We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG&#180;s laboratory is supported by the University of Z&#252;rich, by a fellowship of the "Deutsche Forschungsgemeinschaft" and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the "Staatssekretariat f&#252;r Bildung und Forschung" in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).

Not: Bu protokol, doku hazırlanması, lazer yardımlı mikrodiseksiyon ve transkripsiyon profilleme için RNA çıkarma açıklanır. Her zaman protokol tüm adımları boyunca eldiven kullanın. Eğitim ve kullanılan her kimyasal için güvenlik talimatlarını dikkate alın. Xylol zararlıdır ve eldiven nüfuz edebilir ve bu metanol toksik olması, özellikle unutmayın. kullanılan tüm araçlar için, buna göre kullanıcı kılavuzlarına başvurun. Züccaciye ve Diğer Ekipman gelen RNAse Faaliyet 1. Kaldırma <ol><li> Kullanımdan önce önce, RNaz içermeyen kalitesini sağlamak için 180 ° C&#39;de ~ 8 saat boyunca pişirme için alüminyum folyo ile bir cam sarın. </li><li> Herhangi bir metal yüzeyleri tedavi (örn cımbız çifti) yanı sıra çalışma tezgahı ve uygun bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile ısıtma plakası. Daha sonra, dekontaminasyon çözüm kaldırmak için RNAse içermeyen su ile yüzeyleri yıkayın. Daha sonra,% 70 EtOH ile daha yüzeyleri temizlemek. </li><li> Tüm plas kullantik sarf malzemeleri (örneğin, borular) yepyeni herhangi ön işleme tabi tutulmadan. Varsa, ücretsiz RNAse için sertifikalı plastik sarf malzemelerini kullanın. </li></ol> 2. Doku Fixation <ol><li> çiftçi sabitleyici 10 ml hazırlama (3: 1; hac / hac etanol: asetik asit), buz üzerinde yeni bir 15 ml tüp içinde. (Kullanmadan önce her zaman taze Çiftçi fiksatif hazırlamak). Bir alternatif olarak, non-çapraz bağlama sabitleyici etanol: asetik asit (5: 1; hac / hac) 18 kullanılabilir. </li><li> ilgi gelişme aşamasında tomurcukları toplamak için cımbız ince bir çifti kullanın. Hemen buz gibi soğuk fiksatif tomurcukları daldırın. ~ Tespiti için Arabidopsis veya Boechera 20 tomurcukları veya çiçek sabitleştirici 10 ml kullanın Not:. Öncesinde tespitin daha küçük parçalar üretmek için bir jilet ile çiçek incelemek için tavsiye edilir büyük çiçekler ile bitki türlerini kullanırken. <ol><li> inflor 3 büyük çiçek tomurcukları - olgun gametofitleri elde etmek için, 2 emasculatehasattan önce 2 gün Escence. </li></ol></li><li> buz ile bir kurutucu alt doldurun. Ya doğrudan onlar üzerinden düşmeyecek şekilde buz içine koyarak veya uygun bir tutucu kullanarak, örnekleri, örneğin, çiçek içeren tüpler açın ve buz koyun. Vakum vakum serbest bırakmak için önce 15 dakika boyunca sızmak. <ol><li> 15 dakika boyunca bir kez vakum süzmesi tekrarlayın. </li></ol></li><li> buz üzerinde vakum ve mağaza gecede (~ 12 saat) bırakın. Bir kapak veya alüminyum folyo ile buz kovası Kapak ve çözülme buz önlemek için bir 4 ° C oda veya buzdolabında kova saklayın. Not: fiksasyon süresi uzatılması tavsiye edilmez. </li></ol> 3. Doku Gömme, İnce Kesit ve LAM için Slaytlar Montaj <ol><li> Doku gömme. <ol><li> Saf etanol ve RNAse içermeyen su ile hazırlanmış,% 70 etanol ile fiksatif değiştirin. daha sonra işlenene kadar buz üzerinde örneklerin bırakın. embe başlatNumunelerin dding gün. Hiçbir doku işleme makineleri mevcuttur durumda, başka bir yerde 9,11 açıklandığı gibi manuel gömme devam ve adım 3.1.11 ile devam edin. </li><li> Yavaşça bir cımbız ile doku gömme kasetler örnekleri aktarın. Sıkıca kasetleri kapatın. KRİTİK ADIM: Bu kademe sırasında numunenin da kısmen kurumasını önlemek. cımbız ile numunelerin sıkmaktan kaçının. Not: ideal kaset eğimli yüzeyinde yazarak, bir kalem kullanılması gereken kasetleri etiketlemek için. </li><li> Tüm malzemeler kasetleri aktarılır ve gömme makinesi yüklenebilir kadar% 70 etanol içinde tomurcuk veya çiçek yüklü gömme kaseti saklayın. Bu amaçla,% 70 etanol ile dolu cam boyama oluk kullanımı. </li><li> Makinenin imbikten doku işlemci sepeti çıkarınız ve üst bakan eğimli yüzeyler ile ve aynı yönde sepete gömme kasetleri aktarın. CRIKortikal ADIM: dokuların herhangi kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde bu gerçekleştirin. aynı anda bir çok gömme kasetleri işleme durumunda, önceden örnekleri yükleme% 70 etanol ile dolu uygun bir RNazsız kaba sepeti yerleştirin. </li><li> sepet kapağı koymak ve imbik geri sepet koyun. imbik kapatın. Not: Doku işlemci otomatik numune kurutur Ksilol için çözücü değiştirir ve erimiş parafin mumu ile sızma yapar. Tipik haliyle, bu gece boyunca yapılır. </li><li> Doku işlemci programı başlatın. Tavsiye edilen standart ayarlar infiltrasyonu, ardından 1 saat% 70 EtOH, üç kez 1 saat% 90 EtOH, üç kez 1 saat% 100 EtOH, iki katı 1 saat% 100 Xylol, bir kez 1 saat, oda sıcaklığında 15 dakika% 100 ksiloldür iki kez 1 saat ve 56 ° C&#39;de 11 de 3 saat bir süre için, parafin mumu ile. Not: Engelleme istasyonu erimiş balmumu ile hazır olmasını sağlamak için, başlamadan önce birkaç saat makineyi açmak veyayaklaşık başlangıç ​​zamanı seçmek için zamanlayıcı işlevini kullanın. Not: durumda doku 56 ° C&#39;de yerine 3 saat arasında 56 ° C&#39;de, hemen ardından olası parafın balmumu uzun inkübasyon süreleri olan işlenemez. Cihazın kullanım kılavuzuna başvurun. &quot;Boş imbik&quot; komutu onaylanana kadar Tipik olarak, dokularla kasetleri otomatik olarak erimiş mum içinde kalır. Doku işlemci başlatırken balmumu erimiş değilse, imbik% 70 etanol ile doldurulur ve başlamak için hazır olana kadar programın beklemede kalır. </li><li> imbikten boşaltın ve hemen bir engelleme istasyonunda 56 ° C&#39;de parafin banyosu örnekleri aktarın. sepet kapağını kaldırın ve kapağı ile engelleme istasyonunun parafin banyosu kapsamaktadır. </li><li> sepete kasetleri olduğu gibi bloke istasyonu yüzeyinde Kazık kadar taze dengeleme bölümleri 56 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı. Not: Bir etanol dayanıklı kalıcı marker kullanmak olabilird dengeleme tepsileri alt etiketlemek için. Aseton dayanıklı kalıcı belirteçler tavsiye edilmez. </li><li> bloke istasyonu kullanılarak, 56 ° C&#39;de eritilmiş parafin mumu ile önceden ısıtılmış taze plastik dengeleme tepsi doldurun. , Parafin banyosu kapağını kaldırın bir seferde sadece tek bir kaseti pick up ve bir cımbız kullanarak dengeleme tepside 56 ° C&#39;de sıvı parafin balmumu kasetlerden örnekleri aktarın. KRİTİK ADIM: hızlı çalışarak kaseti işlerken örnek çevreleyen balmumu herhangi sertleşmesini kaçının. <ol><li> balmumu sertleşmeden önce bir hazırlık iğne kullanılarak ihtiyaçlarına göre tüm örnekleri yerleştirin. Tipik olarak, çok sayıda çiçek her bir yönde yaklaşık 1 cm aralıklı dengeleme tepsi şeklinde düzenlenmiştir. </li><li> Tüm örnekler aktarılır kadar adımı tekrarlayın 3.1.9. </li></ol></li><li> geri doku işlemciye sepet koyun ve uygun bir program (kullanım kılavuzuna bakın) kullanarak imbik temizleyin. </li><li> Doku işlemci ve engelleme istasyonu kapatın. Adım 3.1.13 ile devam edin. </li><li> durumda, herhangi bir doku infiltrasyonu makinesi ve hiçbir gömme istasyonu mevcuttur, 56 ° C&#39;de parafin eritmek için bir ısıtma fırını kullanımı. bankta, plastik dengeleme tepsiler içinde erimiş balmumu doldurmak balmumu örnekleri aktarmak, ve örnekleri konumlandırmak için hazırlık iğne kullanın. </li><li> 4 ° C&#39;de depolamadan önce numune 3 saat - parafin ~ 1, oda sıcaklığında sertleşmeye izin verin. Numuneler, daha sonra taze işlenmiş ya da birkaç aya kadar saklanabilir. </li></ol></li><li> LAM için ince kesit ve slaytlar hazırlanması. <ol><li> aşağıdan mum blok aydınlatan bir ışık Masanın üzerinde, çevredeki plastik tepsiler alınan numuneler ile parafin mumu kaldırın. , Doku içeren bir kare mum blok parçalara ayır örn., Bir RNAse ücretsiz jilet kullanarak bir tomurcuk veya çiçek. Bu amaçla, her zaman mum blok üst kısmına doğru örnekleri yönlendirmek (ayrıca bkz <strong&gt; Şekil 1). <ol><li> Aynı anda LAM için kullanılması gereken tüm örneklerin mum blok hazırlayın. </li></ol></li><li> sertleştirilmiş parafin ile dolu kasetleri gömme işlemek için bloklar takın: Bir Etanol lamba kullanılarak uygun bir spatula ucunda küçük bir parça veya parafin mumu damlacık eritmek ve gömülü dokuları ile (destek bloğu düzeltmek için sıcak balmumu kullanın üstte). <ol><li> bal mumu, 4 ° C&#39;de en az 20 dakika boyunca sertleşmeye izin verin. </li></ol></li><li> Işık masaya bir jilet ile örnek çevreleyen artı balmumu çıkarın. Paralel kenarları (Şekil 1) ile bir kare yüzey tutmak için emin olun. </li><li> 42 ° C&#39;ye kadar ısıtma plakası ayarlayın. </li><li> Güvenle microtome örnekleri montaj ve 6 hazırlamak - 10 mikron kalınlığında kesitler. mikrotom kullanılarak için üreticinin talimatlarına bakınız. Not: ince kesitler genellikle daha iyi yapısal çözünürlük, highe RNA büyük miktarda verecektir ikenR kalitesi daha kalın bölümleri ile elde edilebilir. Boechera hücreleri gametofitleri olgun için biz varsayılan olarak 7 mikron kullanın. mikrotom bıçak üzerinde örnekleri ile oldukça yavaş hareket eden genellikle daha iyi histoloji ile sonuçlanır. </li><li> LAM slaytlar onları yerleştirmeden önce alt kısmında siyah karton plastik bir kutu içine 15 cm - Her zaman yaklaşık 10 bir uzunlukta parafin kurdeleler aktarın. </li><li> Eğer mümkünse, bir diseksiyon-kapsamında, örneğin faiz hücreye veya doku tipleri, ovüllerin içeren parafin şeritler parçaları önceden seçmek ve gerisini atın. </li></ol></li><li> LAM için slaytlar hazırlanması. <ol><li> ısıtma plakası üzerinde üstüne düz bir yüzeye sahip - metal çerçeveli slaytlar gerekli miktarda (10 genellikle 5) yerleştirin. </li><li> Pipet ~ 1 - sürgünün plastik parça üzerine RNazsız su 2 mi. plastik pencereler span yeterince uzun 5 cm - Bir jilet kullanarak, yaklaşık 4 kısa parçalara parafin kurdeleler kesti. UBir cımbız ve ideal parafin şeritler slaytlar plastik pencereler birbirine paralel yerleştirmek için bir hazırlık iğne se. Dikkatle suyu çıkarmak ve geri slaytlar yerleştirmek için bir ucunda slayt kaldırın. <ol><li> Seçenek olarak ise, kimyasal bir başlık altında ısıtma plakası yerleştirin. yüzeyinin nemlendirilmesi için yetecek sürgünün plastik kısmına küçük bir metanol hacmi halinde (bu slaytlar hafif dalgalı neden olur). slaytlarda parafin şeritler yerleştirin. Not: mümkünse toksisite nedeniyle, metanol kullanımını önlemek. Ancak, bu aşamada metanol kullanımı su monte edilmesi ile elde edilen kalite yetersiz olması durumunda, RNA kalitesini artırmak yapar. elde edilen RNA kalitesi soruşturma altında hücre tipi ve türler ile değişir gibi, yeni bir proje başlangıcında bu alternatifleri test faydalıdır. </li></ol></li><li> ~ 12 saat boyunca 42 ° C&#39;de bir gece boyunca ısıtma plakası üzerinde slaytlar kurutun. ısıtma plakası Kapakslaytlar dokunmaz bir plastik kapak. plastik kapak hava değişimini önlemek olmadığından emin olun. Bu kapak amacı pipet kutuları veya benzeri üzerine yerleştirilebilir için kaldırılması gerekir. <ol><li> Seçenek olarak ise, iki saat en az ya da doku tamamen kuru görünene kadar kuruma süresini azaltır. koleksiyona dilimleme zaman azaltılması RNA kalitesini artırabilir. </li></ol></li><li> Bir kimyasal Kaputun altında, de-mum slaytlar uygun slayt tutucuları kullanarak ksilolde 10 dakika süreyle 2 kez. Tamamen kuru tutulur metal çerçeve geniş ucunu dokunarak slayt çıkarılmasını sağlamak için sadece değil, her slaytın plastik parçayı batığın emin olun. </li><li> slaytlar LAM öncesinde kimyasal başlık altında ~ 10 dakika kurumasını bekleyin. Not: hemen işleme değil Slaytlar doku bir kaç saat kadar için yukarı bakacak şekilde 42 ° C&#39;de geri ısıtma plakası üzerine yerleştirilebilir. Bu daha fazla işlem kadar RNA kalitesinden ödün gelen herhangi bir nem önleyecektir. </li></ol></li></ol> 4. Lazer yardımlı mikrodiseksiyon (LAM) Not: LAM için prosedür kullanılan alet ile değişecektir. Bu protokolün bazı detayları belirli bir alet ve elektrostatik kuvvetlerin bir kapak yapma kullanımı örnek toplamak teknolojiye uyarlanmıştır. Buna ek olarak, ayrıntıları bile yazılımın farklı sürümleri arasında değişebilir. ayrıntılı bir açıklama ve enstrüman ve yazılım özel talimatlar için üreticinin talimatlarına ve kullanıcı el kitapları başvurun. <ol><li> LAM (bilgisayar, mikroskop, lazer kontrol kutusu) için cihazlar üzerinde geçin. </li><li> mikroskop ve lazer direksiyon programını başlatın. </li><li> kontrol kutusu üzerindeki ilgili düğmeye basarak lazer açın. </li><li> kapak tutucu içine (diffusor 0,5 ml) bir kap yerleştirin ve enstrüman konumlandırmak. </li><li> mikroskopi için bir cam slayt ile LAM slayt destekleyin. Emin olun sürgünün düz bir yüzeyeEkli doku cam slayt karşı karşıyadır. </li><li> altında cam slayt ile enstrüman slayt yerleştirin. </li><li> 4X Amaç seçin. Programda, &quot;yukarı&quot; pozisyona kapağı taşımak ve slayt tarama yapmaya devam seçin. </li><li> slayt yoluyla arama ve ilgi yapılarını belirlemek. Bulabilir ve kesme adımı için tam konumuna geri hareket edebilmek için slayt üzerinde konumlarını kaydedin. </li><li> Uygun hedefi (örneğin 40X veya 60X) seçin. </li><li> Gerekirse, lazer hızı, odak ve lazer gücünü ayarlamak ve aynı zamanda aracın kullanım kılavuzuna bakarak sahne hareketi kalibre edin. Bir hesap özel ilgi doku için ayarlandıktan sonra, ayarlar yeniden kullanılabilir. </li><li> ideal doku olmadan zarının bir parçası, programın &quot;lazer atış&quot; düğmesine basarak tek bir atış ile lazer konumunu doğrulayın. <ol><li> Gerekirse, inci izleyerek lazer pozisyonunu kalibreenstrüman e üreticinin talimatları. </li></ol></li><li> basılı sağ fare düğmesini tutarak, monitörde yazılım penceresinin dört bir yanına bariz bir yapıya taşıyarak hedefi kalibrasyonunu doğrulayın. bariz yapısına göre elin pozisyonu dört köşesinden aynı olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, yazılım kılavuzuna aşağıdaki amaçları kalibre. </li><li> &#39;Aşağı&#39; konumunda kap, hücre tipi veya ilgi dokusu, örneğin, yumurta hücresinin sınırlarını işaretlemek için &#39;el kalem&#39; aracını kullanın. &#39;Kes&#39; tuşuna basarak lazer ile ilgi hücre parçalara ayır. Not: Genellikle, ihtiyaçlarını kesit tekrarlanması hücre etrafında sınır tamamen seferde disseke olmasaydı. Bu durumda, otomatik olarak bir standart olarak bölümün iki tekrarlar yapmak için yazılım ayarlanması önerilir. </li><li> Kapağı kaldırın ve ilgi yapısı ile bir sonraki kaydedilmiş konuma geçmek. Adımı tekrarlayın 4.13Bir slayttan ilgi tüm hücreleri toplanır kadar prosedürün bir sonraki hücre bölümleri incelemek için. Emin kapak yeni bölüm kap boş pozisyona yapışıyor bir şekilde konumlanmasına dikkat edin. Not: dokuların büyük parçaları izole edilmesi tavsiye edilir (örneğin, bütün çiçekler ya da parçalarının bölümleri) taze kap tek hücre bölümlerinin izolasyonu sonra her slayt. Bu RNA kalite kontrolü için de kullanılabilir. </li><li> slayt çıkarın ve adımları 4.4 tekrarlayarak sonraki slayta devam - 4.14 ile 4.9 ve 4.13. </li><li> tüm slaytlar ilgi hücre tipleri kadar adımı yineleyin 4.15 ve ilgili adımlar izole edilmiştir. Not: ~ 4 daha uzun süre hasat için tavsiye edilmez - Aynı kap 5 saat. </li><li> Görme numunenin spesifik olmayan kirlilikleri dışlamak için LAM sonra kapağı yüzeyini kontrol edin. olmayan disseke dokular folyo ile korunmaktadır iken, toz nedeniyle elektrostatik yapışma yüzeyine sopa olabilir. <ol><li> To görsel, kapağı kontrol cihazdan slayt kaldırmak. &#39;Aşağı&#39; pozisyonunda kapak tutucu yerleştirin ve 4X amacı ile yüzeyi kontrol edin. </li><li> toz küçük parçalar görebilir durumda, küçük bir (2 | il) pipet ile kaldırın. Alternatif olarak, geri enstrüman üzerinde slayt monte slayt (hiçbir dokuların) ücretsiz bir parçası kapağını yerleştirin ve tamamen lazer kullanarak kontaminasyonu yok. </li></ol></li><li> Yakın kapaklar ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C&#39;de kuru bölümler dondurma. Gerekirse, numuneler bir kaç haftaya kadar saklanabilir. Ancak, bu aşamada hızlı bir şekilde işlem yapılarak, tavsiye edilir. </li></ol> 5. RNA İzolasyonu ve Kalite Kontrol Not: RNA&#39;nın küçük miktarlarda uygun herhangi bir yöntem ile izole edilebilir. Bu protokolde RNA küçük miktarlarda tanımlanan bir RNA izolasyon kiti kullanımı tarif edilmektedir. üreticinin talimatlarına uyun. <ol><li> bağlı numune ile tüpleri kullanınkap, ya doğrudan ya da -80 ° C ila çıkarıldıktan sonra. <ol><li> tüplerin açık ve dikkatli bir şekilde filtre ipuçlarını kullanarak her bir tüp çeperine ekstraksiyon tamponu 11 ul pipetleyin. örnekler arasındaki ipuçları değiştirin. </li><li> Kapağı kapatın ve tüpün kapağı aşağı ekstraksiyon tamponu sallayın. </li><li> 42 ° C&#39;ye ısıtılmış bir ısıtma fırın içinde aşağı kap tüpleri yerleştirin. imalatçının talimatlarına uygun olarak 30 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol></li><li> Kolon hazırlanması için üreticinin yönergelerini izleyin ve tüplerin alt kısmında özü toplamak. <ol><li> tek tek her tüp / cap için 5.1.2 - Birden fazla kap malzeme bir örnek birleştirilebilir gerekiyorsa, adım 5.1.1 ile devam edin. </li><li> (Üreticinin talimatlarına bakınız) sonra, tek bir tüp içinde, bir örnek için özleri havuzu ve EtOH eşdeğer miktarda ilave edilmeden önce, bir pipet ile toplanmış özü miktarını ölçün. </li><li> Emin olun Et miktarıOH Yükleme işleminden sonra kolon toplanmış özü hacmine eşit önce ilave edildi. </li><li> EtOH ile RNA yağış sonrasında, üreticinin talimatlarına aşağıdaki sütunlardan yükleme hızla devam edin. 100 xg santrifüj adımla protokol devam edin. </li><li> Her bir toplama tüpünün içeriği kolonundan geçirildi sonra, akış oranı, aşağıdaki üreticinin talimatlarına kaldırmak için 30 saniye için 16,000 x g santrifüj adımı gerçekleştirmek. </li><li> üreticinin talimatlarına uygun RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması ile devam ediniz. </li><li> sütun elüsyon tamponu Yükleme işleminden sonra kolon, 1 dakika boyunca inkübasyona izin verin. üreticinin talimatlarına talimatları izleyerek santrifüj tüpleri yüklenmeye devam. Not: elüsyondan önce, 100 xg&#39;de 1 dakika boyunca Ek bir santrifüj işleminin elüsyon verimliliğini artırabilir protokolde belirtilen. </li></ol></li><li> Çürük RNA Özüadımlar bu protokolün 5.2.7 5.1 aşağıdaki RNA kalite kontrolü için Rols (büyük doku bölümleri). </li><li> RNA kalite kontrolü yükü için 1 ul üreticinin talimatlarına aşağıdaki bir RNA Pico Chip kullanarak Bioanalyzer her bir kontrol numunesinin seyreltilmemiş toplam RNA. Not: ekstre RNA doğrusal amplifikasyon ve mikrodiziler veya RNA-DİZ 7,11,13,14 kullanılarak transcriptome analizi için kullanılabilir. İdeal olarak, kalite kontrol tedarikçi bir dizi amplifikasyonu için uygun kitler sağlar en az 7 arasında bir RNA Bütünlük sayısı (RIN), uygun örnekler 9&#39;da verilmiştir göstermelidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).</li><li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+female+gametophyte.">The female gametophyte.</a> Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).</li><li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomixis:+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization.">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li><li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomixis+-+the+asexual+revolution.">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li><li>Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+future+for+apomixis.">A bright future for apomixis.</a> Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).</li><li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+germline+formation:+molecular+insights+define+common+concepts+and+illustrate+developmental+flexibility+in+apomictic+and+sexual+reproduction.">Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction.</a> Development. 142, 229-241 (2015).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomictic+and+sexual+germline+development+differ+with+respect+to+cell+cycle,+transcriptional,+hormonal+and+epigenetic+regulation.">Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation.</a> PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarging+cells+initiating+apomixis+in+Hieractium+praealtum+transition+to+an+embryo+sac+program+prior+to+entering+mitosis.">Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis.</a> Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).</li><li>Wuest, S. E., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+applied+to+floral+tissues.">Laser-assisted microdissection applied to floral tissues.</a> Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).</li><li>Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+expression+profiling+of+rare+cell+types+as+exemplified+by+its+impact+on+our+understanding+of+female+gametophyte+development.">Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).</li><li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes.">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20, 1-7 (2010).</li><li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+plant+cells+from+tape-transferred+paraffin+sections+promotes+recovery+of+structurally+intact+RNA+for+global+gene+profiling.">Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling.</a> Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).</li><li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).</li><li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes:+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing.">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685 (2012).</li><li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors.">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li><li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages.">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li><li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species.">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li><li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments.">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li><li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Protokol Farklı Hücre ve Doku tipleri için uygundur Transcriptome ile kombine LAM mikroarrayler veya analizleri RNA-Seq gelişimsel ya da fizyolojik süreçleri 7-11,13,14 düzenleyen gen aktivitesinin spesifik kalıpları içine anlayışlar kazanmak için değerli bir araçtır. Ancak, herhangi bir belirli hücre tipi için bu yöntemin uygunluğu, yapısal konular kritik olarak bağlıdır. Hücre açıkça görülebilir ve LAM için kullanılan kuru bölüm...

Doku seviyesinde yapılan transkripsiyon çalışmalarda, son derece özel ama nadir hücre tiplerinin transcriptomes genellikle daha bol çevreleyen hücreler tarafından maskelenir. Bu son derece özel hücre tipleri için bir örnek, bitkilerde dişi üreme soy (tohum çizgisi) hücreleri bulunmaktadır. Kadın germ çiçek 1,2 dişi organ içinde, gelişmekte olan Yumurtacığa içinde tohum öncülerini belirtildi. megaspor anne hücre (MMC) kadın germline ilk hücresidir. Bu düşük megasporların bir tetrad oluşturulması için mayoz maruz kalır. Bir Sinsityum içinde, yani Tipik olarak, bu megasporların sadece biri hayatta ve sitokinez olmadan mitotik böler. Üç zıtlar iki synergid hücreleri, yumurta ve merkezi hücre: Bu mitoz tipik olarak dört hücre tipleri oluşur olgun gametofit oluşturmak üzere Hücreselleştirmeden tarafından takip edilmektedir. Yumurta ve merkezi hücreler dou sırasında iki sperm hücreleri tarafından döllenir olsun dişi gametlerin vardırble gübreleme gelişmekte tohum 1,2 embriyo ve endosperm yol vermek. 80 tohumlar yakından ilgili cinsi Boechera içinde çiçek başına geliştirmek - yaklaşık 50 iken cinsel model sistem Arabidopsis thaliana olarak, sadece ~ 50 tohum çiçek başına gelişir. Bu nedenle, kadın germ böyle hücre özellikleri ve farklılaşma gibi gelişim süreçlerini incelemek için mükemmel bir model yapma, sadece birkaç derece uzmanlaşmış hücre tipleri oluşur. Ayrıca, bitki üreme yöneten gen düzenleyici süreçlerine anlayışlar uygulamalı bir değer olabilir. Bitkilerde, tohumlar (Apomiksisin) aracılığıyla hem cinsel ve eşeysiz üreme oluşabilir. eşeyli üreme popülasyondaki genetik çeşitliliği oluşturur iken, anne bitki genetik olarak özdeş olan klonal yavrular oluşmasına yol açar apomiksis. Bu nedenle, apomiksis bile karmaşık anne genotipler can, tarım ve tohum üretimi uygulamaları için büyük bir potansiyele sahiptirbirkaç kuşak 3,4,5 üzerinde değişmeden muhafaza edilmesi. Apomiksis doğal olarak herhangi bir önemli bitki türlerinde oluşmaz, çünkü ürünlerde Apomiksisin mühendislik büyük ilgi 3,4,5 taşımaktadır. Ancak, bu uzun vadeli bir hedef Apomiksisin altta yatan genetik ve moleküler temeli yeterli detayda 6 anlaşılır değildir, çünkü elde etmek zordur. Lazer yardımlı mikrodiseksiyon (LAM) ve yeni nesil dizileme (NGS) kullanarak apomiktik üreme, hücre tipine spesifik transkripsiyonel profilleme düzenleyen transkripsiyon bazda içgörüler kazanmak için çok güçlü bir yaklaşım 7,8 temsil etmektedir. LAM ilk hayvan ve biyomedikal araştırmalar için kurulmuştur. Son birkaç yıl içinde LAM bitki biyolojisi 6,9,10 uygulanmıştır. Tek tek hücre ve doku tiplerinin profil sağlayan diğer yöntemlerin aksine, LAM markör hatları 6,9,10 üretilmesini gerektirmez. Bu nedenle, uygulama olabilirönceden moleküler bilgisi olmadan herhangi bir hücre veya doku tipine yalan. LAM diğer bir avantajı, hücre konumu ve / veya yapısal özelliklerine göre, kuru bölümlerde kabul edilebilir gibi sürece, herhangi bir hücre tipinde uygulanabilir olmasıdır. LAM işlem esnasında transkripsiyonel profili değişiklikleri önler sabit dokular kullanılan ek bir avantaja sahiptir. Çevrede, örneğin, çiçek dokusu dokusu, önceden parafın balmumu içine yerleştirilmeden olmayan bir çapraz bağlama sabitleyici sabitlenmiştir. Parafin gömme kurulan protokolleri 9,11 aşağıdaki elle yapılabilir. Ancak, balmumu ile dehidratasyon ve infiltrasyon için otomatik doku işlemci kullanımı genellikle RNA kalitesi ve doku morfolojisi korunması açısından yüksek tekrarlanabilirlik ile sonuçlanır. Reçine dokuların gömme alternatif strateji de başarılı bir LAM 8 hücre tip spesifik analizler için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bir autom kullanımıBirçok örnekleri kez zamanında eller en az gerektiren işlenebilir olarak mum gömmek için ated doku işlemci, çok zaman etkilidir. RNA kalitesi, tipik olarak önemli bir kayıp tespit ve gömme sırasında ortaya birlikte, mikrotom ile kesitlerin hazırlanması ve özellikle LAM kullanılan frameslides montaj RNA kalitesinin korunması için kritik bir aşama olarak kalır. Bu, daha önce not edilmiştir ve bir bant transfer sisteminin kullanımı, bu aşamada 12, daha iyi bir RNA kalitesi elde etmek tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu preparatların hazırlanması sırasında ilave bir zaman alan bir adım ekler ve özel ekipman gerektirmektedir. Aşağıda açıklanan optimize edilmiş protokol tekrarlanabilir GeneCHIPs ve Yeni Nesil Dizi (NGS) 7,11,13,14 yaklaşımları ile transkripsiyonel profilleme için yeterli kalitede RNA üretir. Buna ek olarak, kullanılan lazer mikrodiseksiyon mikroskobu ile izole edilmiş, hücre tipleri, yüksek saflıkta yatağından olaninely 7,11,13,14 üretti. Cins Boechera apomiktik üreme kilit adımları incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Boechera, farklı cinsel ve apomiktik katılımların çeşitli tanımlanmıştır ve Karşılaştırmalı için kullanılabilir 15,16,17 analiz eder. Cinsel Arabidopsis ve apomiktik Boechera Kadın germline hücrelerin hücre tipine spesifik transcriptomes bir karşılaştırma olarak, bu şekilde 7 apomiksis yöneten düzenleyici süreçlerin yeni yönlerini tanımlayan farklı şekilde ifade edilen genleri ve yolların tespit edilmiştir. Buna ek olarak, bu çalışma hücre tipine spesifik transkripsiyonel Lam uygunluğunu küçük ve nadir hücre tiplerinin analizi sunmaktadır. Daha önce bitki türlerinin çeşitli farklı hücre tiplerinin analizi için bu protokol kullanılır, ancak türlerin ve protokole dokuya özel modifikasyonları, bazı durumlarda gerekli olabilir var.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>1,009,861,000</td><td>absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td></tr><tr><td>15 ml falcon centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% Molecular biology grade</td></tr><tr><td>Ambion Nuclease free water</td><td>life technologies</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ASP200 S</td><td>Leica</td><td>14048043624</td><td>tissue processor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>black cardboard</td><td></td><td></td><td>can be purchased in special paper shops</td></tr><tr><td>DNA- and RNAse-free Frame Slides</td><td>Micro Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 &amp;micro;m PET-membrane; can also be purchased from Leica</td></tr><tr><td>Dumond Forceps</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>ethanol lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>exsiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z354074-1EA</td><td>Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment</td></tr><tr><td>filter tips 10&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>filter tips 1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>filter tips 20&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60020</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>filter tips 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>forceps precision</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>glass slide holder</td><td>Huber &amp;amp; Co.AG</td><td>10.0540.01</td><td>F&amp;auml;rbek&amp;auml;sten nach Hellendahl</td></tr><tr><td>glass staining trough</td><td>Huber &amp;amp; Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F&amp;auml;rbekasten</td></tr><tr><td>Heated Paraffin Embedding Module Leica</td><td>Leica</td><td>Leica EG 1150 H</td><td>blocking station, similar devises are suitable</td></tr><tr><td>Heating and Drying Table</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>other models and/or suppliers are suitable</td></tr><tr><td>ice bucket</td><td>VWR ice bucket with lid&amp;nbsp;</td><td>10146-184</td><td>similar buckets equally suitable</td></tr><tr><td>light table</td><td>UVP An Analytical Jena Company</td><td>TW-26&amp;nbsp;</td><td>white light transluminator</td></tr><tr><td>microscope slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>cut edges</td></tr><tr><td>microtome blade</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>S35 microtome blade disposable</td></tr><tr><td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml</td><td>life technologies</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>X882.2</td><td>for histology</td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td></tr><tr><td>plastic balancing trays</td><td>Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td></tr><tr><td>plastic box</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS</td></tr><tr><td>plastic lid for heating plate</td><td></td><td></td><td>homemade</td></tr><tr><td>preparation needle</td><td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNAse free microfuge tubes</td><td>life technologies</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNAse ZAP Decontamination Solution</td><td>life technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Semi-automated Rotary Microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td>similar devices are equally suitable</td></tr><tr><td>Tissue Loc Histo Screen Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>C-1000_AQ</td><td>similar cassettes of other suppliers are suitable</td></tr><tr><td>Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 &amp;micro;l&amp;nbsp;</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436.2</td><td>min. 99%, p.a., ACS, ISO SP</td></tr><tr><td>process embedding cassettes</td><td>Leica</td><td>14039440000</td><td>Leica Jet Cassette I without lid</td></tr><tr><td>Universal Oven</td><td>Memmert</td><td>UF55</td><td>other models and/or suppliers are suitable</td></tr></tbody></table>

laser-assisted microdissection (lam) as a tool for transcriptional profiling of individual cell types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Numune Hazırlama ve LAM Ardıl Adımlar yapılır Birbirini takip eden bir dizi adım LAM (Şekil 1) tarafından seçilen hücre tiplerinden transkripsiyonel analiz için RNA&#39;nın hazırlanması gerekmektedir. Bu RNA nüfus hasattan sonra değişmeden kalmasını sağlamak için çiçek ve acil tespitin hasat başlar. Doku, sarılır, bölümlere ayrılır ve slaytlar üzerine monte edili...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types at JoVE.com

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

laser-assisted-microdissection-lam-as-tool-for-transcriptional

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

9.2K Görüntüleme.  University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center. Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera. 

Video: Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Biyoloji

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Nörobilim

Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence

Profound transcriptional heterogeneity in anatomically adjacent single cells suggests that robust tissue functionality may be achieved by cellular phenotype diversity. Single-cell experiments investigating the network dynamics of biological systems demonstrate cellular and tissue responses to various conditions at biologically meaningful resolution. Herein, we explain our methods for gathering single cells from anatomically specific locations and accurately measuring a subset of their gene expression profiles. We combine laser capture microdissection (LCM) with microfluidic reverse transcription quantitative polymerase chain reactions (RT-qPCR). We also use this microfluidic RT-qPCR platform to measure the microbial abundance of gut contents.

This protocol explains how to collect single neurons, microglia, and astrocytes from the central nucleus of the amygdala with high accuracy and anatomic specificity using laser capture microdissection. Additionally, we explain our use of microfluidic RT-qPCR to measure a subset of the transcriptome of these cells.

Tek Hücretranskripsiyonel Profillerini Analiz Etmek Için Lazer Yakalama Mikrodisseksive Mikroakışkan QPCR'nin Birleştirilmesi: Opioid Bağımlılığına Sistem Biyolojisi Yaklaşımı

Profound transcriptional heterogeneity in anatomically adjacent single cells suggests that robust tissue functionality may be achieved by cellular ...

Genetik

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Gelişim Biyolojisi

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Tıp

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Türlerden Agnostik Tek Doku Uygulamaları için Lazer Mikrodiseksiyonu

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...