Name: rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

NOT: Bu protokol, tarif edilen reaktifler ve miktarlar test edilir Arabidopsis satıra ifade edilmiştir ve bu genotip altı kopya kuyu neden olur. Birden fazla satır analiz ederken satır sayısı ile malzeme çarpın analiz edilecek. (Ek çizgilerinden Örnek sonuçlar daha sonra verilecektir rağmen) videoda, vahşi tür Arabidopsis sirkadiyen saat değişken sıra ZTL karşılaştırılacaktır. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Enzim çözeltisi </td><td></td></tr><tr><td> selülaz </td><td> % 0.5 (ağırlık / hacim) </td></tr><tr><td> pektinaz R10 </td><td> % 0.25 (ağ / hac) </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Sığır serum albumini </td><td> % 0.1 (ağırlık / hacim) </td></tr><tr><td> MES, pH 5.7 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5 çözümü </td><td></td></tr><tr><td> NaCI </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5.7 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMG çözümü </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5.7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG çözeltisi </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> % 40 (w / v) </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Görüntüleme çözümü </td><td></td></tr><tr><td> W5 çözümü </td><td> nihai hacme </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> % 5 (h / h) </td></tr><tr><td> luciferin </td><td> 1.2 mM </td></tr><tr><td> ampisilin </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tablo 1: çözümlerin listesi. Malzeme ve Tamponlar hazırlanması 1. <ol><li> bitki Malzemeleri <ol><li> Arabidopsis Col tutmak -0 su içinde tohumları 1.5 ml bir tüp içinde, 4 ° C&#39;de karanlıkta dört gün. Bir tencerede toprak üzerine tohum pipet ve 7 gün süreyle 21 ° C&#39;de uzun gün koşullarında (16 saat ışık 8 saat karanlık) transfer. yüksek nem sağlamak için ilk üç gün boyunca pot bir kapak bırakın. Transplant altı yeni bir 8 cm x 13 cm x 5 cm pota fide ve anoth için aynı koşullar altında büyüyen bitkiler devam21 gün er. Toprak boyunca nemli olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Reporter plazmid <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre bir DNA izolasyon kiti kullanılarak önceden bakteriyel kültürden LUC raportör plazmidi 19: CCA1pro saflaştınlır. NOT: 20 ug raportör plazmid bir transfeksiyon için (dH 2 O 2 mcg / ul 10 ul) gereklidir. </li></ol></li><li> Çözümler Not: Bu beş çözelti gerekli protokolü için: Enzim çözeltisi, yıkama 5 (W5) solüsyonu, mannitol-magnezyum (MMG) çözeltisi, polietilen glikol (PEG) çözeltisi ve görüntüleme çözeltisi (Tablo 1). protoplast izolasyon adıma geçmeden önce bu hazırlayın. <ol><li> Tablo 1 &#39;deki gibi, enzim çözeltisi, 10 ml hazırlamak enzimler son ekleme ve filtre 0.22 um&#39;lik bir şırınga filtreden geçirilerek çözelti sterilize edin. </li><li> Aşağıdaki hacimlerde kalan çözümleri hazırlayın: 15 ml W5 çözüm, 10 ml MMG szüm, 1, Tablo 1 gereğince ml PEG çözeltisi ve 1.5 ml görüntüleme çözümü. Not: Bu, PEG çözeltisi PEG tamamen çözünmüş olmasını sağlamak için önce transfeksiyon, bir saat daha az hazırlanmış olması önemlidir. Filtre 0.22 mikron şırınga filtre ile görüntüleme çözümü sterilize edin. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Şekil 1:. Protoplast izolasyonu yetişkin Arabidopsis bitkilerinin (A) yaprakları alt epidermal tabaka (B) yukarı bakacak şekilde otoklav banda sabitlenir. (C) sihirli bantta yavaşça 15 ml konik bir tüp ucu ile alt epidermal tabaka üzerine basılır. (D) magic bant mezofil hücreleri (E) ortaya çıkarmak için kaldırılır. (F) izni ile otoklav bant şeritlerEkli çözeltisinin içine protoplast serbest enzim çözüm içeren selülaz ve pektinaz süzülüyor edilir. (G) iskelet enzimi sindiriminden sonra otoklav bant kalır ve yaprak enzim solüsyonu (H) protoplast bırakarak atılır. (I) Final ortaya çıkan mezofil protoplastlar (Ölçek çubuğu = 50 um). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2. Protoplast İzolasyonu <ol><li> bir petri kabı etiketleyin ve 10 ml filtre ile sterilize edilmiş enzim çözeltisi ekleyin. </li><li> Temiz bir laboratuvar yüzeyinde yapışkan tarafı yukarı ile otoklav bant dört şeritler düzeltmek ve şeritler üzerinde petri boyutunu işaretleyin. </li><li> (4 haftalık bitkilerin (Şekil 1a) yaprakları kesin ve yukarı bakacak şekilde alt epidermal yüzeye yani (otoklav bant üzerine üst epidermis basın <strong&gt; Şekil 1b)). </li><li> Yavaşça 15 ml konik tüp kullanarak alt epidermal yüzeye sihirli bant şeritler basın. Yaprak dokusu (Şekil 1c) ezmek için özen gösterin. Dikkatle alt epidermis şerit sihirli bandı çekip (Şekil 1d) ve mezofil hücreleri (Şekil 1e) maruz kalmaktadır. </li><li> Petri içine bandı taşımak ve enzim solüsyonu (Şekil 1f) üzerinde yüzer, kullanım cımbız petri sığdırmak için otoklav bandı kesti, aşağı bakacak bırakır. protoplastlar çözeltisi içine çıkacak sırasında, 60 dakika için bir platformlu sallayıcı üzerinde 60 rpm&#39;de döndürün. </li><li> 50 ml konik tüp içine protoplast (Şekil 1h) içeren çözüm kaldırmak ve otoklav bandı (Şekil 1g) şeritler atmak ve pipet için cımbız kullanın. Geniş çaplı bir pipet (örneğin P5000 ucu ve sonu olmayan bir P1000 ucu kesilmiş gibi) kullanın. </li><li> 100 x protoplast santrifüj4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca g bir pipet ile süpernatantı. pelet çok gevşek olduğu için, dikkat edin. </li><li> tüp hafifçe dönen 10 ml W5 protoplastlar çözüm ve tekrar süspansiyon ekleyin. </li><li> 30-60 dakika boyunca buz üzerinde protoplast bekletin. Bu adım sırasında, bir hemasitometre (Şekil 1i) &#39;de protoplast sayılarak verim değerlendirmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj ile protoplast toplamak ve bir pipet ile süpernatantı. pelet çok gevşek olduğu için, dikkat edin. </li><li> Mmg çözeltisi içinde 5 x 10 5 protoplastlar / ml&#39;lik bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse protoplast. </li></ol> 3. Protoplast Transfeksiyon <ol><li> 15 ml konik tüp, 10 ul raportör plasmidini (2 ug / ml) eklenir. </li><li> tüpe 400 ul protoplast ekleyin. </li><li> bir hacmi (410 ul) PEG çözeltisi ekleyin ve protoplast transferinde yavaşça 12 kez tersini tüp karıştırın. </li><li> 8-15 dk inc sonraOda sıcaklığında ubation, dört ciltlik (1640 ul) W5 çözeltisi ile protoplast-DNA-PEG karışımı sulandırmak ve yavaşça altı kez ters yüz edilerek karıştırılır. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj ile ara enfekte edilmiş protoplastlar toplamak ve bir pipet ile süpernatantı. pelet çok gevşek olduğu gibi bir kez daha, dikkat edin. </li><li> 1250 ul görüntüleme çözelti içinde protoplast yeniden süspanse edin. </li><li> altı içine kısım 200 ul W5 çözeltisi ile boş kuyu doldurun ve lüminesan görüntüleme için uygun bir yapışkan açık bir kapak plakası mühür, 96 kuyulu plakanın kuyularının çoğaltırlar. </li></ol> 4. Görüntüleme <ol><li> Bitki görüntüleme için uygun olan herhangi bir ışıldayan görüntüleme kurulum plaka aktarın. kuyular arasında yoğunlaşma ve basınç farklılıklarını önlemek için transferinden sonra plakalar 10-15 dk yapışkan kapakları değiştirmek, daha sonra görüntüleme başlatın. Plaka, oda sıcaklığında beş gün süre ile her ~ 45 dakika (3 san oyuk başına) okuyun. NOT:plaka frekans okur ve kuyu başına okuma zamanlı görüntüleme kurulumuna bağlı olarak değişebilir. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Herhangi bir analiz yazılımı (örneğin, Biyolojik Ritimleri Analizi Yazılımı Sistemi (PİRİNÇ) 22) kullanarak lüminesans sonuçlarını analiz. sirkadiyen kusurları ortaya çıkarmak için, vahşi tipli kontroller ile değişken sıra Karşılaştırması. </li></ol>

<ol>
	<li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior.">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+circadian+clock+and+innate+immunity+in+Arabidopsis.">Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis.</a> PLoS Pathog. 9 (6), 1003370 (2013).</li><li>Hevia, M. A., Canessa, P., M&#252;ller-Esparza, H., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+oscillator+in+the+fungus+Botrytis+cinerea+regulates+virulence+when+infecting+Arabidopsis+thaliana.">A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).</li><li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock.">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).</li><li>Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+carbohydrate+availability+for+growth+in+Arabidopsis+plants+at+night.">Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).</li><li>Dodd, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+circadian+clocks+increase+photosynthesis,+growth,+survival,+and+competitive+advantage.">Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage.</a> Science. 309 (5734), 630-633 (2005).</li><li>Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transcriptome+analysis+reveals+circadian+regulation+of+key+pathways+in+plant+growth+and+development.">Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development.</a> Genome Biol. 9 (8), 130 (2008).</li><li>Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Circadian+Phosphoproteomic+Analysis+of+Arabidopsis+Reveals+Extensive+Clock+Control+of+Key+Components+in+Physiological,+Metabolic,+and+Signaling+Pathways.">Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).</li><li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LHY+and+CCA1+Are+Partially+Redundant+Genes+Required+to+Maintain+Circadian+Rhythms+in+Arabidopsis.">LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis.</a> Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).</li><li>Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELF4+is+a+phytochrome-regulated+component+of+a+negative-feedback+loop+involving+the+central+oscillator+components+CCA1+and+LHY.">ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY.</a> Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).</li><li>Lu, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCA1+and+ELF3+Interact+in+the+Control+of+Hypocotyl+Length+and+Flowering+Time+in+Arabidopsis.">CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).</li><li>Nakamichi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSEUDO-RESPONSE+REGULATORS+9,+7,+and+5+are+transcriptional+repressors+in+the+Arabidopsis+circadian+clock.">PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock.</a> Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).</li><li>Dixon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+repression+of+core+circadian+genes+is+mediated+through+EARLY+FLOWERING+3+in+Arabidopsis.">Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).</li><li>Gendron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+circadian+clock+protein,+TOC1,+is+a+DNA-binding+transcription+factor.">Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).</li><li>Hsu, P. Y., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheels+within+wheels:+the+plant+circadian+system.">Wheels within wheels: the plant circadian system.</a> Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).</li><li>Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+phosphorylation+of+CCA1+is+necessary+for+its+circadian+oscillator+function+in+Arabidopsis.">CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).</li><li>Portol&#233;s, S., M&#225;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+interplay+between+protein+kinase+CK2+and+CCA1+transcriptional+activity+is+essential+for+clock+temperature+compensation+in+Arabidopsis.">The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001201 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+the+Arabidopsis+circadian+clock+through+selective+proteolysis+and+phosphorylation+of+pseudo-response+regulator+proteins.">Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins.</a> J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).</li><li>Kim, J., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assessment+of+gene+function+in+the+circadian+clock+using+artificial+microRNA+in+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts.">Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).</li><li>Wu, F. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 16 (2009).</li><li>Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase:+the+structure+is+known,+but+the+mystery+remains.">Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains.</a> Structure. 4 (3), 223-228 (1996).</li><li>Edwards, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+regulatory+flexibility+under+changing+environmental+conditions.">Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions.</a> Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424 (2010).</li><li>Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEITLUPE+Encodes+a+Novel+Clock-Associated+PAS+Protein+from+Arabidopsis.">ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.</a> Cell. 101 (3), 319-329 (2000).</li><li>Wang, Z. -. Y., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Expression+of+the+CIRCADIAN+CLOCK+ASSOCIATED+1+(CCA1)+Gene+Disrupts+Circadian+Rhythms+and+Suppresses+Its+Own+Expression.">Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression.</a> Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).</li><li>Kim, W. -. Y., Geng, R., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+phase-specific+degradation+of+the+F-box+protein+ZTL+is+mediated+by+the+proteasome.">Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).</li><li>Zhai, Z., Jung, H. -. I., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+protoplasts+from+tissues+of+14-day-old+seedlings+of+Arabidopsis+thaliana.">Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).</li><li>Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li><li>Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+direct+gene+transfer+to+protoplasts.">Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+rice+green+tissue+protoplast+system+for+transient+gene+expression+and+studying+light/chloroplast-related+processes.">A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes.</a> Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, protoplast izolasyonu, transfeksiyon ve luminecent görüntüleme dahil olmak üzere Arabidopsis hatlarında sirkadiyen dönem kusurları, ekrana hızlı bir test sunuyoruz. Yabani tip sirkadiyen süresi Arabidopsis ve saatli mutantları cca1 / Lhy, ZTL ve CCA1 OX bir CCA1pro gelen lüminesan ölçümlerinden hesaplandı: LUC raportörünün daha sürülme süresini kullanarak bütün bitkilerde üretilen yayınlanmış verilerle tutarlı olduğu bulunmuştur tüketen transgenik yaklaşımlar (Tablo 2). Arabidopsis mutantlar taranması için Bu tayin kullanılarak, zaman alıcı ve yalnızca belirli bir mutant yabanı ritimleri sergiler ortaya çıkarabilir transjenik lüminesan hatları oluşturmak için ilk şartı önler. Bu protokolün açık bir avantajı, herhangi bir Arabidopsis hat tesislerinde timekeeping etkileyen daha genlerin belirlenmesini yardımcı olacaktır değişmiş sirkadiyen ritimler transkripsiyon, kısa sürede ekranlı olmasıdır. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; protoplast izolasyonu mutant hat bodur bir fenotip görüntüler, özellikle zahmetli olabilir. Protoplast üretilmesi için önce bildirilen yöntemlerle enzimler, hücre duvarları 26,27 ulaşmasını sağlamak için enzim solüsyonu ile şeritler infiltre ince şeritler ve vakum yaprakları veya fide kesme içerir. sonraki sindirim enzim çözeltisi içine protoplast serbest bırakmak için karanlıkta en az 3 saat inkübasyon gerektirmektedir. Vakum infiltrasyon uygulanmadığı zaman, 18 saat kadar olan kuluçka süresi tavsiye edilir. enzimlere aşılmaz epidermal hücre tabakası bant çıkarılır, çünkü burada sunulan protokolde, vakum infiltrasyon gereksizdir. bitki materyali keserek protoplast oluştururken sindirim sonra hücre duvarı enkaz ayrı protoplastlar için gereklidir; Bu, genellikle solüsyon filtre veya bir şeker degrade 27,26 üzerinde saflaştırılması yapılır. Burada, herhangi bir sindirilmemiş doku otoklav bandı sonra kalacaksindirim, protoplast filtrasyon ve şeker degrade arıtma atlanabilir böylece. Uzun süreli protoplasting prosedürlerden kaynaklanan stres, hücre canlılığı ve sirkadiyen saat etkileyen bir şans var. Burada görüntülenmiştir bant tabanlı protoplasting yöntemi 20 protoplastlar yüksek sayıda verir; ve sirkadiyen zaman serisi üzerinde hücrelerin canlılığını verildi ve protoplast ve bütün fideleri (Tablo 2) uygun süresi uzunluğu, burada açıklanan yöntem protoplast meydana getirmek için alternatif yöntemleri tercih edilir. protokolün transfeksiyon adımı o protoplast canlılığı üzerindeki etkileri kritik bir adımdır. PEG çözeltisi hücreye taşınması için DNA, ve her iki inkübasyon süresi, bu çözelti içinde (aşama 3.4) ve deneysel olarak tespit edilmelidir PEG yüzdesinin sağlar. standart konsantrasyon dönüşüm verimliliği ve yüksek azaltarak düşük konsantrasyonlarda ile% 20 olduğucanlılığı 28 azaltılması konsantrasyonları. Beş dakika kadar kısa inkübasyon süresi protoplastlar 27 verimli transfeksiyon verim verebilir. protoplastlar herhangi Işıklı görüntüleme platformu üzerinde görüntülenebilir. Bu videoda, biz yüksek verimli tarama ve sık ölçümler için izin verir, (~ 20 μE kombine yoğunluğu sırasıyla kırmızı ve mavi LED&#39;ler, 630 ve 470 nm,) dış ışıkları ile donatılmış bir parlaklık plaka okuyucu kullandık. aydınlatma fotosentez için kullanılabilir gibi bir şarj çiftli aygıt (CCD) kamera etrafında dayalı alternatif plaka okuyucu veya kurulumları olarak lüminesans algılar diğer görüntüleme ekipmanları, sürece eşit şekilde uygulanabilir. kontrol edilebilen bir kabin üzerine monte edilmiş bir CCD kamerası kullanılarak bir avantajı, hafif ve sıcaklık programlanabilir. Bir dezavantaj perturb ek olarak protoplastlar için strese neden olabilir karanlığın uzun süreli dönemleri tanıtan, uzun yakalama zamanıendojen timekeeping ing. Ne olursa olsun seçilmiş deneysel hangi platformu, ayarları, fide ya da olgun bitkiler için ayarlara göre gerekli olması muhtemeldir. Bizim tecrübelerimize göre, görüntüleme tamponunda transfeksiyonu ve / veya luciferase sırasında raportör plazmid artan konsantrasyonları ilk deneylerde oluşabilecek düzensiz veya hızlı nemlendirme ritimleri çözebilir. Gelecekteki deneylerde, burada tarif edilen yönteme göre herhangi bir mutant arabidopsis çizgisinin sirkadiyen fenotip çalışma uygulanabilir. Küçük değişiklikler yapılarak, zaman tutma gibi değişik ilaçların etkisi bu kurulum okudu olabilir. Ayrıca, transfeksiyon daha bu protokolün çok yönlülük genişleyen, 19 susturulması gen için yapay microRNA içerecek şekilde modifiye edilebilir. Pirinç protoplast oluşturmak için Protokoller 29 köklü ve burada sunulan görüntüleme protokolü eşit bizim u ilerletmek için uygulanan olabilirekonomik açıdan önemli monokot mahsul bitkilerinde saatin nderstanding.

Birçok canlı organizma çevreye günlük değişikliklerin etkili müzakere yardımcı olmak için bir endojen hakemi sahiptirler. Bu hakemi, sirkadiyen saat, dış ortamda öngörülebilir değişiklikleri tahmin etmek bir organizmanın metabolizması ve fizyolojisi birçok açıdan düzenler. 4 - örneğin bitkilerde, geçici öngörülebilir patojen veya otobur saldırıları beklentisiyle güçlü genel duyarlılık 1 azaltır. Nişasta metabolizması sıkıca uzun ya da kısa günün şartlarında 5 yetiştirilen olsun sabaha kadar son o nişasta rezervleri sağlamak için sirkadiyen saat düzenlenir. Nitekim, 24 saat çevre gösterisi artan büyüme oranları eşleşen sirkadiyen saatleri ile bitkiler, karbon fiksasyonu oranları ve sağkalım oranları uyumsuz dönemi 6 bir saat çalışan bitkilere kıyasla. Bütün bu süreçlerde sirkadiyen ritim geniş etkisi üçte kadar ritmik düzenlemelerinden büyük ölçüde ortaya çıkarArabidopsis 7 toplam transcriptome. Bu ritmik gen ürünleri metabolik yollar, hormon sinyalizasyon ve stres yanıtları 7 dahil, hücresel süreçlerin geniş bir yelpazede yer alırlar. Bunun üzerine, protein fonksiyonunun doğrudan sirkadiyen düzenleme fosforilasyon 8 sirkadiyen düzenlemesi ve büyük olasılıkla diğer post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) tarafından kurulmuştur. Bu günlük transkripsiyonel yeniden programlamayı sürücüler sirkadiyen saat merkezinde / öteleme geri besleme sabah ifade genler de dahil olmak üzere (TTFLs), döngüler transkripsiyonal bir ağ yatıyor ifade bastırmak sirkadiyen saat ASSOCIATED 1 (CCA1) ve Geç UZATILMIŞ hipokotil (Lhy) - 11 LUX ARRHYTHMO (LUX), erken çiçek açan 3 (ELF3) ve ELF4 9; akşam genleri CAB 1 (TOC1), gigantea (GI) ve akşam kompleksi (EC) üyelerinin zamanlaması. birlikte zekâH Yalancı TEPKİ REGÜLATÖRÜ -genes (PRR3, 5, 7 ve 9) AT pozitif bir regülatörü 12 olarak görev yapar iken, TOC1 CCA1 / Lhy ekspresyonunu bastıran - 14. TTFL ağ bileşenleri, geri besleme mekanizmaları Ek transkripsiyon sonrası ve post-translasyonel regülasyon ayar sirkadiyen ritimler önemli bir rol oynar. Bugüne kadar, sirkadiyen saat proteinleri tespit en bol PTM fosforilasyonu 15&#39;dir. Kazein Kinaz 2 (CK2) tarafından CCA1 fosforilasyonu onun promotörleri 16 hedef bağlanma ve sirkadiyen saat 17 sıcaklık dengelemesi açısından önemlidir etkiler. PRR proteinleri farklı şekilde sirkadiyen döngüsü boyunca fosforile ve TOC1 fosforilasyonu negatif regülatörü ile etkileşimi etkiler vardır, akşam aşamalı saat bileşeni ZEITLUPE (ztl) 18. Bu örnekler kadar 24 saat içinde PTMS ve protein-protein etkileşimleri ayar TTFL ağıtranskripsiyonel osilatör. Transkripsiyonel saat ağı ve düzenlenmesi için daha detaylı bir giriş için mükemmel son yorumları (örneğin referans 15) bulunmaktadır. Ancak, ne daha az açık kalır ritmik düzenlenmiş süreçler ve hücresel metabolizma diğer yönleri geri timekeeping mekanizması kendi içine beslemek için derecesidir. Saat kusurları için Arabidopsis mutantlar geniş tarama mekanizmaları ya da sinyal yolları bir TTFL ağdan 24 saat ritimlerin üretiminde rol oynayan edilebileceği ileri anlayışa olabilir. Bu amaçla, Kim ve Somers önce herhangi bir Arabidopsis çizgisi 19 saat fonksiyonu etkin ve hızlı analiz için bir kırılma yoluyla yöntemi yayınladı. protoplast geçici ekspresyonu kullanımına göre, bu yöntem, stabil transgenik kuşaklar için ihtiyaç aşan ya da lüminesan saat markör hatları geçmektedir. Burada, bir yüksek verimli protoplast, izolasyon görselleştirmekoptimize edilmiş bir protokol ile birlikte n yöntemi 20, 96 oyuklu bir plaka okuyucusunda geçici olarak ifade saat belirteçlerin lüminesan görüntüleme sirkadiyen kusurları ekranlanması için kullanıldı. Biz değişmiş sirkadiyen ritim algılar burada başarılı açıklanan metodoloji onaylamak için iyi karakterize saat mutantlar için yabani tip Koleji&#39;nden 0 Arabidopsis karşılaştırır. LUC 19: CCA1pro; bu hatlar türetilen Protoplastlar sirkadiyen CCA1 promoterinden ateşböceği lusiferazı eksprese eden bir raportör yapısı ile transfekte edilir. Lusiferaz Bu da, bu protoplastlarda genlik, transkripsiyonel ritim faz değerlendirmek için zamanla görüntülendi olan, ışığı 21 yayar oksilusiferin luciferase için elektronik olarak uyarılmış dönüştürüldüğü çok aşamalı reaksiyonu katalize eder. protokol üç ana bölümden oluşmaktadır; haberci plazmid ve lüminesan IM protoplast transfekte edilmesi, protoplast izolasyonyaşlanma. Bu üç parça, her zaman taze hazırlanmış tamponlar ve reaktifler kullanılarak, tek bir günde yapılmalıdır. Bitki büyümesi ve raportör plasmidinin yeterli miktarda saflaştırılması önceden yapılmalıdır ve bu protokolde görselleştirilemediği.

<table><tbody><tr><td>CELLULYSIN Cellulase, &lt;em&gt;Trichoderma viride&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Merck Millipore</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectinase R10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros Organics</td><td>327765000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>327300010</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fischer Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td><td>Acros Organics</td><td>434630010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Firefly</td><td>Biosynth AG</td><td>L-8200</td><td>Dissolve luciferin powder in 0.1 M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50 mM</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9618</td><td></td></tr><tr><td>Comply Steam Indicator Tape</td><td>3M</td><td>1222</td><td></td></tr><tr><td>Magic Tape</td><td>3M</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td><td>Perkin Elmer</td><td>6050195</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td><td>BD Plastipak</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td><td></td><td></td><td>Free download at amillar.org</td></tr><tr><td>QIAfilter Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12262</td><td></td></tr><tr><td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td><td>Hawksley</td><td>AC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bright field microscope</td><td>Optika Microscopes</td><td>B-150POL-B</td><td></td></tr><tr><td>LB942 TriStar&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; multimode reader, with luminescence module</td><td>Berthold Technologies Ltd</td><td>57947/57948</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

Vahşi tip Arabidopsis protoplastlarını cca1 / Lhy (kısa süreli mutantı 2), ZTL (uzun süreli mutantı 23) ve aşın hattı CCA1 OX (24, ritmik) bilinen saat mutantları ile karşılaştırıldı. Tüm geçici CCA1pro ile transfekte edildi: LUC raportörünün, 5 gün boyunca, bir plaka okuyucusu üzerinde sabit ışık görüntüsü alınmıştır. Burada cca1 / Lhy mutant, sirkadiyen kontrollü gen ekspresyonunun serbest çalışma süresi lüminesan saat stabil transgenik ekspresyon 2,9 belirteçleri ile analiz geçme süresi ile uyumlu olarak, (Şekil 2a) kısaltılır göstermektedir. ZTL mutant protoplastlarını sirkadiyen salınım süresi yabani tip daha uzun (Şekil 2b), fidelerden yayınlarla uygun olarak, hücre süspansiyonu, Cultures ve protoplastlar 19,23,25. CCA1 aşırı ekspresyonu sabah fazda saat kilitler ve küresel transkripsiyon aritmik 24 olur. CCA1 OX protoplastlar (Şekil 2c) &#39;de LUC ifade: Tutarlı, biz CCA1pro hiçbir salınımların gözlemledi. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Şekil 2: col- 0, cca1 / Lhy, ZTL ve CCA1 ve Protoplast Günlük ritimler Protoplasts OX geçici CCA1pro ile transforme edilmiştir: LUC inşa ve lüminesans sirkadiyen ritimler 5 gün içinde görüntülendi (A - C). (D) Col -0, cca1 / Lhy ve ZTL lüminesans izleri dayalı Sirkadiyen dönem tahminleri (A - B). Ben miBir ± SEM, n = 3-5, belirtilen t-testi p değeri olarak. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotip </td><td> Dönem (protoplastlar) </td><td> Dönem (transgenik) </td><td> Tarafından rapor edildi: </td><td> Referanslar </td></tr><tr><td> col- 0 </td><td> 23.0 ± 0.21 </td><td> 24.4 ± 0.09 </td><td> pCCA1: Col LUC -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> cca1 / Lhy </td><td> 20.6 ± 0.13 </td><td> 19.9 ± 0.11 </td><td> pCCA1: Col LUC -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> L er arka RNA </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25.1 ± 0.12 </td><td> 27.4 ± 0.5 </td><td> CAB2: C24 ekotipindeki LUC </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 OX </td><td> aritmik </td><td> aritmik </td><td> pCCA1: LUC (LD verileri sadece) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> aritmik </td><td> Col -0 arka RNA ve protein </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Transgenik fidanı ile karşılaştırıldığında protoplastlan Günlük ritimler pCCA1 sirkadiyen dönemi:. Dönem ilk mutasyon rapor uzunluklarda ve varsa kıyasla protoplastlarda LUC ifadesi pCCA1 ile: Col -0 yılında LUC ifadesi.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

sirkadiyen saat Arabidopsis transcriptome yaklaşık üçte düzenler, ancak timekeeping içine geri besleme genlerin yüzdesi bilinmemektedir. Burada hızla geçici protoplastlar ifade bir sirkadiyen muhabiri Işıklı görüntüleme kullanarak Arabidopsis herhangi mutant doğrultusunda sirkadiyen fenotipleri değerlendirmek için bir yöntem görselleştirmek.

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

rapid-analysis-circadian-phenotypes-arabidopsis-protoplasts

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Görüntüleme.  University of Edinburgh.  sirkadiyen saat Arabidopsis transcriptome yaklaşık üçte düzenler, ancak timekeeping içine geri besleme genlerin yüzdesi bilinmemektedir. Burada hızla geçici protoplastlar ifade bir sirkadiyen muhabiri Işıklı görüntüleme kullanarak Arabidopsis herhangi mutant doğrultusunda sirkadiyen fenotipleri değerlendirmek için bir yöntem görselleştirmek. 

Video: Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genetik

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biyoloji

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Nörobilim

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Analysis of Circadian Photoresponses in Drosophila Using Locomotor Activity

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant environmental parameters that synchronize animal circadian clocks. In Drosophila circadian photo-responses are mediated by a solely blue light photoreceptor named CRYPTOCHROME (CRY). Upon photoreception, CRY changes its conformation and initiates the proteosomal dependent degradation of TIMELESS (TIM). TIM is an important pacemaker protein, thus degradation of TIM will reset the circadian clock. Under constant light conditions (LL), wild type flies quickly become arrhythmic because of the constant degradation of TIM, while flies bearing defects with circadian photo-responses will still be rhythmic. Thus LL triggered arrhythmicity has been used for screening of components in circadian light input pathways. A brief short light pulse in the night can also dramatically shift phases of circadian rhythms. As expected, this phase shift response is reduced in flied with defects in circadian photoresponse. Thus analyzing locomotion behavior rhythmicity under LL or phase changes after short light pulse in constant darkness (DD) are two major methods to study circadian photoresponse. Here we describe how to design and analyze LL and phase response experiments. LL arrhythmicity is suitable for screening light input pathways mutants, whereas phase response validates the results and provide further information for light sensitivity.

Drosophila locomotor activity is a robust and quantitative measurement of circadian photo-responses. We describe protocols for designing behavior experiments for circadian photo-responses and analyzing the data. Studying the circadian photo-responses is important for dissecting the neuronal and molecular mechanisms of light entrainment.

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Sirkadiyen Ritim Çalışmaları için İnsan Bağırsak Enteroidlerinin Optimize Edilmesi

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

Yazar Spotlight: Çok Hücreli Sistemlerde Sirkadiyen Ritimlerin İn Vitro Araştırmaları

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana

Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

Analysis of Circadian Photoresponses in Drosophila Using Locomotor Activity

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi