder.</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL falcon tubes</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.</td></tr><tr><td>Gloves</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Latex gloves, which protect against corrosive reagents.</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion</td></tr><tr><td>Lactic acid&amp;nbsp;&gt;98%</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity &amp;ndash; Single exposure, category 3</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidine-2&amp;prime;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.</td></tr><tr><td>Ice</td><td>Any</td><td>NA</td><td>The DAPI solution has to be kept on ice.</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td><td></td><td>Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.</td></tr><tr><td>Microscopic slide</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Image-analysis software</td><td>Axiovision (Release 4.8) from Zeiss</td><td>NA</td><td>The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.</td></tr><tr><td>Microscope equipped with DIC</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td><td></td><td>Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.</td></tr><tr><td>R statistical analysis software</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>NA</td><td>Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>R script</td><td>NA</td><td>NA</td><td>We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.&amp;nbsp; Kernel Smoothing: Chapman &amp;amp; Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.</td></tr></tbody></table>

kinematic analysis of cell division and expansion: quantifying the cellular basis of growth and sampling developmental zones in zea mays leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

Burada, biz onların yaprak büyümesi açısından kuraklık stresi koşullarında (kuraklık,% 34 SWC) tabi sulak bitkiler (kontrol,% 54 toprak su içeriği, (SWC)) ve bitkiler arasındaki bir eşleşme göstermiştir. Tüm bitkiler ° C gündüz / gece, 300-400 μEm -2 sn-1 fotosentetik aktif radyasyon (PAR). Kuraklık 25 ° C / 18, kontrollü şartlar (16 saat gün / 8 saat gece altında bir büyütme odası içinde yetiştirilmiştir doğru SWC ulaştı ve daha...

Watch this Scientific Journal Video about Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves at JoVE.com

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying<em&gt; Zea mays</em&gt; Yapraklar

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

kinematic-analysis-cell-division-expansion-quantifying-cellular-basis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

10.8K Görüntüleme.  University of Antwerp. Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies. 

Video: Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Biyokimya

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Gelişim Biyolojisi

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in indentation mode, we show how to measure an elastic modulus and use it to evaluate cell wall mechanical properties. In addition, we also explain how to evaluate turgor pressure. The main advantages of atomic force microscopy are that it is non-invasive, relatively rapid (5~20 min), and that virtually any type of living plant tissue that is superficially flat can be analyzed without the need for treatment. The resolution can be very good, depending on the tip size and on the number of measurements per unit area. One limitation of this method is that it only gives direct access to the superficial cell layer.

Here, we present atomic force microscopy (AFM), operated as a nano- and micro-indentation tool on cells and tissues. The instrument allows the simultaneous acquisition of 3D surface topography of the sample and its mechanical properties, including cell wall Young's modulus as well as turgor pressure.

Santral hücreleri ve bitki dokularının mekanik özelliklerini ve Turgor basıncını ölçmek için Atomic Force Microkopi kullanımı

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristem'in Mikromekanik Manipülasyonu

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

İpucu büyüyen bitki hücreleri son derece küçük alanlarda uzama yeteneğini çalışmaya mikrosıvısal cihazların geliştirme

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Biyomühendislik

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Biyoloji

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out shape. Following the cell-substrate attachment, the cell forms a thin sheet of lamellipodia emanating from the cell body. In the lamellipodia, globular actin (G-actin) monomers polymerize into a dense filamentous actin (F-actin) meshwork that pushes against the plasma membrane, thereby providing the mechanical forces required for the cell to spread. Notably, the molecular players that control the actin polymerization in lamellipodia are essential for many other cellular processes, such as cell migration and endocytosis. 
Since spreading cells form continuous lamellipodia that span the entire cell periphery and persistently expand outward, cell spreading assays have become an efficient tool to assess the kinetics of lamellipodial protrusions. Although several technical implementations of the cell spreading assay have been developed, a detailed description of the workflow, which would include both a step-by-step protocol and computational tools for data analysis, is currently lacking. Here, we describe the experimental procedures of the cell spreading assay and present an open-source tool for quantitative and unbiased analysis of cell edge dynamics during spreading. When combined with pharmacological manipulations and/or gene-silencing techniques, this protocol is amenable to a large-scale screen of molecular players regulating lamellipodial protrusions.

In this protocol, we present the experimental procedures of a cell spreading assay that is based on live-cell microscopy. We provide an open-source computational tool for the unbiased segmentation of fluorescently labeled cells and quantitative analysis of lamellipodia dynamics during cell spreading.

Hücre Yayma Sırasında Hücre Kenarı Dinamiklerinin Nicel Analizi

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler