Name: layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

Aljinat Disklerin Oluşumunda 1. Hazırlık <ol><li> % 4 Hazırlama (a / h) 37 ° C su banyosu içinde, eklenmiş kalsiyum klorid veya magnezyum klorid ve yer olmadan 1x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin aljinat çözeltisi. aljinat çözeltisi konsantrasyonları değişebilir, ancak 1-4% (w / v) aljinat çözeltileri önerilir. </li><li> İstenen bir hücre tipi için sıcak bir hücre kültür ortamı baz ile 1 (ör Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı).: 1 oranında aljinat çözeltisi karıştırın. Alginat konsantrasyonu orjinal konsantrasyonunun yarısı, yani.,% 2 (w / v). Steril 0.2 mikron naylon şırınga filtreleri kullanarak aljinat / medya çözümü sterilize edin. </li><li> (- 300 ml ~ 200) kalıp daldırın kadar çözelti steril su içinde, steril 102 mM kalsiyum klorür dihidrat banyo hazırlayın. </li><li> Steril &quot;jel oluşumu kalıp&quot; alüminyum levha içinde x 3 a 3 (6 mm çap x 3 mm uzunluğunda silindirik kuyu toplayın, bkz <strong&gt; Şekil 1) ve omurun (Alt: Bir alüminyum plaka x 3 3, en alüminyum plaka x 3, bir 1.5) ve aşağıdaki şekilde kalıplar hazırlamak: <ol><li> Yaklaşık 1 dakika kalın filtre kağıdı (kurutma filtre kağıdı) ve alt ve üst endplate&#39;lerin boyutları hücre microsieve zarı (10 mikron gözenek boyutu) kesin ve doyana kadar kalsiyum klorür banyosuna koyun. Eğer arzu edilirse, kullanımdan önce, 30 dakika boyunca otoklavda veya ultraviyole ışık ile kalın bir filtre kağıdı ve microsieve membran sterilize edin. </li><li> Ayar kalıp yapısının bir yarısının (alt yarısı). <ol><li> aşağıdaki sırayla birbiri üstüne aşağıdaki öğeleri yerleştirin ve steril bir spatula kullanılarak pürüzsüz: büyük uç plakası, kalın bir filtre kağıdı ve microsieve membran (3 inç x 3 inç olarak). </li><li> Ters çevirin ve aşırı kalsiyum klorür çözeltisinin kaybını sağlamak için kağıt havlu yığını üzerine kalıp basın. </li><li> c üstünde silindirik kuyuları ile &quot;jel oluşumu kalıp&quot; koyunell microsieve zarı ve hafifçe sol ve sağ tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak iki tarafta birbirine kalıp tutturmak. Tamamen sonra kuyuları kapsayacak şekilde (in x 3 1.5) üst plak için yeterli odadan emin olun. </li></ol></li><li> Set-up kalıp yapısının ikinci yarısında (üst yarısı). <ol><li> aşağıdaki sırayla birbirlerine tepesinde aşağıdaki öğeleri koyun ve pürüzsüz: küçük uç plakası, kalın filtre kağıdı, microsieve membran. </li><li> Ters çevirin ve aşırı kalsiyum klorür çözeltisinin kaybını sağlamak için kağıt havlu yığını üzerine kalıp bu yarım basın. Şu anda bağlayıcı klipleri kullanarak kalıp bu yarısını tutturmak yok. </li></ol></li></ol></li><li> Kültür hücreleri olarak üreticinin talimatlarına göre önerilir. katmanlı aljinat hidrojeller gömmek için istenen hücreler hasat. Tavsiye hücre yoğunluğu 1 - 2 x 10 6 hücre / mL, ancak bu arzu edilen deneyler bağlı olarak değişebilir. Not: Bu yöntemi kullanırkenfarklı hücre tipleri ile katmanları yapmak için, katman paralel olarak kültür iki hücre tipleri emin olun. Mezenkimal kök hücreler (MSC&#39;ler) 1 x 10 6 hücre bir hücre yoğunluğunda tohumlandı / ml, aşağıdaki protokol için bir örnek olarak kullanılacaktır. gerektiği gibi hücre sayısı ve disk numarası deneyler için ölçeklendirilebilir. <ol><li> Bazal üreme ortamı, 10 ml (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal sığır serumu,% 2 L-glutamin, 1 5000 hücre / cm2 - bir ya da iki hafta önce 3.000 hücre yoğunluğunda, tohum mezenkimal kök hücreleri gömme T-75 şişelerinde% temel olmayan amino asitler,% 1 penisilin / streptomisin). </li><li> 3 gün ve hücreler, 80 kadar bazal üreme ortamı 10 ml yerine - - her 2 harcanan Ortamı çıkarın% 90 konfluent. </li><li> ilave kalsiyum klorür veya hücreleri durulama magnezyum klorür olmadan 1x Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu tuzlu 3 ml, hücreler hasat harcanan ortamı çıkarın ve pipet için. pipet,% 0.25 Try 3 ml bu çözüm çıkarınT-75 şişelerinde büyüyen hücreler üzerine psin-EDTA ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. Bazal büyüme ortamının 9 ml - hücreleri yapışık yüzeyden kaldırılır sonra 6 ekleyin. </li><li> Santrifüj MSC&#39;ler, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de, süpernatanı havalandırın, ve 1 ile yeniden askıya - bazal üreme ortamı, 5 ml. Cihaz yönergeleri kullanarak hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Santrifüj aynı koşullar kullanılarak, toplam hücre yeniden süspanse 1 x 10 6 hücreleri çıkarın ve süpernatant aspire. </li></ol></li></ol> Hücre Tohumlu Aljinat Disklerin 2. oluşumu <ol><li> 1 x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğu elde etmek için steril aljinat / ortam çözeltisi 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. Hücreler uygun olarak karıştırıldığı zaman hücre alginat karışımı görünüşte homojen bulutlu olacaktır. </li><li> Pipet kalıbın alt yarısında, altı 6 mm çap x 3 mm uzunluğunda kuyulara hücre alginat karışımı 130 ulkabarcıkları yaratmak için değil, böylece damla damla inşa. Hafif dışbükey menisküsün her bir kenarında üzerinde görünür olmalıdır. </li><li> Dikkatle steril bir spatula kullanarak kalıp yapısının üst yarısını pürüzsüz ve hücre microsieve zarı kuyularının üstünde olacak şekilde, ters çevirin. Kalıp hücresi ve tamamen aljinat karışımı içeren kuyuları kapsayacak şekilde emin olun, kuyu üstüne inşa yerleştirin. </li><li> ortasına bastırarak ederken, yüklenen kalıp yapı kaldırın ve bağlayıcı kalıp yapısının üst ve alt yarılarını tutturmak için kalan iki taraf (alt ve üst) klip. Hücre-aljinat çözümleri güvenli şu anda kuyularda sokuldu edilmelidir. </li><li> Tüm yapı altında olduğundan emin, 102 mM kalsiyum klorür banyosuna bağlanmış kalıp yapı daldırın. 90 dakika için oda sıcaklığında, hücre kültürü kaputu inkübe edin. </li><li> 90 dakika sonunda, 102 mM kalsiyum klorür kalıp yapı kaldırmaHücre kültürü kaputu kağıt havlu yığını üzerinde banyo ve yer. Dört bağlayıcı klipleri çıkarın ve kalıp yapının iki yarısını ayırın. kuyularda oluşan hidrojeller kabarcıkları olmamalıdır ve tamamen kuyu doldurmalıdır. </li><li> Bir spatula kullanarak, dikkatli dikkatli gevşetin ve hidrojeller dışarı kama hidrojeller içeren kuyuların kenarına iz. Kalıp yapısı arasında hidrojeller ayrılmasından sonra, doğrudan kalsiyum klorür ve magnezyum klorür ile 1x Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu bir banyo içine hidrojeller bırakın. 5 dakika - 1 için aşırı kalsiyum klorür solüsyonu yıkayın tamamen jelleri örtün. </li><li> Tamamen hidrojeller kapsayan arzu edilen çanak bazal büyüme ortamı çözeltisine (örn., 6 havuzlu plakalar) içine hidrojeller aktarın. 37 ° C&#39;de hücre kültürü inkübatöründe en az 1 saat% 5 katman adımına devam etmeden önce CO2 inkübe edin. Not: hücreleri ihtiva eden hidrojeller tutulabilir3 gün - başka hücre popülasyonu ile jellerin katman kadar şu anda süresiz hücre kültür inkübatör medya değişiklikleri her 2 tamamlamış olması şartıyla, arzu edilir. </li></ol> Aljinat Disklerin 3. Katmanlama <ol><li> 1 saat inkübasyon son yarım saat süresince, toplamak ve jeller tavlamak için steril kalıpları ve solüsyon hazırlanır. <ol><li> x (bir plak için 3 (alüminyum levha içinde x 3 a 3 6 mm çap x 1.5 mm uzunluğunda kuyu) &quot;jel oluşumu kalıp&quot; yüksekliğinin kuyu yarısı olan bir kalıp sıkarak &quot;kesme kalıp&quot; hazırlayın sağ ve sol tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak alüminyum levha 3). </li><li> x ((alüminyum levha içinde x 3 a 3 9 mm çap x 3 mm boyunda kuyu) bir plak için &quot;jel oluşumu kalıp&quot; den çapı 3 mm daha geniş bir kalıp sıkarak 3 &quot;tavlama kalıp&quot; hazırlayın sağ ve sol tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak alüminyum levha 3). </li><li> ihtiva eden bir çözelti hazırlayın100 mM sodyum sitrat / 30 mM EDTA, steril su içinde (sodyum sitrat dihidrat, etilendiamintetraasetik asit tetrasodyum tuzu dihidrat). </li></ol></li><li> istenen hücre popülasyonlarının jeller çıkarın (bu örnekte, iki hMSCs diskleri) çanak ortamdan ve &quot;kesme kalıbı&quot; kuyu içine koyun. Her jel kalıp üzerinde çıkıntılı jel yarısı ile kuyu içine rahatça oturmalıdır. </li><li> Bir neşter kullanılarak, kalıp yüzeyi boyunca jel (Bu devre hidrojel kesecek) dilim. jel üst yarısını çevirmek ve açık kalıp kuyunun içine yerleştirin. jel yarısı da iyi kalıp içine rahatça sığacak, ancak şimdi her iki yarım jeller görünür kesilmiş iç yüzeyi ile kalıp yüksekliği olmalıdır. İkinci jel ile tekrarlayın. Not: Uyarı: Yalnızca iç kesim yüzeyleri katmanlı diskleri oluşturacaktır. Dış yüzeyler kullanılarak yarıları ayırma neden olur. Bu jel yüzeyi önlemek aktarılır microsieve membrandan bu doku şüphesiTavlama işleminin başarısı. </li><li> microsieve membran tavlanabilir jel yarılarının her temas halinde olduğundan emin olduktan ve tamamen bunları kapsayan, kuyu üzerine kuru hücre microsieve membranın bir parça yerleştirin. tamamen jelleri kapsayacak şekilde emin olun, microsieve membran üstüne kalın filtre kağıdı yerleştirin. </li><li> Bu doyana kadar kalın filtre kağıdı üzerine, 100 mM sodyum sitrat / 30 mM EDTA (sodyum sitrat dihidrat, Etilendiamintetraasetik asit tetrasodyum tuzu dihidrat) çözeltisi Pipet. Yaklaşık 750 | il dört kuyu için yeterlidir. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca jeller inkübe edin. Sonra, hücre microsieve zarı ve kalın filtre kağıdı çıkarın ve atın. bağlayıcı klipleri çıkarın ve kalıp açın. </li><li> Her tavlı jel, kesme yüzeyi yukarı bakacak şekilde hazırlanan &quot;tavlama kalıp&quot; olarak hidrojel bir sodyum sitrat / EDTA ile muamele edilmiş yarısını aktarın. Bu tavlanmış Kat yarısı olacakdürme. </li><li> kesim yüzeyi olduğunu bu yüzden ikinci yarı jel saygısız, zaten &quot;tavlama kalıp&quot; olarak jel üzerine (bir farklı hücre tipi içerebilir) spatula, asansör kullanma ve ikinci sodyum sitrat / EDTA ile tedavi edilen yarı jel yerleştirin zaten &quot;tavlama kalıp&quot; olarak jel kesim yüzeyi ile temasa geçin. </li><li> hafifçe aşağı iki jeller arasındaki kabarcıklarını çıkarmak için bir spatula kullanarak iki jeller basın. birbirlerinin üstüne doğrudan olduğundan emin olmak için gerekli olarak da, j eller yerleştirin. </li><li> Yavaşça &quot;tavlama kalıp&quot; kaldırma ve 30 dakika boyunca 102 mM kalsiyum klorür banyosu içinde daldırın. Bir plak ile kuyu örtmeyin. </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, &quot;tavlama kalıp&quot; kaldırmak ve kağıt havlu üzerine koyun. bağlayıcı klipleri çıkarın ve plak kalıp ayırın. </li><li> tavlanmış jeller toplamak ve kalsiyum klorid ve M ile bir 1 x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin içine yerleştirin, spatulaagnesium klorür banyo jelleri yıkamak. Daha sonra, arzu edilen bir çanak hücre kültür ortamına tavlanmış hidrojeller transferi (örneğin., 6-yuvalı plaka) kültür. </li></ol>

<ol>
	<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage.">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc:+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level.">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li><li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations.">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li><li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects.">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li><li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity.">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li><li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs.">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li><li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel.">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li><li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute.">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Vigf&#250;sd&#242;ttir, &. #. 1. 9. 3. ;. T., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation.">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li><li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds.">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li><li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures.">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).</li><li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering.">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels.">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li><li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system.">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, örneğin, örneğin, fizyolojik olarak tabakalı dokularda olanlar, kıkırdak gibi çeşitli hücre popülasyonlarının, ko-kültürlere Katmanlı aljinat hidrojel disklerin oluşturulması için bir protokol açıklar. Bu tarif edilen, kültür platformu olarak tabakalı yapılar, aynı kültür ortamı ya da yük altında maruz iki farklı hücre popülasyonlarının arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilir. Aljinat biyolojik olarak uyumlu olduğ...

Böyle eklem kıkırdağı veya intervertebral diskleri gibi sıkıştırma yükü taşıyan dokular dokuda hem biyomekanik fonksiyon ve uygun mekano-iletimi için kritik olan heterojen doku bölgeleri oluşur. Sadece hücresel organizasyonu ve farklı bölgelerde farklı işlev, ancak hücre dışı matris (ECM) ayrıca kompozisyon ve organizasyonda çeşitlidir. Örneğin, eklem kıkırdağı değişen hücre morfolojisi, mekanik fonksiyon ve ECM ile üç birincil bölgeler oluşur. Yük taşıyan sorumlulukları diferansiyel kendi ECM kurşun farklılıklar; Orta ve derin bölgeler sıkıştırma 1 yanıt esas hesap ise yüzeysel bir tabaka esas olarak, yük germe cevap yer almaktadır. Benzer bir şekilde, intervertebral disk, jel benzeri bir çekirdeği pulposus katmanlı bir halka fibrozis ile çevrilidir ve bu iki farklı alanlarda hücreler biyofiziksel uyarıcıların farklı deneyimDoku maruz ve mekanik kuvvetlere yanıt olarak, 2., Doku tabakaları içinde dokular, hücreler ve hücre-dışı matrisler Bu tip birbiriyle etkileşime girer. Böyle heterojen doku yapılarının Rekapütülasyon doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta bir sorun olmaya devam etmektedir, ve biyolojik önemi anlayışımız sınırlıdır. Bir yapının farklı hücre popülasyonlarının tabakalı dokular yanı sıra ko-kültürler analiz etmek için platformlar kültürlenmesi için bir ihtiyaç vardır. Eklem kıkırdak doku mühendisliği, iskele-az katmanlı yapılar bu dokuda 3,4 farklı katmanlarını taklit etmek çeşitli ECM yatırmak için bölgesel kondrositlerin yeteneği yararlanarak inşa edilmiştir. Ancak, katmanlı hidrojel yapıları bağımsız sağlam dokuyu oluşturmak için yeteneğinden yoksun hücre popülasyonlarının farklı tipleri etkileşimini araştırmak için bir fırsat sağlar. Örneğin, farklı popmezenkimal kök hücrelerin ulations katmanlı yapıları içinde birlikte yetiştirilebilir. Böyle katmanlı iskeleleri kondrosit ve gelişmiş doku mühendisliği için 5 mezenkimal kök hücrelerin ayırt hem kullanılmıştır. Sadece farklı hücre popülasyonu içindeki hidrojel tabakaları kültürlenen-co, ancak tek bir hücre tipi, aynı zamanda hücre 6,7 farklı yanıtlar ortaya çıkarmak için çeşitli sertlik veya biyokimyasal içeriğe sahip manipüle edilmiştir tabakalar içinde kültürlenebilir. Birçok farklı biyo materyal hidrojeller, örneğin polietilen glikol veya poli vinil alkol bazları 7-9 kullananlar gibi kıkırdak doku mühendisliği için hücre popülasyonlarının katman kullanılmaktadır. Ancak, aljinat hidrojeller ko-kültür heterojen hücre popülasyonlarının eğitim için katmanlı iskeleleri oluşturmak için basit biyomalzeme biridir. agaroz hidrojeller de kolayca oluşurken, aljinat hidrojeller kolay izin yararı vartek tek hücrelerin analizi için 3-D yapısının bir hücre olation önce 10 tarif edildiği gibi. Daha önceki çalışmalarda, iki tabakalı aljinat hidrojellerin ince tabakalar halinde oluşmuş ve bu levhalar, kesitler dilimlenmiş (örn., Bir biyopsi yumruk kullanarak) bu tür biyokimyasal içerik veya arayüzey kayma özelliklerinin 11,12 analizi için olduğu gibi özel uygulamalar için. İnce aljinat tabakaların oluşturulması için bir diğer yöntem, çoklu katmanlar içine sınıflandırması için potansiyel olarak tarif edilmiştir, ama yine de, mekanik test 13 kullanım için hidrojel değişiklik gerektirir. Burada, tekrarlanabilir hücrelerinin ko-kültür farklı popülasyonlarda kullanım için çift tabakalı alginat hidrojel diskler yaratmak için bir yöntem sunulmaktadır. Bu aljinat disk platformu birkaç avantajlara sahiptir. Öncelikle, tekrarlanabilir şekli ve küçük boyutlu bir biyopsi pu gerektirmeden gömülü hücrelerin mekanik uyarılması için elverişlinch veya birçok uygulama için hidrojel diğer fiziksel değişiklik. Buna ek olarak, hücre canlılığı, tabaka oluşturma süreci sırasında yüksek kalır ve jel oluşumu sonrası jel içinde iki hücre popülasyonlarının arasında net bir ayrım: ilk üst üste bölgesi ile görülebilir.

<table><tbody><tr><td>Alginic Acid sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965</td><td>Example. Use desired medium type</td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.02 &amp;#956;m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP510</td><td>Prepare solution in sterile water</td></tr><tr><td>Criterion Blotter Filter Paper</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Cell Microsieve Membrane (10 &amp;#956;m pore size)</td><td>Biodesign Inc of New York</td><td>N10R</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydrate</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11140050</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr></tbody></table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Şekil 1 aljinat hidrojellerin oluşumunu ve katmanlarını gösteriyor. Bu hidrojeller ve tabakalı, yüksek ve dökme hidrojeller karşılaştırılabilir kalır içinde gömülü insan mezenkimal kök hücrelerin Şekil 2. Hücre canlılığı) &#39;de gösterildiği gibi, Şekil 3&#39; de gösterildiği gibi, hücre popülasyonlarının tam bir başlangıç ​​ayrılma göstermez iki katmanlı jeller tamamlandı. Canlılık değer...

Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Görüntüleme.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

Video: Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Gelişim Biyolojisi

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

Biyomedikal Uygulamalar için Aljinatta Mikrokürelerin Üretimi

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Tıp

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Kültür Ultrathin Porated elastik Hydrogels bir Biomimetic membran için çift olarak hücre

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Boru yapıları doku mühendisliği için Çekirdek / kabuk Baskı İskeleler

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

İnsan Nöral Yapılarının Gömülü 3D Baskısı için Mikrojel-Hücre Dışı Matris Kompozit Desteği

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...