Name: protective efficacy and pulmonary immune response following subcutaneous and intranasal bcg administration in mice
Uploaded: 2016-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice at JoVE.com

This work was supported by "Spanish Ministry of Economy and Competitiveness" [grant number BIO2014-5258P], "European Commission" by the H2020 programs [grant numbers TBVAC2020 643381].

Tüm fareler kontrol edilen koşullar altında tutulur ve hastalık belirtisi gözlendi. Deneysel çalışma Deney hayvanlarının korunması ve yetkili yerel etik kurul onayı ile Avrupa ve ulusal direktifleri ile anlaşma yapılmıştır. BCG Danimarka ve Sayısallaştırılmış Gliserin Stoklar ve Mycobacterium tuberculosis H37Rv 1. hazırlanması NOT: anlatılan tüm protokoller BSL3 koşulları altında gerçekleştirilmiştir. <ol><li> BCG Danimarka da H37Rv soylarının çözülme dondurulmuş gliserol stokları ve Tween-80% 0.05 (h / h) ve ADC (albümin, dekstroz, katalaz),% 10 (h / h) ile desteklenmiş 7H9 ortamı, 10, 10 ml 100 ul inokülasyon. </li><li> Kültür log fazı büyümesinde kadar 37 ° C&#39;de bir hafta süreyle statik koşullar altında inkübe edilir. </li><li> taze ortam 200 ml 10 ml kültür aktararak bakteri kültürü büyütmek. 20 ek inkübestatik koşullar altında gün. </li><li> x g, 2500, 15 dakika boyunca 50 ml&#39;lik santrifüj tüplerine ve santrifüj aktarın. </li><li> süpernatantlar atın ve artık hacmi bakteriyel pelletini. (- Tüp başına 15 10) her tüp steril 3 mm çaplı cam boncuklar ekle. </li><li> Vortex şiddetle sırayla 1 dakika boyunca bakteri kümeleri ayırmak için. Tween-80% 0.05 ile 10 ml PBS, her pelletini (h / h). </li><li> En büyük bakteriyel agrega ve cam boncuklar yerleşmek için izin 10 dakika tüpleri bırakın. </li><li> Tek bir yeni bir 50 ml&#39;lik santrifüj tüpüne (geri kazanılan son hacmi 38 mi), küçük kümeleri ve tek bir bakteri ve transfer birimleri ihtiva eden 4 tüplerinin her birinden süpernatan 9.5 ml yeniden elde. 400 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj. </li><li> % 15 bir son gliserol konsantrasyonunun elde edilmesi, tek bir taze 50-ml santrifüj tüpü içinde (esas olarak tek bir bakteri ihtiva eden) süpernatanın 35 ml yeniden elde etmek ve gliserol ile% 50 (h / h) 15 ml PBS ilave (h / h). </li><li> yavaşça karıştırınve dondurma için uygun tüplerde 1 ml alikotlar içinde dağıtın. -80 ° C&#39;de saklayın (bir çok yaklaşık 50 alikotları gliserol stok sağlar). </li><li> gliserol stokları ölçmek için, dondurma işleminin, bir gliserol gün çözülmesi ve PBS 900 ul ihtiva eden ayrı bir 1.5 ml tüpler içinde yedi ila on kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek. </li><li> Levha 55 mm çapında Petri tabaklarına hazırlanan ADC,% 10 (h / h) ile desteklenmiş 7H10 katı agar ortamında 10, her seyreltme oranından 100 ul. </li><li> Dikkatle 3 mm çaplı cam boncuk (plaka başına yakl. 10) ekleyin ve hafifçe eşit agar plaka üzerinde hacmini dağıtmak için plakayı sallayın. boncuk atın ve parafilm agar plaka mühür. </li><li> 37 ° C&#39;de 21 gün boyunca inkübe tek koloniler doğru bir şekilde ayırt edilebilir seyreltiler halinde koloni oluşturan birimler (CFU) sayımı için bakteriyel konsantrasyonunu belirlemek. </li></ol> 2. Fare Aşılama <ol><li> Önceden sayısal BCG gliserol çözülme ve hazırlık PBS içinde seyreltinİki süspansiyonlardır. Hayvan başına doz dikkate son hacim hesaplayın deri altı uygulama için 100 ul (subkutan aşılama için ml başına 10 7 cfu) ve burun (intranazal aşılama için 2.5 x 10 7 CFU) 40 ml. </li><li> izofluran ve oksijen karışımı ile fareler anestezi kemirgenler için özel bir anestezi iş istasyonu kullanımı. Anestezi odasında fareler korumak için anestezi ve% 2 uyarmak için izofluran% 5 kullanın. (Diğer kabul anestezi yöntemi kullanılır). </li><li> Deri altına uygulama için bir aşı bakteriyel süspansiyon (10 7 cfu / ml), 1 ml bir 26 G iğne ile bir 1 ml şırınga doldurun. hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Laminer akış kaput içinde yüzüstü pozisyonda düz bir yüzey üzerinde bir anestezi fare yerleştirin ve fare kanadını Deri altına aşı 100 ul (10 6 CFU / doz) geri aşılamak. kafes fare dönün ve prope sağlamak için monitörrly anestezi kurtarır. </li><li> Her fare idaresi arasında şırınga iğnesi değiştirin. Yukarıda açıklandığı gibi hava kabarcıkları kaldırıldı. </li><li> Burun içi uygulama için, kaput içinde yatar pozisyonda bir anestezi fare yerleştirin. </li><li> Bir mikropipet ile 2.5 x 10 7 CFU / ml süspansiyon 20 ul alır. Fare hacim nefes izin damla arasındaki süreyi bırakarak, aşı damla-by-damla tüm hacim tevdi kadar iki burun delikleri arasında koyun Not:. fareler, bu işlem sırasında solunum sıkıntısı muzdarip olabilir onlar bırakılmalıdır böylece mümkün olduğunca önlemek için bir sonraki yönetmek için önce her damla asimile. </li><li> Başka bir 20 ul mikropipet yeniden doldurmak ve işlemi tekrarlayın. Fare ilk aşılamadan sonra anestezi uyanmak başlarsa, önce ikinci bir anestezi odasına yerleştirin. kafes fare dönün ve düzgün kurtarır eminanesteziden. </li></ol> H37Rv Gerinim 3. Fare intranazal meydan <ol><li> önceden miktarı H37Rv gliserol çözülme ve ml başına 2500 CFU bakteriyel süspansiyon hazırlamak için PBS içinde seyreltin. hayvan başına doz dikkate son hacim hesaplayın 40 ul. </li><li> 2.5 açıklandığı gibi H37Rv intranazal inoküle - 2.7. Fare başına nihai meydan dozu 10 2 CFU / 40 ul. </li></ol> Akciğerler uyarılmış bağışıklık tepkisinin 4. Analizi <ol><li> Akciğer hücresel süspansiyon Not: akciğer aşıyla indüklenen adaptif bağışıklık tepkisinin değerlendirilmesi, tek bir hücre süspansiyonunun oluşturulmasını gerektirir. Bu amaç için, bu tür gentleMACS bir doku Dissociator kullanımı. <ol><li> servikal dislokasyon (ya da diğer kabul insani metodoloji) ile fare Kurban ve fare göz kırpma refleksinin yok onaylamak için gözü dokunmadan ölü olduğundan emin olun. </li><li> Laminer akış kaput içinde, l ayıklamakSteril makas ve forseps kullanarak ve temiz bir yüzeye koyun ungs. Temiz akciğerler trakea ve bağ dokusu çıkarılması ve (işleme kadar buz üzerinde muhafaza) PBS ile 1.5 ml tüp akciğerlere aktarın. </li><li> PH 7.4, 150 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2 ve 1.8 mM CaCl2, 10 mM HEPES-NaOH 5 ml içeren organ dissosiyasyon (Cı-ayıracı tüp) için uygun bir tüp içinde akciğerlere yerleştirin hücresel bir süspansiyon oluşturmak üzere tampon. </li><li> Kollajenaz D, 100 mg / ml 100 ul (2 mg / ml nihai konsantrasyon) ve DNase I 20,000 IU / ml, 40 ul (160 lU / ml nihai konsantrasyon ekleyin. Not: Kollajenaz D veya DNasel stok çözeltileri, sırasıyla, 2, 1 mM (h / h), 20 mM Tris-HCI pH 7.5 Y MgC liyofilize PBS enzimler ya da gliserol% 50 eritilerek hazırlanır. </li><li> Doku dissociator tüpü yerleştirin ve akciğer parçalanması için önceden tanımlanmış bir program m_lung_01 kullanın. 30 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de tüp inkübe edin. </li><li> Yeri incie dissociator tüp ve tek hücre süspansiyonu içine tam akciğer homojenizasyon için önceden tanımlanmış bir program m_lung_02 kullanın. </li><li> 50 ml santrifüj tüpüne yerleştirilmiş bir 70-mikron naylon hücre süzgecinden hücresel süspansiyon geçirin. RPMI 1640 ortamı 10 ml süzgeç yıkayın. </li><li> Santrifüj hücreleri, 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca ve supernatant atın. </li><li> , Tampon yokedici eritrositlerin 1 ml ilave edilir vorteks ile karıştırılır ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 400 x g, 5 dakika boyunca RPMI 1640 ortamı, santrifüj hücreleri 10 ml. </li><li> tam RPMI 1640 ortamında 0.5 mL içinde süspanse hücreleri,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 2 mM L-Glutamın, 100 ug / mL streptomisin, 100 IU / ml penisilin ve 50 uM 2-merkaptoetanol desteklenmiştir. Not: FCS 30 dakika 56 ° C&#39;de inkübe edilerek inaktive edildi. </li><li> Hücrelerin sayısı ve 10 7 hücre / ml nihai hücre yoğunluğu ulaşmak için tam RPMI 1640 ortamı ilave edin. NOT: hücre sayımı için, otomatik hücre sayacı kullanmak. </li><li> U tabanlı, 96-çukurlu, steril plaka hücre süspansiyonu 100 ul dağıtma (10 6 hücre / oyuk). </li><li> Ticari H37Rv saflaştırılmış protein türevi 15 ug / ml (PPD) (5 ug / ml nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı göz 50 ul / ekleyin. </li></ol></li><li> ELISA ile sitokin tespiti için supernatant toplanması <ol><li> 4.1.14 37 ° C&#39;de 48 saat% 5 CO2 plaka inkübe edin. </li><li> 5 400 x g&#39;de dakika ve süpernatant 100 ul kurtarmak için santrifüj plaka. </li><li> -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> sırasıyla IFNy için deney tamponu ve IL17A belirlenmesinde Üst fazlar, 1/10 ve 1/2 seyreltilir. üreticinin talimatlarına (ELISA Geliştirme kitleri) göre, ticari ELISA kitleri ile sitokin konsantrasyonları belirleyin. </li></ol></li><li> Sitokin tespiti için hücre içi boyamaAkış sitometrisi ile CD4 + üreten hücrelerde <ol><li> 4.1.14 37 ° C &#39;de, 18 saat ve% 5 CO2 plaka inkübe edin. </li><li> her bir (10 ug / ml son konsantrasyon) Brefeldin 1 mg / ml (DMSO içinde çözülmüş stok), 1.5 ul ekleyin ve altı saat daha inkübe edilir. </li><li> 3200 xg&#39;de 1 dakika boyunca 4.3.2 plaka santrifüj ve supernatant atın. </li><li> % 10 FCS (1/500) ile RPMI 1640 içinde seyreltilmiş anti-fare CD4-FITC, 50 ul ve yeniden süspanse hücreler 4 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> , 3200 x g&#39;de 1 dakika boyunca 4.3.4 plaka santrifüj süpernatan atılır ve 100 ul / göz sabitleme çözeltisi ilave edilir. 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> permeabilizasyon solüsyonundan 150 ul / yıkama ile hücreler iki kez yıkanır. Not: 10x konsantre stok 1x çalışma çözeltisi hazırlamak için deiyonize su içinde seyreltilmiştir. </li><li> anti fare IFNy-APC, anti-fare IL17A-APC.Cy7 50 ul hücreleri tekrar permeabil içinde seyreltilmişleştirilmesi çözeltisi (1/250 hem antikorlar). </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> permeabilizasyon solüsyonundan 150 ul / yıkama ile hücreler iki kez yıkanır. </li><li> Akış sitometri edinimi için PBS 200 ul yeniden süspanse hücreleri. </li></ol></li></ol> Bronchoalveolar Lavage immünglobulinlerin 5. Analizi (BAL) <ol><li> BAL örnekleri elde edilmesi <ol><li> servikal dislokasyon (ya da diğer kabul insani metodoloji) ile fare Kurban ve fare göz kırpma refleksinin yok onaylamak için gözü dokunmadan ölü olduğundan emin olun. </li><li> Emin tamamen çıkarılması için değil, yapım uygun hassas steril forseps ve makas kullanılarak trakea Açığa ve trakea küçük bir kesim yapmak. BAL örneği kontamine olabilir kanamaya neden özen gösterin. </li><li> trakea içine buz soğukluğunda PBS 800 ul steril 1 ml şırınga bağlı bir kanül tanıtılması. </li><li> PBS akciğer ve r yavaşça inoküleAkciğer çöküşü önlemek için çok yavaş şırınga en pistonu geri çekerek ecover BAL hacmi. NOT: 500 600 ul Kurtarma tatmin edicidir. </li><li> 1.5 ml tüp içine BAL hacmi aktarın ve bu kanın (işleme kadar buz üzerinde muhafaza) ile kontamine değil belirten BAL renksiz kalır onaylayın. </li><li> yeni bir tüpe 5 400 x g&#39;de dakika ve Süpernatant santrifüjleyin BAL örnekleri. </li><li> -80 ° C&#39;de saklayın süpernatantlar. </li></ol></li><li> BAL süpernatanlarında IgA Belirlenmesi Not: Kullanılan bütün ayıraçlar oda sıcaklığında yer almaktadır. <ol><li> M. (10 ug / ml) PBS içinde seyreltilmiş PPD 100 ul kat yüksek protein bağlanması polistiren düz tabanlı 96 oyuklu plakalar Tüberküloz özel IgA belirlenmesi, ya da toplam IgA belirlenmesi için PBS içinde 10 kez seyreltildi BAL yüzer 100 ul. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Süpernatantı atın ve d kağıt havlu üzerine plakayı dokununry. 200 ul / PBS kuyunun ile yıkayın. </li><li> 200 ul / gözenek bir sığır serum albümini (BSA) PBS-Tween-80% 0.05 (h / h) (bloke edici tampon) (ağ / hac)% 1 ile bloklayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> 200 ul / PBS-Tween-80% 0.05 (h / h) (yıkama tampon maddesi) oyuk bir kez yıkayın. </li><li> PPD kaplı oyuklara içinde seyreltilmemiş BAL yüzer 100 ul ekle. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edilir. NOT: Toplam IgA belirlenmesi PPD özgü IgA paralel olarak yapılır, Bu kuluçka sırasında 100 ul yıkama tamponu ile toplam IgA kuyu bırakın. </li><li> Yıkama buffer.0170004 200 ul / oyuk ile üç kez yıkayın </li><li> yaban turpu peroksidazı (HRP), 100 ul ekle tamponu (1 / 10,000) engelleme seyreltilmiş anti-fare IgA konjüge edilmiş. </li><li> 1 saat, oda sıcaklığı inkübe edin. </li><li> Yıkama tamponu, 200 | il / oyuk ile beş kez yıkayın. </li><li> 3,3, 100 ul / yuva ekleyin &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidin (TMB). t, oda sıcaklığında 20 dakika inkübeO karanlık. </li><li> 100 ul / kuyucuk H2 SO 4 0.5 N ekleyin. 450 nm bir dalga boyunda bir spektrofotometre plaka okuyun. </li></ol></li></ol> akciğerlerde 6. Bakteriyel yük belirlenmesi <ol><li> Akciğer homojenizasyon ve kaplama <ol><li> Dört hafta mücadeleden sonra, servikal dislokasyon (ya da diğer kabul insani metodoloji) ile fare feda ve fare göz kırpma refleksinin yok onaylamak için gözü dokunmadan ölü olduğundan emin olun. </li><li> Laminer akış kaput içinde düz ve dezenfekte yüzeyde sabit yatar pozisyonda fare yerleştirin. </li><li> bir kesi yapmak ve göğüs alanı görünür bırakmak için göğüs bölgesinden deri kaldırmak. </li><li> kaburga kesip ve steril makas ve forseps kullanarak akciğer ve kalp hasat. temiz bir yüzeye organları yerleştirin. </li><li> Kalp, trakea ve bağ dokusu kaldırarak akciğerler temizleyin ve iyonu giderilmiş su, 1 ml ile 1.5 ml tüp akciğerlere aktarmak(Işleme kadar buz üzerinde muhafaza). </li><li> iyonu giderilmiş su, 1 ml ihtiva eden, - (Ayıraç tüpü M), organ homojenizasyon için uygun bir tüp içine, her bir fare akciğerlerine aktarmak için steril forseps kullanın. </li><li> Doku dissociator tüpü yerleştirin ve akciğerleri homojenleştirme önceden tanımlanmış bir program RNA_1 kullanın. </li><li> 900 ul seyreltilmiş, akciğer homojenatı, 100 ul ile başlayarak, 1.5 ml tüpler içinde beş ila on kat seri dilüsyonları yapılır. </li><li> Levha seyreltileri 1.11-1.14 tarif edildiği gibi. </li></ol></li><li> PCR ile BCG ve H37Rv arasındaki farklılaşma NOT: burun içi yoldan BCG ile aşılanmış grubuna karşılık gelen 6.1.6 den plakalar, biz CFU aşı haiz koruyucu etkinliği geldi değerlendirmek için düşünülen sağlamak için BCG ve H37Rv arasında bir seçici PCR ile kolonilerin temsili bir dizi analiz benzersiz H37Rv için. RD9 Bu PCR hedefleri büyütme, BCG ve M. tu farklı bir genomik bölgetüberküloz, H37Rv için 2618 bp&#39;lik ve BCG 11 465 bp&#39;lik bir fragmanı verir. <ol><li> PCR tüpleri (9 ul / numune) dağıtmak sonra belirtilen numune başına hacimleri ile tüm örnekler için bir master miks stok hazırlayın ve. NOT: Tampon 5x: 2 ul. İleri primer 25 uM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): Taq polimeraz, ul 5 birimleri / 0.32 ul: 0.32 ul astar 25 mcM (GCCCAACAGCTCGACATC) Ters 0.04 ul, Deiyonize H 2 O: 6,32 ul. </li><li> steril bir kürdan ile bir koloni dokunun ve ana karışımı içeren bir PCR tüpünde numune ile kürdan batırın. </li><li> Aşağıdaki programı ile PCR çalışması: 10 dak 95 ° C (bu adım bakteriyel bozulma tetiklemek için), 10 dakika 95 ° C, 1 dakika, 95 ° C &#39;de 35 döngü (30 saniye (bu adım bakteriyel bozulma tetiklemek için) 58 ° C ve 4 dakika 72 ° C&#39;de). </li><li> parçaları görselleştirmek için etidyum bromür ve çalışma örnekleri ile% 1 agaroz jel PCR örnekleri yükleyin. </li&gt; </ol></li></ol>

<ol>
	<li>Zumla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WHO+2014+global+tuberculosis+report--further+to+go.">The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go.</a> Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).</li><li>Mangtani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+by+BCG+vaccine+against+tuberculosis:+a+systematic+review+of+randomized+controlled+trials.">Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials.</a> Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).</li><li>Aguilo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+confers+dose-dependent+superior+protection+compared+to+that+of+subcutaneous+vaccination.">Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination.</a> Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).</li><li>Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+intranasal+mucosal+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+confers+improved+protection+compared+to+subcutaneous+vaccination+against+pulmonary+tuberculosis.">Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis.</a> Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).</li><li>Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+intranasal+vaccination+with+Mycobacterium+bovis+BCG+against+airway+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice.">Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).</li><li>Lagranderie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCG-induced+protection+in+guinea+pigs+vaccinated+and+challenged+via+the+respiratory+route.">BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route.</a> Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).</li><li>Gopal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17-dependent+CXCL13+mediates+mucosal+vaccine-induced+immunity+against+tuberculosis.">Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis.</a> Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).</li><li>Khader, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+and+IL-17+in+the+establishment+of+protective+pulmonary+CD4++T+cell+responses+after+vaccination+and+during+Mycobacterium+tuberculosis+challenge.">IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge.</a> Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).</li><li>Aguilo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+but+Not+Subcutaneous+Delivery+of+BCG+Vaccine+Confers+Protection+to+Tuberculosis-Susceptible+Mice+by+an+Interleukin+17-Dependent+Mechanism.">Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism.</a> J Infect Dis. , (2015).</li><li>Middlebrook, G., Cohn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriology+of+tuberculosis:+laboratory+methods.">Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods.</a> Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).</li><li>Brosch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+evolutionary+scenario+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).</li><li>Kaushal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccination+with+attenuated+Mycobacterium+tuberculosis+induces+strong+central+memory+responses+and+protects+against+tuberculosis.">Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis.</a> Nat Commun. 6, 8533 (2015).</li><li>Lochhead, J. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+biologics+to+the+central+nervous+system.">Intranasal delivery of biologics to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).</li><li>Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+transport+within+cerebral+perivascular+spaces+underlies+widespread+tracer+distribution+in+the+brain+after+intranasal+administration.">Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).</li><li>Griffiths, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+enhances+vaccine-induced+protection+against+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice.">Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> PLoS One. 8 (10), e78312 (2013).</li><li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+Th17+cells+in+Peyer's+patches+is+responsible+for+the+induction+of+T+cell-dependent+IgA+responses.">Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses.</a> Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).</li><li>Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+lung+mucosal+Th17-mediated+responses+induce+polymeric+Ig+receptor+expression+by+the+airway+epithelium+and+elevate+secretory+IgA+levels.">Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels.</a> J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Although current vaccine against tuberculosis, BCG, is the most widely administered vaccine in history, tuberculosis remains one of the leading causes of death and morbidity from infectious diseases worldwide. This paradox is explained by the lack of protection of this vaccine against pulmonary tuberculosis, the responsible form of transmission. New vaccination approaches effective against pulmonary forms of the disease are urgently needed, as they would have the greatest impact on disease transmission globally.
<p c...

Tüberküloz (TB) TB endişe verici küresel bir sağlık sorunudur 1 yapan dünyada HIV fazla ilişkili ölümüne yol önde gelen bulaşıcı hastalıklardan biri olan ve çoklu ilaç dirençli suşlar yükselen artış ile birlikte olduğunu. Yeni tanı araçları, daha etkili ve daha az toksik ilaçlar ve yeni, güvenli ve etkili bir TB aşıları özellikle gelişmekte olan ülkelerde, acil ihtiyaç vardır. zayıflatılmış Basil Calmette-Guerin (BCG) şu anda dünya çapında 1970&#39;lerden beri doğumda intradermal tatbik edilmiştir TB, karşı tek lisanslı aşı edilir. BCG çocuklarda hastalık (menenjit ve miliyer TB) şiddetli formları önlemede etkili kabul edilir, ancak hastalık bulaşma 2 sorumlu akciğer TB karşı tutarsız etkinlik göstermiştir. TB enfeksiyonunun doğal yolunu taklit Pulmoner aşılama, yerel ana bağışıklık yanıtını emişli için cazip bir yaklaşımı temsil etmektedirs. Deri altı veya deri içi yoldan 3-6 ile karşılaştırıldığında, bu bağlamda, farklı alakalı TBC hayvan modellerinde çeşitli klinik öncesi işleri pulmoner immünizasyondan sonra daha fazla aşı etkinliğini göstermiştir. Bununla birlikte, pulmoner aşılama aracılığı ile ortaya koruyucu mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Son yıllarda, birçok eserler IL17 mukozal aşı kaynaklı koruyucu etkinliği için yoksun fare modellerinde olduğu gibi, TB-spesifik mukozal bağışıklık yanıtının önemli bir faktör olarak IL17 aracılı tepki doğru çekmişlerdir 7,8 bozulur. Yakın zamanda BCG DBA / 2 fareleri, deri altından BCG aşısı sonra 9 koruma eksikliği ile karakterize edilen, bir fare türü korumalı intranazal ilk kez ortaya koymuştur. Bu sonuçlar solunum TB aşı intradermal BCG pulmon karşı etkisiz olarak kabul edilir endemik ülkelerde TB oranının azaltılmasında daha etkili olabileceğini öne sürdüli TB.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9 broth</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Enrichment</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>3-mm diameter Glass Beads</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>C tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x concentrated</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x concentrated</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter Sensors, 40 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-&amp;gamma; ELISA development kit&amp;nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL17A ELISA development kit&amp;nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-mouse IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4&amp;rdquo;</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td><td>Used as trachea cannula for BAL</td></tr><tr><td>high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, from bovine serum</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgA (&amp;alpha;-chain specific)&amp;minus;Peroxidase antibody</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-Tetramethylbenzidine (TMB)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>The kit Includes Buffer 5x</td></tr></tbody></table>

protective efficacy and pulmonary immune response following subcutaneous and intranasal bcg administration in mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

deri altı ve burun içi: Bu çalışma, BCG iki uygulama yollarının karşılaştırmasını tarif eder. Subkutan rota dünya çapında BCG için geçerli klinik rota intradermal, karşılaştırılabilir. Aşının burun içinden yol M. enfeksiyonunun doğal yolunu taklit amaçlar amaç tüberküloz, akciğerlerde, doğrudan bu patojenin başlıca hedef organ immün tepkisini indüklemek için. Şe...

Watch this Scientific Journal Video about Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice at JoVE.com

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Koruyucu etkinliği ve Pulmoner Bağışıklık Tepkisi Fare Subkutan ve Burun BCG İdaresi ardından

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

protective-efficacy-pulmonary-immune-response-following-subcutaneous

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K Görüntüleme.  University of Zaragoza. We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Video: Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of vaccine to lymph nodes where antigen presenting cells can interact with lymphocytes for generation of the wanted immune responses. The strength and the type of immune responses induced also depend on the density or frequency of interactions as well as the microenvironment, especially the content of cytokines. As only a minute fraction of peripherally injected vaccines reaches the lymph nodes, vaccinations of mice and humans were performed by direct injection of vaccine into inguinal lymph nodes, i.e.&#160;intralymphatic injection. In man, the procedure is guided by ultrasound. In mice, a small (5-10 mm) incision is made in the inguinal region of anesthetized animals, the lymph node is localized and immobilized with forceps, and a volume of 10-20 &#956;l of the vaccine is injected under visual control. The incision is closed with a single stitch using surgical sutures. Mice were vaccinated with plasmid DNA, RNA, peptide, protein, particles, and bacteria as well as adjuvants, and strong improvement of immune responses against all type of vaccines was observed. The intralymphatic method of vaccination is especially appropriate in situations where conventional vaccination produces insufficient immunity or where the amount of available vaccine is limited.

Prophylactic and therapeutic vaccination often fails to stimulate strong immune responses due to week drainage of the vaccine to lymph nodes and consequently poor involvement of immune cells. By direct injection of vaccine to lymph nodes, so-called intralymphatic injection, vaccine efficacy can be strongly improved and vaccine doses can be reduced.

Fare intralenfatik immünoterapi ve Aşılama

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Alternatifi olarak dilaltı immünoterapi Akut Solunum Enfeksiyonları Karşı Koruma tetikleyebilecek

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Tıp

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Basil Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, including metabolites, lipids, proteins, and nucleic acids, several groups have evaluated either the native or recombinant versions of bEVs for their protective potency as subunit vaccine candidates. Unlike native EVs, recombinant EVs are molecularly engineered to contain one or more immunogens of interest. Over the last decade, different groups have explored diverse approaches for generating recombinant bEVs. However, here, we report the design, construction, and enrichment of recombinant mycobacterial EVs (mEVs) in mycobacteria. Towards that, we use Mycobacterium smegmatis (Msm), an avirulent soil mycobacterium as the model system. We first describe the generation and enrichment of native EVs of Msm. Then, we describe the design and construction of recombinant mEVs that contain either mCherry, a red fluorescent reporter protein, or EsxA (Esat-6), a prominent immunogen of Mycobacterium tuberculosis. We achieve this by separately fusing mCherry and EsxA N-termini with the C-terminus of a small Msm protein Cfp-29. Cfp-29 is one of the few abundantly present proteins of MsmEVs. The protocol to generate and enrich recombinant mEVs from Msm remains identical to the generation and enrichment of native EVs of Msm.

This protocol details the enrichment of native mycobacterial extracellular vesicles (mEVs) from axenic cultures of Mycobacterium smegmatis (Msm) and how mCherry (a red fluorescent reporter)-containing recombinant MsmEVs can be designed and enriched. Lastly, it verifies the novel approach with the enrichment of MsmEVs containing the EsxA protein of Mycobacterium tuberculosis.

Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Mikro-CFU Yöntemi Kullanılarak Tüberküloz Tespitinin Hızlandırılması

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

Yazar Gündemi: TB Aşı Etkinliğinin ve Antijen Sunum Analizinin Etkili Değerlendirmesi için CFU Belirlemesini Optimize Etme 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

Koruyucu etkinliği ve Pulmoner Bağışıklık Tepkisi Fare Subkutan ve Burun BCG İdaresi ardından

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)

Fare intralenfatik immünoterapi ve Aşılama

Alternatifi olarak dilaltı immünoterapi Akut Solunum Enfeksiyonları Karşı Koruma tetikleyebilecek

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi

Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi