We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.

Hayvanlar: Los Angeles, California Üniversitesi (UCLA) yetiştirilen Yabani tip C57Bl / 6J fareler. 17 haftalık ve erkek ve dişi fareler dahil - Bütün hayvanlar 11 arasında idi. Tüm fareler grubu yerleştirilmiştir, yiyecek ve su ad libitum 12:12 aydınlık / karanlık döngüsünde tutuldu. Bütün deneyler Oftalmik ve Vision Research Hayvanların Kullanım UCLA ve Vizyon Araştırma Derneği ve Oftalmoloji Tablosu kurumsal kurallarına uygun olarak yapıldı. NOT: Tüm ilaçlar ve enjekte ajanlar Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) notu bulunmaktadır. 1. Cerrahi Hazırlık <ol><li> tuzlu karışımı 100 mg / kg ketamin ve 8 mg / kg ksilazin ve intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi. Fare hiçbir ayak tutam veya kornea dokunmatik refleksleri böyle bir derinliğe anestezi uygulayınız. </li><li> Bir dolaşan su pedi ile 37.0 ° C vücut ısısını korumak. </li><li> % 2.5 fenilefrin göz d öğrencileri dilateROPS ve trim bıyık görselleştirme kolaylaştırmak için. Bıyık nedenle, bıyık o gözle bloklar açık erişim, değil bıyık tabanına sadece bir bölümünü kaldırmak gerekir kırparak, fare önemli duyusal girdi sağlamaktadır. Bizim tecrübelerimize göre, fareler bu işlemden sonra normale iyileşme göstermektedir. Metilselüloz göz uygulayın kuruluğunu önlemek ve anestezi kaynaklı geçici katarakt 13 en aza indirmek için düşer. </li><li> Cerrahi (yani, betadin ve etanol veya sıcak boncuk) öncesinde aletleri sterilize. </li><li> Görselleştirme yapılacaksa, steril bir ortamda seyreltilmiş fluoresein (% 0.01,% 0.9 tuz kullanılarak) hazırlayın (örneğin, biyo-güvenlik kabini) (aşağıdaki bölüm 3). </li></ol> 2. Enjeksiyon Sitesi Hazırlama <ol><li> Uygun enjeksiyon hacmi (örneğin, 0,3-1,0 ul) ile bir şırınga (örneğin, 5 ul şırınga) hazırlayın. </li><li> Göz di açıkça görülebilir yukarı bakacak ve böylece fare yerleştirinmikroskop ssecting. </li><li> Yavaşça ince uçlu forseps ile zamansal konjonktivayı tutam. kavisli Vannas makas kullanılarak yaklaşık 90 derecelik bir çember boyunca bir kesi olun. </li><li> altta yatan Tenon kapsülü ile adımı yineleyin 2.3. </li><li> burundan dünya dönerken ince uçlu forseps ile çevreleyen bağ dokusu rezeke. optik sinir yaklaşık 0,5 mm zamansal enjeksiyon yerinde doğru çalışın. retro-orbital sinüs bozmamak için büyük özen kullanın. </li></ol> 3. Sklerotomi ve Subretinal Enjeksiyon NOT: Bu prosedür öğrenme sırasında% 0.9 Saline% 0.01 floresein enjeksiyon görselleştirme yardımcı olmak için kullanılması tavsiye edilir. floresein topografik dağılımı etkili bir fundus görüntüleme (aşağıda bölüm 4&#39;e bakınız) ile belgelenebilir. <ol><li> yavaşça 22.5 derecelik oftalmik bıçak ile Göz yuvası çizilerek enjeksiyon yerinde küçük bir skleral kesi yapmak. Bu kesi shouSadece iğne ucu sklera geçmesine izin verecek kadar büyük olması ld. </li><li> 5 açılı eğimli 33 G iğne (takın -. Konik bakan ve retinaya açılı paralel olan sklerotomili içine 10 ° (istenilen hacim enjekte örneğin, öğrenme amaçlı% 0.01 Floresein 0.3 1.0 ul). Not: iyice her enjeksiyondan önce müsait bir çözücü ve DI suyla art arda yıkama ile temizlenerek şırınga sterilliğini korumak. </li><li> İğneyi hareket ettirmeden ve hatta basınçla pistonu yavaşça (over ~ 3 saniye) basın. NOT: İğne subretinal alan olduğunda Medyumu ederken, hafif bir direnç hissedilecektir. İğne sklera veya RPE nüfuz etmediği takdirde iğne retina ve yüksek direnç deler eğer minimum dirençle hiçbir olacaktır. </li><li> geri akışı en aza indirmek için iğne çekilerek önce birkaç saniye bekleyin. </li><li> Steril tamponlu tuzlu su ile göz durulayın ve göz h sağlamakgeri normal pozisyonuna döndürülmüş olarak. </li></ol> OCT ve Fundus Görüntüleme tarafından Retina Dekolmanı 4. Değerlendirme <ol><li> enjeksiyondan hemen kalitesini değerlendirmek için enjeksiyondan sonra ve uygun zamanda Ekim görüntüleme gerçekleştirmek retinal yapıyı değerlendirmek için gerekli post-enjeksiyon işaret ediyor. Not: Benzer çalışmalarda OKT kullanımına örnekler, daha önce 7,14 tarif edilmiştir. <ol><li> Ayarlayın ve enjeksiyon siteyi hedef Ekim görüntüyü aynı hizaya getirin. enjeksiyon yeri orta hat ve optik sinir başı temporal 0,5 mm olmalıdır. optimal merkezli dekolmanı çerçevesinin dışında ise gerekli ya da değil tekrarlayın. </li></ol></li><li> Retina dekolmanı görselleştirmek ve en-yüz fundus görüntüleme 7,14 ile enjeksiyon alanını boya. Not:, OCT görüntüleme sistemi mevcut değilse, uygulama için bir vektör ile floresan bir miktar enjeksiyon floresein anjiyo gerçekleştiren bir fundus kamera ile görselleştirme sağlayacakAynı uyarma dalga boyları kullanarak ve filtreler engelleme grafisi. hiper-floresan lokalize alanlar damarsal altında görünecek ve subretinal alan doğru hedeflenmiş ise damarsal keskin ve belirgin sınırları olacaktır. enjeksiyondan bleb kenarı hipo floresan hiper geçiş ile sınırları çizilmiş olacaktır. Çeşitli enstrümanlar fare için bu yeteneği sağlar; Burada kullanılan enstrümantasyon başka yerde 14 tarif edilmiştir. </li></ol> 5. Post-operatif Bakım <ol><li> Enjekte gözün kornea yüzeyine üçlü antibiyotik göz krem ​​kalın bir kat uygulayın. </li><li> kurtarma için temiz yalnız kafeslerde fareler yerleştirin. Onlar tamamen iyileşti kadar ameliyat geçiren fareler bir araya etmeyin. </li><li> Anestezi kurtarma sırasında solunum ve sıcaklığını izlemek. Onlar sternum yatma koruyabilirsiniz kadar hayvan izleyin. </li><li> Ek uygun post-operatif izleme gerçekleştirmekve ameliyat sonrası ağrı tedavisi için karprofen bir deri altı enjeksiyon (5 mg / kg) de dahil olmak üzere tedavi. </li></ol> Elektroretinografi tarafından Retina Fonksiyonun 6. Değerlendirmesi (ERG) <ol><li> ERG analiz ön enjeksiyon gerçekleştirmek ve uygun zamanlarda retina fonksiyonlarını değerlendirmek için gerektiği gibi enjeksiyon sonrası. Enjeksiyon subretinal boşluğa yapılmış ise, retina dekolmanı 72 saat içinde çözmelidir. <ol><li> Daha önce 14,15 açıklandığı gibi önce ve enjeksiyondan sonra retina fonksiyonlarını değerlendirmek için standart ERG tekniklerini kullanın. </li></ol></li></ol> 7. 3D İmar ve Bleb Hacim Ölçümü NOT: yüksek kontrast görüş çerçevesinde tüm dekolmanı kapsayan birlikte Ekim taramaları kullanım için optimum olan. ImageJ / Fiji 17,18 ve Imaris kullanıldı, ancak diğer yazılım kullanılabilir. <ol><li> ilgi b-tarama İhracat, ImageJ / Fiji ve kırpma (Görüntü&gt; Kırpma) Ekim sc bölümü ithalatBir dikdörtgen seçim aracı kullanılarak modellenmiştir edilecek. <ol><li> Kontrast ayarlayın (Görüntü&gt;&gt; Parlaklık / Kontrast ayarlama) ve bir çizgi ile iki bölüm bağlayarak herhangi bir eksik sınırları betimlemek. </li><li> fotoreseptör tabakası RPE yayılan çizgi aracı (tutma vardiya) ile düz bir çizgi çizin. Tedbir (Ölçü&gt; Analiz) çizgisinin uzunluğu adımı 7.8 için maksimum dekolmanı boyutu elde etmek için. </li></ol></li><li> İthalat &quot;Gray RGB&quot; eklentisi ve MATLAB Compiler Runtime kullanılarak (Malzeme Tablo bakınız) 3D-rekonstrüksiyon yazılımı çerçeveleri kırpılmış. </li><li> Ekim tarama (x, y, z) kalibrasyon parametrelerini kullanarak (Görüntü Özellikleri altında) voksel boyutunu ayarlayın. </li><li> dördüncü kanal oluşturmak için, her kanala eşit ağırlık ile (Görüntü Özellikleri altında) &quot;RGB Gray&quot; eklentisi, yürütün. Orijinal Kırmızı-Yeşil-Mavi kanalları silin. </li><li> kontrast değişikliği kullanarak gri kanal ters çevirin. Mağaza Görüntü. </li><li> &quot;Bir Ekle&#39;yi tıklayınew yüzeyi &quot;3D-Görünüm sekmesinde düğme ve yüzey yaratma güdümlü 4 adım süreci başlar. <ol><li> Yüzey seviye detay (adım 4 1) ayarlayın. NOT: Bizim tecrübelerimize göre 12,0 8.0 en etkili menzili oldu. </li><li> (Arka plan seçimi altında) maksimum küre boyutunu 7.1.2 ölçülen maksimum dekolmanı boyutu biraz daha az olarak ayarlayın. gri kanal inversiyon (adım 4 2) yüzey oluşturmak ve geri. </li><li> retinanın dış olumsuz alanlarda ve dekolmanı yüzey teması (4 adım 3) gelmiyor bu yüzden maksimum değere eşik ayarlayın. </li><li> Voksellerden sayısına filtre tipini ayarlayın ve büyüklüğüne göre dekolmanı sitede negatif boşluk izole. yüzeyi (adım 4 4) bitirin. NOT: sıyrılma yüzeyinin hacmi istatistikleri sekmesinde hacim altında bulunur. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Garoon, R. B., Stout, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+ocular+gene+therapy+and+advances+in+treatment+of+inherited+retinal+diseases+and+exudative+macular+degeneration.">Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration.</a> Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).</li><li>Pierce, E. A., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Status+of+RPE65+Gene+Therapy+Trials:+Safety+and+Efficacy.">The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).</li><li>Tolmachova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+Rab+escort+protein+1+following+AAV2-mediated+gene+delivery+in+the+retina+of+choroideremia+mice+and+human+cells+ex+vivo.">Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo.</a> J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).</li><li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque.">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li><li>Ye, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+Biodistribution+Evaluation+in+Cynomolgus+Macaques+of+rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3,+a+Recombinant+AAV+Vector+for+Treatment+of+Achromatopsia.">Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Corneal+Subretinal+Injection+in+Mice+and+Its+Effect+on+the+Function+and+Morphology+of+the+Retina.">Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina.</a> PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).</li><li>Engelhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+retinal+pigment+epithelium+cells.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells.</a> Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).</li><li>Lambert, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+AAV2.COMP-Ang1+suppresses+choroidal+neovascularization+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+a+murine+model+of+age-related+macular+degeneration.">Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration.</a> Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).</li><li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice.">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).</li><li>Nusinowitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+visual+function+in+the+rd12+mouse+model+of+Leber+Congenital+Amarousis+(LCA)+after+gene+replacement+therapy+to+restore+retinal+function.">Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function.</a> Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).</li><li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+human+retinal+progenitor+cells+under+Cyclosporin+A+treatment.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment.</a> Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).</li><li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber's+congenital+amaurosis.">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li><li>Ridder, W. . 3. r. d., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+cataract+development+in+anesthetized+mice.">Causes of cataract development in anesthetized mice.</a> Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).</li><li>Ridder, W. H. 3. r. d., Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visual+evoked+potential+in+the+mouse--origins+and+response+characteristics.">The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics.</a> Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).</li><li>Matynia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+are+the+primary+but+not+exclusive+circuit+for+light+aversion.">Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion.</a> Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li></ol>

None of the authors have any commercial disclosures.

Subretinal enjeksiyonları viral vektörlerin teslimat için tercih edilen yöntem ve fotoreseptör ve temel araştırma ve klinik tedavisinde hem de RPE işlemek için hücre kökenli tedavisi kaynaklanıyor. hastalarda, subretinal enjeksiyonları genellikle doğrudan görselleştirme ile iğne ile, pars plana bir ön sklerotomili retinanın bir arka çekirdek vitrektomi ve penetrasyon yapılır. Göz Psödofakik zaten olmadıkça katarakt oluşumu erken gerçekleşmesi için en vitrektomi prosedürleri gibi, yaygınd?...

Subretinal enjeksiyonları fotoreseptör ve altta yatan RPE 1,2 üzerindeki etkilerini incelemek için farelerin retina hücresel ve viral ajanlar sunan birincil yolu vardır. Farelerde en subretinal enjeksiyon protokolleri transkorneal veya ekvatora bir transkleral enjeksiyon sitesi anterior (Şekil 1) kullanın. Bu yaklaşım nicklemek ve lens bileşke bulanıklığı, retinada ve iris, retina kanaması, önemli retina dekolmanı ve kalıcı subretinal ödem 3-9 camsı, penetrasyon bütünlüğünün bozulması içeren doğal kollateral hasara neden olabilir. Deneysel manipülasyonlar terapötik girişimlerin 3,7,10,11 etkilerini değerlendirmek amacıyla bu etkileri aşmak gerekir. Bu çalışma, bu komplikasyonları önler posterior transkleral enjeksiyon yöntemi ayrıntılı bir açıklamasını ve doğrulama sağlayan travmayı en aza indirir ve alt hedefleme yüksek bir başarı oranına sahiptirretina alanı. Farelerde subretinal alan hedefleme Enjeksiyonlar genellikle gerçekleştirmek çok zordur ve çoğu araştırmacı vektör yanlış bir konuma teslim edilir veya önemli retina hasarı tam retina dekolmanı 6 örneğin, var olduğu başarısız girişimleri yüksek frekanslı karşılaşıyoruz. Çünkü enjeksiyon komplikasyonlar analize dahil gözlerin sayısı genellikle fare çalışmalarında rapor değil, ama bizim kendi deneyim ve diğer araştırmacılar ile tartışmaya başarısız enjeksiyon sayısı% 50 kadar yüksek olabilir ve deneyime bağlı olarak değişebilir ve enjeksiyonları gerçekleştiren araştırmacının yetenekleri. Enjeksiyon başarısı genellikle direkt fundus görüntüleme ve / veya optik koherens tomografi (OKT) 7,9 değerlendirilir. Farelerde subretinal enjeksiyon için yüksek başarı oranları ile kolayca hakim yöntem deneme hızlandırmak ve tre klinik öncesi çalışmalarda maliyetini düşürebilirABD&#39;de körlüğün başlıca nedenleridir retina hastalıkları için atments. Arka, burada açıklanan transkleral subretinal enjeksiyon tekniği klinik ve klinik öncesi protokoller 9,12 bir uyarlamasıdır. enjekte edilen farelerde yapılan girişimsel olmayan tanı değerlendirmeler hafif ve son derece lokalize hasara göstermek ve ek teminat objektif, retina ve RPE hasarı yoksundur. böylece bu çalışmalarla ilgili maliyetlerin azaltılması, - (% 90 ya da daha iyi 80) Ayrıca, nispeten daha az uygulama ile, bir deneyci yüksek başarı oranı ile bu sonuçlar elde edebilirsiniz. Bu prosedür klinik öncesi çalışmalarda fotoreseptör ve / veya RPE, hücresel viral veya farmakolojik tedavi edici girişimler sunmak için ve kolayca deneysel müdahaleleri değerlendirmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Hamilton Model 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Syringe x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Needle 33 G, 1.0&quot;, 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Needles x 6</td></tr><tr><td>Vannas Curved Scissors</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>1347</td><td>5 mm Blade</td></tr><tr><td>22.5 Degree Microsurgery Knife</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>91204</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-609-02</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NDC 61311-482-10</td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>Fluorescein 10% AK-Fluor</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>0.9% Saline USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-50</td><td>0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Antibiotic Ointment</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>Water Circulating Pump</td><td>Gaymar</td><td>TP-500 T/Pump&amp;nbsp;</td><td>P/N 07999-000</td></tr><tr><td>sd-OCT</td><td>Bioptigen</td><td>R-Series</td><td>Commercial</td></tr><tr><td>Fundus Camera</td><td>Phoenix Research Laboratories</td><td>MICRON III</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Type 3</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>5385-3SU</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Phenylephrine</td><td>Paragon BioTeck</td><td>NDC 42702-102-15</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>IMARIS8</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Version 8.1.2</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>V1.8.0_77</td></tr><tr><td>Hypromellose&amp;nbsp;2.5%</td><td>Goniovisc</td><td>AX0401</td><td>Methylcellulose</td></tr><tr><td>Eye Drops (Rinse)</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td></td><td>Saline Solution</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Fostec</td><td>P/N 20520</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

an alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach

Subretinal enjeksiyonları başarıyla doğrudan fotoreseptör maruz kalma ve retina pigment epitel (RPE) sahiptir interfotoreseptör / subretinal bölmeye proteinlerin terapötik girişimlerin viral ajanlar, ve hücreleri sunmak için insanlar ve kemirgenler hem de kullanılmıştır. plazminojen subretinal enjeksiyonları yanı sıra son klinik öncesi ve klinik çalışmalarda ileri retina hastalığı olan bireylerin viral vektörlerin ve kök hücreleri sunma güvenliğini ve / veya etkinliğini göstermiştir. retina hastalıkları, özellikle de kalıtsal retinal distrofilerin fare modelleri, bu tedavilerin test etmek için gereklidir. Kemirgenlerde en yaygın enjeksiyonundan retinaya bir anterior küçük transkorneal ya transkleral kesiler kullanmaktır. Bu yaklaşımla, enjeksiyon iğnesi altında yatan RPE ve yerleştirilmesine bozarak nörosensöriyel retina nüfuz kolayca nick lens, lens kesafeti ve non-invaziv IMAGI bozulmasını nedenng. Bir transkleral yoluyla subretinal alan erişme, posterior yaklaşım bu sorunları önler: iğne retina penetrasyon olmadan, optik sinir yaklaşık 0.5 mm sklerasına geçer ve vitrözü kesintiye önler. Tali hasar odak sklerotomili ve geçici, seröz retina dekolmanı etkileri ile bağlantılı olduğu sınırlıdır. yöntemin basitliği, göz yaralanması en aza indirir hızlı retina yatıştırıldı ve iyileşme sağlar ve düşük başarısızlık oranı vardır. retina ve RPE minimal hasar etkinliğinin net değerlendirme ve terapötik ajanların kendilerini doğrudan etkileri için izin verir. Bu yazıda, viral vektörler, farmakolojik ajanlar hedef yüksek etkinlik, en az hasar ve hızlı bir iyileşme ile farelerde retina altı alana hücreleri ya da uyarılmış pluripotent kök (IPS) kök hücreler için kullanılabilecek yeni bir retina altı enjeksiyon tekniği tarif etmektedir.

yaklaşım transkleral subretinal enjeksiyonları 0.3 ul (n = 18), 0.5 ul (n = 8) ve% 0.01 fluoresein 1.0 ul (n = 5) enjekte 16 vahşi tip farelerden 31 sağlıklı gözler üzerinde gerçekleştirilmiştir posterior. Bir göz nedeniyle yapısal ve fonksiyonel analiz engelleyen önceden varolan korneal opasite enjeksiyon çıkarılmıştır. Her enjekte göz bu raporda yer almaktadır. Hiçbir istenmeyen retina dekolmanı, vitreus içine retinada veya sızıntı delikler tespit edildi ne...

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach at JoVE.com

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Subretinal Space erişim için bir alternatif ve Onaylı Enjeksiyon Yöntemi<i&gt; yoluyla</i&gt; Bir transkleral Posterior Yaklaşım

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

an-alternative-validated-injection-method-for-accessing-subretinal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

13.1K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Video: An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Tıp

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Fareler Retina Pigment Epitel Gen Tedavisi için Viral Vektörler Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyon

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Nörobilim

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Tavşanlarda Subretinal Cerrahi Adım Protokolle Bir Adım

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Dejeneratif Retina Hastalıkları için İnsan Dışı Primat Modelinde Retina Pigment Epitel Transplantasyonu

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

Retinal Dejenerasyon Fare Modelinde Subretinal Greftlerin Transpupiller Kılavuzluğunda Transskleral Transplantasyonu

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Canlandırıcı Görme: Retina Dejenerasyonu için Kök Hücre Tedavisi

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

Yazar Spotlight: Görme Restorasyonunu İlerletmek - Retina Hastalıkları için Kök Hücre Bazlı Tedavi 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Subretinal Space erişim için bir alternatif ve Onaylı Enjeksiyon Yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

Fareler Retina Pigment Epitel Gen Tedavisi için Viral Vektörler Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyon

Tavşanlarda Subretinal Cerrahi Adım Protokolle Bir Adım

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Dejeneratif Retina Hastalıkları için İnsan Dışı Primat Modelinde Retina Pigment Epitel Transplantasyonu

Retinal Dejenerasyon Fare Modelinde Subretinal Greftlerin Transpupiller Kılavuzluğunda Transskleral Transplantasyonu

Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi

Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi

Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi