This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].

1. FROS ile çoğaltma Engelleme <ol><li> Çoğaltma Blokaj uyaran <ol><li> Bir E. taze bir gecede kültür sulandırınız OD 600 Nm = seyreltik kompleks ortam içinde 0.01 bir teto dizi ve pKM1 18 taşıyan E. coli suşu (% 0.1 tripton,% 0.05 maya özü,% 0.1 NaCl, 0.17 M KH 2 PO 4, 0.72 MK 2 HPO 4) antibiyotik gerektiğinde seçimi için. Not: Bu sistemle uyumlu değil gibi seçim için tetrasiklin katmayın. Gerekli örnek başına 10 ml eşdeğer kültür hacmini olun. Örneğin, Şekil 1 &#39;de deney dizaynı kültür hacmi 60 ml&#39;dir. </li><li> OD 600 nm = 0.05-0.1 kadar çalkalanarak 30 ° C&#39;de büyütülmüştür. indüklenmemiş kontrol olarak görev yapar ve pKM1 gelen TetR-YFP üretimini sağlamak için kalan kültür,% 0.1 arabinoz ilave bir 10 ml lik bir numuneyi çıkarın. uyarılmamış ve uyarılmış hem de büyümeye devamkültürler. 1 saat sonra, (bakınız bölüm 2) floresan mikroskopi kullanılarak oluşturulan kültür her hücrede tek bir odak noktası olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Kaynaklı hücreler (hücre% 70&#39;den fazla, tek bir odak var) bloke teyit ise, OD 600Nm kaydetmek ve 2-D jelleri (Bölüm 3) ile analiz için bir 7.5 ml örnek almak. uyarılmamış kontrol kültüründen eşdeğer bir örnek almak. </li></ol></li><li> Çoğaltma Blokaj Releasing <ol><li> Çoğaltma blok serbest bloke hücrelerinin 10 ml&#39;lik bir numune karşılıksız indükleyici anhydrotetracycline (AT), 100 ng ml -1 ekleyin. 10 dakika boyunca 30 ° C&#39;de büyür ve hücre yoğunluğunda (1 mi), mikroskopi analizi (10 ul) ve nötr, nötr 2 boyutlu agaroz jelleri (7.5 mi) için numune almaya devam edin. </li></ol></li><li> Replizom Çöküşü uyaran <ol><li> Hücreler, dnaB TS veya dnaC ts gibi sıcaklığa duyarlı allel içeriyorsa bu deactiva gerektirirtion, 42 ° C&#39;ye kadar bloke hücreleri içeren piston hareket eder. Gerekli zaman noktalarında analiz için numune alın (ör 1 saat inkübe edildikten sonra). Hücreler, 1 saat boyunca 42 ° C&#39;de inkübe sonra, 10 dakika boyunca (Şekil 1 e bakınız) 30 ° C&#39;de hücreleri kaydırır. Not: Hücreler yeniden analizi için 30 ° C itilebilir. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig1.jpg" /> Şekil 1:. FROS Çoğaltma Blok ve Yayın Deneysel Prosedür Bakış E. teto dizilerini taşıyan E. coli suşu 30 ° C&#39;de yetiştirilir. Hücreler 0.05 yukarıda bir OD 600Nm ulaştığınızda, TetR-YFP üretim arabinoz ile indüklenir (ARA,% 0.1). indüklenmemiş hücrelerin bir alt 30 ° C &#39;de kontrol olarak hareket artmaya devam ediyor. 2 saat (2.1) - ile indüklenen hücre numunesi sonra 1 floresan mikroskobu ile analiz edilir. Çoğaltma iseengellenmesini teyit numuneler test tüpleri (bakınız 3.1) ile gösterilen 2-B jel analizi için ve (isteğe bağlı) canlılık testi için alınır. Çoğaltma blokaj (AT; 0.1 ug / ml) anhydrotetracycline ile temizlenebilir ve hücreler 10 dakika sonra incelendi. Hücreler (örneğin dnaB ts) bir sıcaklığa duyarlı allel taşıyan, bu uygun analiz için 42 ° C&#39;ye kadar bloke hücrelerin kaydırılarak inaktive edilebilir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2. Floresan Mikroskopi <ol><li> bir mikroskop lamı üzerine erimiş agaroz (su içinde% 1), 500 ul pipetleme bir agaroz pedi hazırlanması; Agaroz katılaşır hemen önce lamel kaplaması. kadar gerekli 4 ° C&#39;de ıslak dokularda slayt (ler) saklayın. </li><li> Agaroz katılaşmış sonra, agaroz ped ve pipetle bakteriyel 10 ul lamel kaldırmakpedinin merkezi üzerine kültür gözlem esnasında hücrelerin hareket etmesini önlemek için. örneği (yaklaşık 5 dakika) kuruduktan sonra, lamel değiştirin. kapak kayma üzerine daldırma petrol bir damla koyun ve optik altında slayt yerleştirin. </li><li> 100X büyütmede Faz Mikroskobu kullanılarak Hücreler gözünüzde canlandırın. <ol><li> görüntüleme yazılımı içinde Edinme iletişim kutusunda, 100 milisaniye pozlama süresini ayarlayın. Edinme seçerek görüntüyü yakalamak. sahne hareket etmiyor. Edinme iletişim kutusunda, Kamera bağlantılı Dış Shutter için aydınlatma olarak YFP seçin. 1000 msn MARUZ KALMA saatini ayarlayın. sahne ışık kapatın. Edinme seçerek floresan görüntü yakalamak. Not: Zaman kullanılan ışık kaynağı, mikroskop ve kamera bağlı olarak değişebilir. </li><li> faz ve floresan görüntüleri bindirmek için, Renkli Ekran menüsü içinden birleştirin seçin. Renk iletişim kutusunda, birleştirin yeşil bileşen ve bl olarak faz görüntüsü olarak YFP görüntü seçinUE bileşeni. birleştirmek renk üzerine tıklayın. nüfus başarıyla hücrelerin çoğunluğu hücre başına bir odak olup olmadığını kurarak çoğaltma bloke eden olup olmadığını belirlemek. Not: Görme EYFP üretim farkı tanımlamak için eklenen arabinoz olmadan denetimi bir örnek karşılaştırılması yararlıdır. </li></ol></li></ol> 3. DNA Ekstraksiyon / Agaroz Fişler <ol><li> adım 1.1.3 ve 1.2.1 7.5 ml kültür örnekleri, sodyum azid (% 0.1 son konsantrasyon) eklenir. en az 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Not: Sodyum azit son derece zehirlidir. işe başlamadan önce Güvenlik Bilgi Formu&#39;na başvurunuz ve tüm güvenlik önlemlerini okuyup anlayana kadar idare yoktur. </li><li> 10 dk pelet hücreleri için hücreler 5000 xg santrifüj. Süpernatant atılır ve Pett IV (PIV), tampon 200 ul pelletini (10 mM Tris: HCl (pH 8.0), 1 M NaCI). Mikrosantrifüj (13, 2 dakika boyunca 000 x g) hücreler pelet. disüpernatant scard. Bu aşamada, -20 ° C &#39;de peletler ayrıca işlem veya mağazasında. </li><li> 50 ° C&#39;de 50 ul PIV ve yerinde en düşük hücre yoğunluğunda tekrar süspansiyon hücreleri. Nihai hücre yoğunluğu her tüp içinde aynı nedenle diğer tüm numuneler için, PIV hacimleri ayarlayın (50 ul yeniden süspanse örneğin Numune 1 (OD 600Nm = 0.128); Numune 2 54 ul içinde yeniden süspanse (OD 600Nm = 0.138)). <ol><li> PIV taze hazırlanmış% 0.8 agaroz çözeltisi eşit hacimde ilave edin (nihai konsantre% 0.4;., Örneğin Örnek 1 ila 50 ul, Örnek 2 54 ul). Numuneler, agaroz ve PIV katılaşmayı önlemek için 50 ° C&#39;nin üzerinde olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Uygun bir cam su itici veya silikon solüsyonu 40 ul bir mikroskop lamı davranın. kuruyana kadar bir doku ile slayt ovun. Not: Bu işlem, önceden yapılabilir ve işlenmiş Slaytlar, oda sıcaklığında uzun süreli saklanabilir. </li><li> t 20 ul damla yerleştirinO slayt hücre / agaroz süspansiyonu yarım küre olan fişleri üretmek. Not: (50 ul PIV içinde yeniden süspanse) İlk örnek bir slayt 5 fişleri üretecek. </li><li> Fişler katılaşan zaman, bir mikrofüj tüpü içine yavaşça kaydırıp 1 ml hücre lisis tamponu (10 mM Tris-HCI [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA),% 0.2 sodyum deoksikolat,% 0.5 ekleme N-loroilsarkosin sodyum tuzu (Sarkosyl), 100 ug ml - 1 lizozim, 50 ug mi 1 - RNaz A). 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Hücre liziz tamponunu çıkarın ve 1 ml EDTA / sarkosil / Proteinaz K (ESP) çözeltisi (0.5 M EDTA,% 1 N-loroilsarkosin sodyum tuzu (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 proteinaz K) ilave edilmektedir. bir gecede ya da fişler şeffaf olana kadar 50 ° C&#39;de inkübe edin. ikinci bir gece boyunca inkübasyon gerekli ise, yaklaşık olarak 18 saat sonra, taze tampon ESP çözeltisi değiştirin. </li><li> KaldırESP tampon ve her bir yıkama ile 30 dakika dengeleme sağlayan 12 ml Tris-EDTA (TE) tampon çözeltisi (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8.0) fişler 5 kez yıkayın. 1 ml TE tamponu içinde 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 4. Nötr-nötr 2 Boyutlu Jel Elektroforez <ol><li> yeni bir mikrofüj tüpüne adım 3.8 arasında bir agaroz fiş aktarın ve sınırlayıcı enzim tamponu (1 x konsantrasyon) 150 ul ilave edin. Kısıtlama enzimi 25-100 birimleri ekleyin (EcoRV örneğin, 60 ünite; () Şekil 3A bakınız). 6-8 saat boyunca 37 ° C &#39;de özet. </li><li> 4 ° C &#39;de, yaklaşık 25 x 25 cm&#39;lik bir jel tepsisine 1x Tris / borat / EDTA (TBE) ve% 0.4 agaroz jeli (300 mi) dökün. yaklaşık kuyu tıpanın çapı ile aynı genişlikte yapmak için bir tarak yerleştirin. Jel ayarlandığında, tarak kaldırmak ve oda sıcaklığına jel taşıyın. </li><li> t kuyunun kenarına fiş düz slayt konumlandırma, bir kuyuya sindirilmiş agaroz fişleri birini SlideO DNA jel girecek. her iki yuva içine aynı şekilde tek bir düzensiz yerleştirin. </li><li> pozisyonunda fişleri mühür kuyulara agaroz erimiş% 0.4 Pipet. </li><li> boş oyuk yükleyin 1 kb DNA merdiveni, daha merdiven ve numuneler arasında bir boşluk bırakarak, ve oda sıcaklığında bir gece boyunca 1 x TBE içinde (16 saat, 55 V) jel üzerinde çalıştırıldı. </li><li> 20 dakika için etidyum bromid (0.3 ug ml-1) ihtiva eden bir su banyosu içinde jel leke. Not: Etidyum bromür güçlü bir mutajen ile bir toksin olarak kabul edilir. işe başlamadan önce Güvenlik Bilgi Formu&#39;na başvurunuz ve tüm güvenlik önlemlerini okuyup anlayana kadar idare yoktur. </li><li> Hatta sokağın her iki tarafında aşırı agaroz dahil en aza indirerek, kesme, bir uzun dalga UV transilluminator&#39;de ile DNA görselleştirmek ve düz her kulvar parçasını kesip. Not: Söz konusu parçacık, 5.5 kb Örneğin, approximat 5 kb DNA fragmanları dahil etmek için bir 7.5 cm fragmanı kesipely 12 kb (Şekil 3A bakınız). </li><li> DNA göçünü yönüne 90 ° &#39;de, bir jel tepsisine eksize jel şeridi yerleştirin. Not: 3 jel fragmanları İki sıra 25 x 25 cm 2 jel tepsisine sığabilir. Jel hatlarının ilk satırı 12,5 cm tepsi, ikinci sıra üst kısmında. </li><li> İkinci boyut jel (0.3 ug ml -1 etidyum bromür ile 1x TBE içinde% 0.9) için agaroz 300 ml hazırlayın. Agaroz, 50 ° C&#39;ye kadar soğutulur, konumlarını katılaşmaya jel dilimlerinin yaklaşık erimiş agaroz pipetle. Jel dilimleri ile en az seviyede derinliğe kadar tepsiye kalan agaroz dökün. </li><li> Jel bir kez katılaştınldıktan sonra DNA, yaklaşık 10 cm göç kadar, 220 V&#39;de 0.3 ug ml -1 etidyum bromür ihtiva eden 1 x TBE içinde 4 ° C&#39;de Electrophorese. 4 saat 5.5 kb fragmanı için yeterli ama daha küçük bir fragman daha az zaman gerekir: unutmayın. </li><li> Genomik DNA, mevcut u bloklar tüketim(Şekil 3C) görünmez DNA&#39;yı içerecek şekilde üstünde jel içeren, bir metal cetvel kenarını şarkı. </li></ol> 5. Southern hibridizasyonu <ol><li> Çözelti Hazırlama <ol><li> Depürinasyon tamponu (0.125 M HCl çözeltisi) hazırlayın. Not: Bu tampon yeniden kullanılabilir ve en fazla 1 ay boyunca oda sıcaklığında stabil olan edilebilir. </li><li> Denatürasyon tamponu (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) hazırlayın. Not: Denatürasyon tamponu kez tekrar edildi ve oda sıcaklığında 3 aya kadar stabildir edilebilir. </li><li> Nötralizasyon tamponu (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris) hazırlayın. HCI ile pH 7.5&#39;e ayarlayın. Not: Nötralizasyon tamponu kez tekrar edildi ve oda sıcaklığında 3 aya kadar stabildir edilebilir. </li><li> adım 5.2.4 ve 5.2.6 kullanılmak için - 10x Tuzlu sodyum sitrat (SSC), tampon (8, 0.15 M tri-sodyum sitrat, 1.5 M NaCl, pH 7) hazırlayın. Bu tampon, (aşama 5.2.9 kullanım için), bir 2X SSC stok yapmak. Not: 10x SSC ve 2x SSC3 ay boyunca oda sıcaklığında stabil yeniden. </li><li> Modifiye Church ve Gilbert, hibridizasyon tamponu 19 hazırlama (0.5 M fosfat tampon maddesi [pH 7.2],% 7 (ağırlık / hacim) sodyum dodesil sülfat (SDS), 10 mM EDTA, W). kullanmak için önce iyice erimesi için 65 ° C&#39;de bırakın. </li></ol></li><li> transfer <ol><li> bir rocker ya da orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 10 dakika boyunca depürinasyon çözeltisi içinde kesilmiş jel blokları durulayın. agaroz blokları zarar görmesini önlemek için düşük ajitasyon hızı tutun. </li><li> 30 dakika denatürasyon tamponu ile kısaca damıtılmış su ile ve daha sonra jel blokları durulayın. damıtılmış su içinde kısa bir süre tekrar durulama ve daha sonra, oda sıcaklığında yumuşak çalkalama ile 30 dakika süreyle nötralizasyon tampon jel blokları inkübe edin. </li><li> jel (lar) tam boyutuna bir naylon zar kesilir. Gelecekteki adımlarla membran yönlendirmede yardımcı olmak için sağ üst köşede bir nick kesin. Not: İki jel blokları (6 adet) bir zar üzerinde görülebilir. </li><li> Bir tr içine yeterince 10x SSC dökünBugün o gecede kurumasına olmaz ki. yaklaşık 5 cm tampon seviyesinden bir platform oluşturmak. platformda 10x SSC ve yeri ile 3MM kromatografi kağıdı 3 yaprak doyurabilecek. membran jel sığacak kadar yeterince uzun süre her iki uçta da tampon dalmış ve geniş bir şekilde kromatografi kağıdı kesin. </li><li> doyurulmuş kromatografi kağıdı üzerine jel (ler) yerleştirin. by-pass transferi sırasında jel tampon önlemek için plastik örtü ile jel Çerçeve. Dikkatle jel (ler) üstünde kesme zarı yatıyordu. nazikçe zarından bir şişe veya serolojik pipet haddeleme zar ve jel arasındaki hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> membranın aynı boyutta 3MM kromatografi kağıdı üç yaprak kesin. 10x SSC ile kromatografi kağıdı yaprak Doymuş ve membran üstüne yerleştirin. oluşmuş herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Yığın kağıt katı bir destek tarafından takip kurutma kağıdı üstünde en az 5 cm yüksekliğinde havlular (beğenme23 x 16 cm membran için 1 kg ximate ağırlığı). Transfer gece boyunca ilerlemeye izin verin. </li><li> Zara DNA çapraz bağlanması için UV 1.200 J / m 2 membran (DNA yüzü yukarı) Açığa. Bu adımın öncesinde durulama yapmayın. </li><li> leke görüntülerde yüksek arka plan önlemek için 2x SSC iyice membran durulayın. 4 ° C&#39;de plastik wrap ve mağaza sarın, melezleme için hemen leke kullanın (5.3) veya oda sıcaklığında kurutun. </li></ol></li><li> melezleme <ol><li> Onceden hibridizasyon fırın ve 55 ° C şişeler. </li><li> 100 ug ml ilave -1 sığır serum albümini (BSA) ve 10 ug mi -1 spesifik olmayan DNA (örneğin somon sperm DNA&#39;sı) önceden ısıtılmış melezleme tamponu. </li><li> Hibridizasyon tamponu da kaplaması için zar sarıldığı esnada yukarı bakacak şekilde zarın, DNA&#39;ya bağlı yüzü örgü naylon Benzer boyutta kare üzerine leke yerleştirin. Uzun kenarı boyunca leke yuvarlayın. Kaymakleke / Bir melezleşme şişe içinde örgü. Leke göz önüne sermek için önceden ısıtılmış melezleme tamponu uygun miktarda (örneğin, bir 23 x 16 cm2 zar 30 mi). </li><li> 1 saat süre ile, şişe döndürme önceden ısıtılmış bir fırın içinde inkübe edin. </li><li> 13 ul lik bir hacim oluşturmak için Klenow fragmanı ve H2O için tampon, ilgilenilen bölgeye saflaştınlmış PCR ürünü, homolog 50 ng rastgele heksamer primerlerinin 150 ng karıştırılarak prob hazırlayın. 3 dakika sonra buz üzerine hemen yerleştirin kaynatın. 1 mM dCTP / dGTP / dTTP karışımı 1 ul, alfa fosfat- (α 32P-dATP) hakkında Klenow fragmanı (5U) ve 50 uCi deoksiadenozin 5&#39;-trifosfat radyoetiketlenmiş 1 ul ekle. </li><li> 1 saat süre ile, oda sıcaklığında inkübe edin. mM dNTP karışımı 1 1 ul ve Klenow fragmanının 1 ul ekle. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkalayın. </li><li> 5 dakika boyunca sonda kaynatın ve melezleme tüpleri hemen ekleyin. döndürme ile, 55 ° C&#39;de gece boyunca hibridize olur. </li><li> pr Durusuzardan obe. Not: prob kez yeniden yapabiliyor. </li><li> Önceden ısıtılmış, düşük sıkılık yıkama tamponu içinde kısa bir süre membran yıkayın (2X SSC,% 0.1 (a / h) SDS). Taze düşük sıkılık yıkama tamponu ilave edin ve rotasyon ile 55 ° C &#39;de 5 dakika süreyle inkübe edilir. Tekrar et. </li><li> Orta sıkılık yıkama tamponu içinde iki kez yıkayın (1 x SSC,% 0.1 (a / h) SDS) dönüşü ile 55 ° C&#39;de 10 dakika karıştırıldı. </li><li> Yüksek sıkılık yıkama tamponu içinde iki kez yıkayın (0,1 x SSC,% 0.1 (a / h) SDS) dönüşü ile 55 ° C de 5 dakika karıştırıldı. </li><li> fazla sıvıyı çıkarmak için doku ile membran ve dab çıkarın. Önceden boşluklu depolama fosfor ekrana sahip poz kaset plastik wrap ve yerde hiçbir kalan nem yoktur sağlanması plastik wrap sarın. kaseti kapatın ve fosforlu bir görüntü cihazını kullanarak görselleştirme için en az 2 saat boyunca maruz kalmaktadır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+stalling+at+natural+impediments.">Replication fork stalling at natural impediments.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).</li><li>Gupta, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+complexes+are+the+primary+sources+of+replication+fork+pausing+in+Escherichia+coli.">Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).</li><li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro.">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).</li><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+fork+dynamics+in+Escherichia+coli+DNA+replication.">Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).</li><li>Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+stalling+and+cell+cycle+arrest+in+UV-irradiated+Escherichia+coli.">Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).</li><li>Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+replication+reduces+RecA-mediated+repair+of+UV-damaged+plasmids+introduced+into+competent+Escherichia+coli.">Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli.</a> Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).</li><li>Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ruvA+and+ruvB+mutants+specifically+impaired+for+replication+fork+reversal.">ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal.</a> Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).</li><li>Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+Escherichia+coli+chromosome+arms+locate+to+separate+cell+halves.">The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves.</a> Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).</li><li>Lau, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+replicating+Escherichia+coli+chromosomes.">Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes.</a> Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).</li><li>Gordon, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+and+low+copy+plasmid+segregation+in+E.+coli:+visual+evidence+for+distinct+mechanisms.">Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms.</a> Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).</li><li>Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+controlled+Escherichia+coli+replication+fork+stalling+and+restart+at+repressor-bound+DNA+in+vivo.">Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo.</a> EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).</li><li>Payne, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+blockage+by+transcription+factor-DNA+complexes+in+Escherichia+coli.">Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+replication+origins+on+ARS+plasmids+in+S.+cerevisiae.">The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae.</a> Cell. 51 (3), 463-471 (1987).</li><li>Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+UV-induced+replication+intermediates+in+E.+coli+using+two-dimensional+agarose-gel+analysis.">Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+replication+fork+regression+and+processing+in+Escherichia+coli.">DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli.</a> Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).</li><li>Mettrick, K. A., Grainge, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+blocked+replication+forks+in+vivo.">Stability of blocked replication forks in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Church, G. M., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequencing.">Genomic sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).</li><li>Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+process+stalled+replication+forks.">Multiple pathways process stalled replication forks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).</li><li>Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+proteins+and+rescue+of+arrested+replication+forks.">Recombination proteins and rescue of arrested replication forks.</a> DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).</li><li>Carl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+with+temperature-sensitive+synthesis+of+DNA.">Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA.</a> Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).</li><li>Nawotka, K. A., Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoretic+method+for+mapping+DNA+replicons.">Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons.</a> Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).</li><li>Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+psoralen+interstrand+cross-links+from+DNA+of+Escherichia+coli:+mechanism+and+genetic+control.">Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control.</a> J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo...

DNA replikasyonu sırasında, replizom ilerlemesini bozan DNA engellerle karşılaşır. DNA lezyonları ve boşluklar da dahil olmak üzere hasar yanı sıra anormal yapılar 1 geçmeden gelen replizom önleyebilir. Son zamanlarda, DNA bağlanmış proteinler Çatal ilerlemesini 2 çoğaltma engel en yaygın kaynağı olduğu bulunmuştur. Bir nükleoprotein bloğu ile replizom karşılaşmasını izleyen olayların bilgisi önceden bilinen bir yerde canlı bir hücrenin kromozomu böyle bir blok ikna etmek yetersizlik ile sınırlı kalmıştır. In vitro analizi kinetik davranışları anlayışımızı arttırmıştır bir nükleoprotein tıkanması 3, hem de replizom kendisinin 4,5 mekanistik ayrıntıları karşılayan etkin replizom arasında. Çoğaltma tamir mevcut anlayış genelde in vivo 6-8 plazmid DNA kullanılarak zararlı madde olarak UV ile yürütülen ve incelenmiştir </s&gt; Yukarı. Bu genel olarak bu çalışmalardan anlaşıldığı edilebilir bir in vivo nükleoprotein blok karşılaştıktan sonra çoğaltma blok belirgin bir neden dolayı onarım yolları olan moleküler olaylar değişiklikler yine de orada olup, DNA onarımında yer alan proteinleri olabilir iken belirlenecektir. Burada, bir nükleoprotein blok Floresan Baskılayıcı Operatör Sistemi (FROS) kullanarak kromozomun belirli bir konuma kurulacak sağlayan bir sistem açıklanmaktadır. Biz E. bir yük kullanmaktadır 9. kromozomun içine dahil 240 TETO siteleri bir dizi olmuştur coli. Dizisi içindeki her bir teto Alanı dizi içindeki RecA-aracılı rekombinasyon önleyerek dizinin kararlılığını arttırmak için çevreleyen bir 10 bp rastgele dizisine sahiptir. Bu dizi, ve bunun varyasyonları, orijinal olarak E. anlamak için kullanıldı E. coli kromozom dinamikleri 10,11 ama sonra Preve adapte edildint in vivo çoğaltma 12. Dizi stabil bir şekilde muhafaza edilmesi ve TetR 10,12 bağlı, çoğaltma çatal% 100&#39;e yakın bloke bulunmuştur. 22 Yer replikasyon% 90 engellemek için yeterli olduğu gibi, bu daha kısa dizi in vivo 13 daha az etkili olmasına rağmen, in vitro içindeki lacO dizinin kullanımı, birkaç şekilde bulmuştur. Bir nükleoprotein tıkanma oluşturmak için diziyi uyarlamak için, bastırıcı protein yüksek o zaman bir barikat oluşturmak için dizinin bağlanır optimize koşullar altında aşırı üretilmektedir gerekir. Tet bastırıcısına bir floresan etiketli varyantı kullanıldığında bloke oluşumu, ve bunu takip eden serbest bırakma, floresan mikroskobu kullanılarak izlenebilir. Her hücrede replikasyon durumu tek bir odak noktası dizinin yalnızca bir kopyası hücre içinde mevcut olan ve birden fazla odak aktif replikasyon göstergesi olduğu anlamına gelir görülen odaklarının sayısı ile gösterilir. Bu aktif yenidennükleoprotein blokaj replizom dizi üzerinden devam etmek için yeterli bir operatörün bir site için TetR bağlanma afinitesini azaltan karşılıksız indükleyici ilave edilerek tersine döndüğünde komplikasyondur etkinleştirilir. represör proteini de dizinin hemen birden çok kopyası görselleştirilebilir yeterince yüksek bir afinite ile DNA&#39;ya bağlanabilen. Nukleoprotein tıkanma olayların daha karmaşık ayrıntıları nötr nötr iki boyutlu agaroz jel elektroforezi ve Güney melezleme 14-16 kullanılarak tespit edilebilir. Bu teknikler nüfusun genelinde DNA yapılarının analizini sağlar. potansiyel etkinlik sırasında biçimlenmiştir ve çoğaltma ara görüntülenebilir, unrepaired kalır. Restriksiyon enzimi ve sonda kullanılan değiştirilmesiyle, ara dizi bölgede değil çoğalma çatala 17,18 geriler, diziye de yukan sadece görselleştirilebilir.regresyon replizom ayrışma sonra gerçekleşir; lider ve geri kalmış doğmakta olan iplikçikler bir dört yollu DNA yapısına (bir Holliday kavşağı) sonuçlanan şablon ipliklerini aynı anda yeniden tavlama olarak birbirlerine şablon teller ve tavlama ayrı. Bu blok 18 ile karşılaştığında, çoğalma çatala stabil değildir olduğu gösterilmiştir, bu sistemi kullanarak. Buna ek olarak, replizom bileşenleri ısıya duyarlı türevleri daraltılmış sonra çoğaltma çatalı yeniden önlemek için kullanılabilir. bir blok kurulduğunda, streyn replizom senkron devreden ve yeniden kontrollü bir engellenmesini sağlamak için bir non-permisif sıcaklığına kaydırılabilir. Bu sıcaklık kaynaklı devreden belirli bir zamanda çöktü nüfus içindeki çatallar tüm sağlar ve replizom DNA nasıl işlendiğini, çöker ve ne re gereklidir ne olur değerlendirilmesini sağlarDNA replikasyonu işlemini başlatmak. Burada açıklanan sistemin bir avantajı, nükleoprotein blok tam olarak geri dönüşümlü olduğunu; Bu nedenle, nükleoprotein bloktan kurtarmak için hücrelerinin yeteneği takip edebilmektedir. hücrelere anhydrotetracycline eklenmesi çoğaltma çatal ile devam sağlayan, sıkı bastırıcı bağlanmasını rahatlatacak ve hücre canlılığı yeniden. tıkanma kabartma 5 dakika sonra nötr nötr iki boyutlu, agaroz jel elektroforezi ile görselleştirilmiştir ve 10 dakika içinde mikroskop ile olabilir. Ayrıca, canlılık analizi çoğaltma tıkanıklık kurtarmak ve çoğalırlar devam etmek zorlanma yeteneğini ortaya çıkarabilir. Burada tarif edilen deney prosedürü kullanılan suşlar genetik arka planı değiştirerek, blokaj bu tip bakım yolları açıklanacaktır olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16922</td>
			<td>Growth media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>Growth media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92144</td>
			<td>Growth media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Growth media component; Potassium buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>Growth media component; Potassium buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>For induction of TetR-YFP production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37919</td>
			<td>Release of replication bloackage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioskop 2 Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>452310</td>
			<td>Visualization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eYFP filter set</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>41028</td>
			<td>Visualization of YFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca-AG</td>
			<td>Visualization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160; Software (Molecular Devices)</td>
			<td>SDR Scientific</td>
			<td>31282</td>
			<td>Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td>For agarose plugs and gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Glass Water Repellent (Rain-X)</td>
			<td>Autobarn</td>
			<td>DIO1470</td>
			<td>For agarose plug manufacture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC103157P</td>
			<td>TE, TBE buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diaminetetraacetic acid</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA180</td>
			<td>0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Bacteriostatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>TE buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Cell lysis buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5125</td>
			<td>Cell lysis and ESP buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>Cell lysis buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>6300</td>
			<td>Cell lysis buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>AM0706</td>
			<td>ESP buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell Model 192 Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704507</td>
			<td>Electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator 2000</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708110</td>
			<td>Visualization of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610433</td>
			<td>Visualization of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PROL20185.360</td>
			<td>TBE component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-XL nylon memrbane</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN203S</td>
			<td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3MM Whatman chromatography paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>3030690</td>
			<td>Southern blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-2000 Hybrilinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0031-01/02</td>
			<td>Crosslinking of DNA and hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from salmon sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31149</td>
			<td>Hybridization buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Denaturation buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PROL27833.363</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>227</td>
			<td>Wash buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Hybridization buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primers</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow fragment</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate-32P-ATP</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>BLU502A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage Phosphor Screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GEHE28-9564-76</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9558-09</td>
			<td>Visualization of blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization bottle</td>
			<td>UVP</td>
			<td>07-0194-02</td>
			<td>35 x 300mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system

sıkıca bağlı proteinler çeşitli lezyonlar dahil olmak üzere, DNA üzerindeki engeller, ciddi hücre çoğaltma makine ilerlemesini inhibe edebilir. Bir replizom duraklaması çoğaltma çatal yıkılışına yol açan, kromozomdan, ya kısmen ya da bütünüyle onun ayrışma yol açabilir. Bu çöküşün kurtarma hücresine doğru tam kromozomal çoğaltılması ve daha sonra bölmek için bir zorunluluktur. çoğaltma DNA çatal geri yükleme ve izin gerçekleşecek çöküş meydana geldiğinde, bu nedenle, hücre gelişti çeşitli mekanizmalar yüksek sadakat ile tamamlanacak. Daha önce, bakterilerden bu çoğaltma onarım yolları bilinen siteye lokalize olmama dezavantajına sahiptir, UV hasarı, kullanılarak incelenmiştir. Bu yazıda durdurduklarını ve replikasyon çöküşü fo uyarabilir bir siteye özgü protein bloğu oluşturmak için bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sistemi (FROS) kullanan bir sistemi açıklamaktadırEscherichia coli RKS. replikasyon durumu, flüoresans mikroskopisi ve DNA replikasyon ara maddeleri kullanarak tek bir canlı hücrelerde görselleştirilebilir PROTOKOLLERİN detay 2 boyutlu agaroz jel elektroforezi ile analiz edilebilir. Replizom bileşenleri (örneğin DnaBts) sıcaklığa duyarlı mutantlar çoğaltma çatal senkron çöküşü uyarılması için sisteme dahil edilebilir. Bundan başka, bu işlemlerde söz konusu rekombinasyon protein ve helikazlar rolleri bu sistem içinde, genetik Knockouts kullanılarak incelenebilir.

FROS canlı hücreler 12,18 görselleştirilebilir çoğaltma ara maddeleri sağlayan uyarılabilir, sahaya özel nükleoprotein bloktur. Hücreler numune için genel bir deney tasarımı, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Genetik temelinde numune alma ve varyasyonlar ve zamanlaması, böyle bir bloğun onarım çalışmaları için çok yönlü bir sistem tercih. Şematik bir önceki 18 kullanılan bu tür dnaB TS ve TS dnaC olar...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System at JoVE.com

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran<i&gt; E. E. coli</i&gt; Bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sisteminin Kullanılması

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

inducing-site-specific-replication-blockage-e-coli-using-fluorescent

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

8.9K Görüntüleme.  University of Newcastle. We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Video: Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Biyoloji

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

Site Özel Recombinase (SSR) Teknoloji İlkeleri

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

A ile Üretilen Kompleksi Antibiyotik Eritromisin Featuring Mantık, Deneysel Merdivenleri ve Heterolog Doğal Ürün biyosentezi Potansiyeli<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Site Özel Recombinase (SSR) Teknoloji İlkeleri

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli

Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi

Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

A ile Üretilen Kompleksi Antibiyotik Eritromisin Featuring Mantık, Deneysel Merdivenleri ve Heterolog Doğal Ürün biyosentezi Potansiyeli

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama