We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council

Hayvanlar (Bilimsel Usul) &#39;de belirtilen tüm hayvan deneyleri Proje Lisans numarası 60/4435 altında İngiltere Home Office Yönetmeliği uyarınca (1986) Yasası gerçekleştirilmiştir. Belirli gelişim aşamalarında embriyolar toplamak için, zaman aşımına çiftleşmelerin O / N kuruldu. Vajinal fişi bulma günü Noon embriyonik gün (E) 0.5 belirlenmiştir. 1. Ex Vivo Kültür E7.5 veya E8.5 Postimplantation Embriyolar Kesme <ol><li> Servikal dislokasyon ile hamile kadın fareler kurban. </li><li> Forseps ile tutarak, makas kullanarak rahim yalıtmak ve M2 ortamı ile dolu bir 30 mm çanak yerleştirin. </li><li> Dikkatle ince forseps iki çift kullanarak myometriumu parçalıyorlar. </li><li> Extraembryonic boşlukları delinme için dikkatli olmak, desidua uzakta soyun. </li><li> Forseps ile sıkıştırdıktan ve yavaş yavaş embriyo ayrılarak Reichert membran kaldırmak. </li><li> Diseksiyon altında embriyolar Kontrolstereomikroskopta yolk kesesi, amniyon ve ectoplacental koni bozulmamış olduğundan emin olmak için. </li><li> Buz üzerinde 30 mm plastik Petri kabı kapağı üzerine (&#39;buz platformu&#39;) kısmen soğuk embriyolar bir pipet ve yer kullanarak M2 temiz bir çanak embriyolar aktarın. </li><li> Eğer gerekirse, fazla 1,5 saat boyunca bir buz platformu, örneğin., Ortam hazırlanması veya küçük gruplar halinde manipülasyonu sırasında M2 mağaza embriyolar ~ oda sıcaklığında 3-4 embriyolar. Not: kurtarma ve kemirgen embriyoların diseksiyon önce 7,8,16 detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. </li></ol> 2. Embriyo Kültürü Orta hazırlayın <ol><li> Taze ticari olarak temin edilebilen sıçan serumu, ya çözülme (özellikleri için Glanville Jones ve ark., 13 bakınız) ya da sıçan serum ısı 56 ° C&#39;de 30 dakika süre ile inaktive edilmiş ve 1 ml donmuş Copp ve Cockroft 16 uyarınca in-house hazırlanmıştır -80 ° C&#39;de tümbölenler Not: Piyasada satılan sıçan serum kabul edilebilir<html> Serum in-house hazırlanan rağmen 24-36 saat kültür dönemleri için, 48 saat kadar kültür dönemleri için üstün tecrübemizle, içinde. </li><li> Taze bir fazlalığı hazırlamak (ör., 10 mi) Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM),% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 2mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat içeren tanımlanmış takviyeleri. </li><li> Kültüre olacak her aşamasının embriyo sayısına göre gerekli kültür ortamına hacmini hesaplayın (Bölüm 3). % 50 kültür ortamının telafi etmek için tanımlanmış takviyeleri ile sıçan serumu karıştırın (1: 1 (h / h) sıçan serum: tanımlanan katkı) ve / veya% 75 kültür ortamı (3: 1 (hacim / hacim) sıçan serum Tanımlanmamış takviyeleri). </li><li> 0.45 um&#39;lik bir filtreden embriyo kültür ortamı geçmek ve 10.000 IU / ml penisilin ve 10 ug / ml streptomisin ekleyin. Not: Taze çözülmüş L-glutamin ve sodyum piruvat solüsyonu ex vivo kültür sırasında embriyonun gelişimi için çok önemlidir. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Farklı Embriyonik Aşamaları için Ex Vivo Kültür Koşulları <ol><li> 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de hava içinde% 5 CO2 ile birlikte, bir kuluçka makinesi içinde 4 oyuklu plakalar kullanılarak statik kültürü: E7.5 embriyolar için. 1 ml% 50 kültür ortamında oyuk başına iki embriyolar kültürü. </li><li> E8.5 embriyo için: 24 saat (embriyo başına 1 mi,% 50 kültür ortamı) 37 ° C&#39;da hava içinde% 5 ile CO2 sürekli gazlama içeren 35 devir / dakika ile dönen bir silindir, kültür cihazı 8 kullanın. </li><li> E9.5 embriyolar için: 24 saat (1 ml 75% &#39;si kültür ortamı için 35 devirde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2,% 40 O 2% 55 N2 ile birlikte / dakika içeren gazlar döner bir silindir kültür cihazı kullanın embriyo). Not: 3 saat içinde Kültür embriyoların olumsuz gelişimini etkileyen M2 uzun süreli olarak fareler euthanizing sonra. Ex vivo embriyo kültürü yöntemi COPP&#39;un ve Cockroft 16 Bkz. </li></ol> 4. GraftinE7.5 veya E8.5 Fare embriyolara g Kültürlenmiş hücreler <ol><li> Fiziksel bir 20-200 ul pipet kullanarak 6-kuyu kültür plaka yayg GFP ifade EpiSCs, kazıma ve embriyoları içeren bir 30 mm çanak koyun Not: embriyolarda hücre kümeleri eklemek için, hücreler fiziksel hurdaya yerine tripsinize edilmelidir. </li><li> Ağız pipet yapmak için aspiratör borusuna bir el çekti aşılama kılcal takın. </li><li> Yavaşça aşılama kılcal içine boyutta bir veya daha fazla hücre kümeleri&gt; 20 hücreleri çizmek için ağız pipet emmek. </li><li> Yavaşça kısmen büyük öbekler dağıtmak için, hücrelerin dışarı üflemek. </li><li> Kılcal açılması yakın tutarak, ~ 10-20 hücre içeren bir hücre yığın seçin ve tekrar aşılama kılcal içine emmek. Ve defalarca kılcal dışına hücre yığın taşımak için dikkatli olun, küçük parçalar halinde break-up önlemek için. </li><li> Forseps bir çift ile yerine gevşek embriyo tutun ve aşılama eklemekilgi bölgeye kılcal bir açıklık oluşturmak için. </li><li> Yavaşça embriyo ettiler 10-20 hücrelerinin kısa bir dize bırakarak, aşılama kılcal dışarı tutam sınırdışı. </li><li> Embriyo istenilen sayıda aşılama işlemi tekrarlayın. Kolaylık için 3-4 embriyo parti büyüklüklerini kullanın. </li><li> Aşırı ışık ve ısı embriyoların maruz kalmasını önlemek için minimumda görüntüleme süresi tutarak, M2 ortamı, görüntünün kamera ile mikroskop diseksiyon bir floresan bileşik kullanılarak aşılı embriyolar aynı çanak embriyolar bırakmak. Not: Bu kamera ve bir mikroskop gibi florofor doğası ve floresan yoğunluğuna özelliklerine bağlıdır gibi deneysel görüntüleme kez saptayın. </li><li> M2 orta minimal hacimde bir pastette embriyo transfer kültür ortamı (Bölüm 3) hemen görüntüleme sonrası dengeye önceden etmek. Not: dikkatlice aşılama sonrası embriyoların morfolojisini incelemek. Intac Sadece kültürt embriyolar. </li></ol> 5. El yapımı Elektroporasyon Malzemeler ve Cihazlar Kurulum (Elektroporasyon Deneylerin Advance ardından hazırlayın): <ol><li> DNA enjeksiyonu pipetler için: Yatay mikropipet çektirmenin kullanılarak DNA enjeksiyon pipetler çekin. Enjeksiyon pipetler embriyonik boşlukların içine DNA enjekte, doku hasarı önlemek için bir açıklık 10 um&#39;den daha ile iyi bir uca sahip olmalıdır. </li><li> Cam kılcal elektroporasyon için: 20 ya da 30 um ya da bir iç çapa DNA enjeksiyonu pipetler açılmasını kesmek için microforge kullanın. Kılcal elektroporasyon için embriyo ile temas halinde olduğu zaman hücresel hasar görmesini önlemek için, cam kapiller ucu temiz değil keskin, kırık kenarlar ihtiva kesmek gerekir. </li><li> Yapımı kılcal elektrot (anot) (Şekil 1) için: seçecek odaklanmak için 20 ya da 30 um çaplı bir sabit bir açıklık ile bir elektroporasyon cam boru içine 0.2 mm çapında platin tel takmakGeçerli ric ve embriyo ilgi küçük bir bölgeye plazmid DNA teslim. </li><li> Yapımı L-şeklinde elektrot (katot) (Şekil 1) için: &quot;L&quot; uzunluğu yaklaşık 1 mm yatay kısmı, bir &quot;L&quot; şekli oluşturan bir 0,2 mm çapında platin teli katlayın. </li><li> İnce yalıtımlı tel her platin elektrot takın ve yalıtım bandı ile kaplı bir mikroenjeksiyon iğne tutucu takın. </li><li> Standart mikromanipulasyon enstrüman sahipleri iğne tutucular monte edin. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, devre bağlayın: güç kaynağı anoduna kapiler elektrot bağlamak; multimetre anoda L biçimli elektrot bağlamak; Güç kaynağının katot mulimeter katot bağlayın. </li></ol> 6. Elektroporasyon E7.5 veya E8.5 Fare Embriyolar <ol><li> Üst 1-2 mm içinde PBS ile elektroporasyon cam kapiller doldurun ve STRAI eklemekcam boru içine GHT platin elektrot (anot) bu kılcal dibine ulaşana kadar. </li><li> PBS ile doldurulmuş bir 30 mm Petri kabı yüzeyine L-şekilli bir elektrodunu (katot) çapa. </li><li> PBS dolu elektroporasyon çanak içine M2 ortamdan embriyo transfer. </li><li> Embriyonun amniyon boşluğuna yanal epiblast iğne yerleştirin. Tamamen dolana kadar boşluğuna: Pnömatik piko pompası kullanılarak, DNA solüsyonu (GFP veya pCAG-GFP% 0,01, yeşil gıda boyası boya ile 1-1.5 mg / ml pCAG-Cre) enjekte edilir. E7.5-E8.5 embriyolar için, en az 5 ul DNA çözeltisi, bir embriyo için gereklidir. Bir göstergesi olarak, yeşil boya kullanarak, embriyo patlamaya dikkat edin. </li><li> Dikkatle elektrotlar arasındaki embriyo konumlandırmak ve DNA teslim edilecek olan kesin yerlerine kılcal elektrodu taşımak. Not: embriyo yönlenmesi DNA elektropore edilecek bölgeye bağlıdır. </li><li> ElectropoHer pals arasındaki 1 saniyelik bir aralık ile, 6 darbeleri 50 ms süre, her 200 volt (V) ile embriyo oranı. </li><li> Embriyo transferi, elektroporasyon hemen sonra kültür ortamı önceden dengelenmiş. İsterseniz, bir sonraki embriyo için işlemi tekrarlayın. Not: Steril bir kap içine kültür ortamı ekleyin ve orta ön dengelenmeye kültürü inkübatör koyun. </li><li> , Kültürden sonra electroporated hücreleri 2 saat tespit bir pastette kullanarak M2 ortamı temiz 30 mm Petri kabı embriyolar transfer etmek. Görüntü diseksiyon mikroskobu bir floresan bileşik kullanarak adım 5.9 olarak embriyolar. </li><li> Görüntüleme hemen sonra pastette kullanarak kültürüne geri embriyolar transfer. </li><li> Bir uzak-kırmızı hücre zan-geçirgen bir nükleer boya ile embriyolar leke, elektroporasyon ile neden olduğu ölü hücreleri saptamak için: elektroporasyon ile 10 dakika sonra 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de (1 embriyo kültür ortamı içinde 200) (isteğe bağlı) </li><li> Embry düzeltmek, electroporated hücreleri saymak için4 ° C&#39;de 2-4 saat süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) os, bir ultraviyole ya da uzak-kırmızı floresan nükleer counterstain ve görüntünün bir konfokal mikroskop (İsteğe bağlı) kullanarak embriyolar ile çekirdeği leke. Not: PBS içinde çok uzun süre bırakıldığında Embriyonik gelişme olumsuz yönde etkilenmektedir. Bu nedenle, her embriyo electroporate için harcanan zaman en aza indirecek (embriyo başına &lt;5 dakika) emin olun. </li></ol>

<ol>
	<li>O'Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+asthma+control+in+pediatric+patients+after+discontinuation+of+long-acting+Beta-agonists.">Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists.</a> Pulmonary med. , 894063 (2012).</li><li>Brons, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448, 191-195 (2007).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448, 196-199 (2007).</li><li>Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+differentiation+potential+of+epiblast+stem+cells+revealed+by+chimeric+embryo+formation.">In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation.</a> Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).</li><li>Sadik, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+relationship+and+optimization+of+double-pulse+electroporation.">Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation.</a> Biophys. J. 106, 801-812 (2014).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).</li><li>Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein+4+signaling+regulates+development+of+the+anterior+visceral+endoderm+in+the+mouse+embryo.">Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo.</a> Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).</li><li>Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+prepancreatic+endoderm+by+whole+embryo+electroporation.">Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation.</a> JOP. 6, 128-135 (2005).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+cell+markers+into+germ+layer+tissues+of+the+mouse+gastrula+by+whole+embryo+electroporation.">Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation.</a> Genesis. 35, 57-62 (2003).</li><li>Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-Mapping+Technique:+Targeted+Whole-Embryo+Electroporation+of+DNA+Constructs+into+the+Germ+Layers+of+Mouse+Embryos+7-7.5+Days+Post-coitum.">Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum.</a> CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893 (2007).</li><li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Nolkrantz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+single+cells+and+tissues+with+an+electrolyte-filled+capillary.">Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary.</a> Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).</li><li>Mazari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microdevice+to+locally+electroporate+embryos+with+high+efficiency+and+reduced+cell+damage.">A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage.</a> Development. 141, 2349-2359 (2014).</li><li>Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , (1990).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+the+formation+of+a+mammalian+body+plan.">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).</li><li>Wilson, V., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+and+morphogenetic+movement+in+the+late+mouse+primitive+streak.">Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak.</a> Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).</li><li>Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+progression+of+lineage+segregations+during+mammalian+embryogenesis+by+clonal+analysis.">Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis.</a> Dev Cell. 17, 365-376 (2009).</li><li>Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+in+mammalian+gastrulation:+the+ventral+node+and+notochord+are+relatively+quiescent.">Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent.</a> Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).</li><li>Tsakiridis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Wnt-driven+primitive+streak-like+populations+reflect+in+vivo+lineage+precursors.">Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors.</a> Development. 141, 1209-1221 (2014).</li><li>Gouti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+neuromesodermal+progenitors+reveals+distinct+roles+for+wnt+signalling+in+the+specification+of+spinal+cord+and+paraxial+mesoderm+identity.">In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity.</a> PLoS biology. 12, e1001937 (2014).</li><li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node.">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120, 613-620 (1994).</li></ol>

The authors have no conflicts of financial or other interest to declare.

Aşılama Hücre aşılama deneyleri için kritik bir adım küme parçalanmasına önlemek için, ideal olarak tek bir eylem hücrelerin tutarlı bir dize ekleme olduğunu. Bu teknik ağız pipet kontrol bazı pratik gerektirir. Donör hücreleri konak içinde de dahil ise, bunların türevleri, embriyodaki dağılacaktır. Daha dağılmış donör türetilen hücreleri konak içinde uygun bir şekilde ayırt olup olmadığını belirlemek için, imüno embriyo bölümleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Donör hücreleri konak ortamı ile uyumlu değilse, onlar da tespit (onlar embriyo kovulan gibi) ya da kültürden sonra embriyolar adi öbekler şeklinde olamaz. Dağınık hücreler ve hücre kümeleri hem gözlendi, bu o çok hücre aşılandı gösterebilir ve çevresindeki konak hücreleri ile etkileşime olamaz aşırı donör hücreleri yığın oluşumuna neden olmuştur. Bu durumda, ek greft içerenhücrelerin daha küçük bir sayıda tekrar yapılabilir. Hücre aşılama tekniğinin en önemli sınırlaması uzun 48 saat elde edilmemiştir dönemler üzerinde fare ex vivo kültür beri hücrelerin tam in vivo potansiyelini belirlemek mümkün olmadığıdır. Ultrason eşliğinde hücre enjeksiyonu ile birlikte, ancak, bu uterus embriyo kültürlenmiş hücreleri transferi mümkün olabilir. Hücre aşılama deneyleri yaygın grubumuza kullanılmıştır ve bize çeşitli hücre tipleri 4,21,22 in vivo potansiyeli hakkında değerli ipuçları verdik, Özetlemek gerekirse. Erken İmplantasyon embriyoların in vitro kültürlenmiş hücrelerin in vivo potansiyelinin değerlendirilmesi için genel yarar için bir tekniktir. Elektroporasyon Bu çalışmada biz sadece göstermiştir rağmen ben, epiblast hedef kılcal elektroporasyon tekniği kullanmak etkili olduğunut kasıtlı örneğin endoderm hücreleri gibi diğer germ hedeflemek de mümkündür. Kılcal elektroporasyon tekniği için kritik bir adım PBS erken fare embriyoları için çok yetersiz kaldığı bu yana her embriyo (embriyo başına &lt;5 dakika) electroporate için harcanan zaman en aza indirmektir. Bizim verilerimiz Yukarıdaki embriyolar çoğu alanlarda, elektroporasyon embriyo gelişimini etkilemez göstermiştir. Ancak, düğüm elektroporasyon anormal gelişimi sebep ve embriyonun erken ölümüne yol açtı. Bu, önemli bir sinyal merkezleri 23 oluşturan hücrelerin hasarının ya da ölümünün muhtemeldir. Bu nedenle, bu bölge, bu teknik ile kaçınılması gerekir. Bir başka uyarı sonuçları bölümünde belirtildiği gibi epiblast veya ilkel çizgi hücreleri hedeflenen iken, bazı endoderm hücreleri de electroporated olmasıdır. DNA epiblast epitelin altında boşluklardan endoderm ulaşır, çünkü bu olabilir. Endoderm epitel hücrelerden oluşan ve inci bizim deneyim olduğunuese hücreler DNA&#39;yı almak için daha yüksek bir eğilime sahip. Kader haritalama için bu tekniği uygularken, bu nedenle, başlangıçta DNA&#39;yı aldığı hücrelerin değerlendirilmesi önemlidir. GFP plazmidler verimli çalışmaya gösterilen elektroporasyon parametreleri kullanılarak teslim edilebilir, diğer DNA konstruktları etkinliği değişebilir ve tek tek optimizasyon gerekebilir: Ayrıca pCAG-GFP ve pCAG-Cre, ancak not edilmelidir. Plazmidler transfekte etmek zor olduğu tespit edilmesi halinde, DNA konsantrasyonu, elektroporasyon gerilim veya vurum sayısı değişiklikler yapılabilir. Sınırlı hücre ölümü ile embriyo çok az hücre içine GFP plazmidler: Özetlemek gerekirse, bizim optimize kılcal elektroporasyon sistemi verimli ve tekrarlanabilir GFP veya Cre sunabilirsiniz. Bu yöntem pahalı ya da çok özel ekipman gerektirmez yana, hücre izleme çalışmaları için veya ektopik ifade veya koşullu silme o etkisini test büyük kullanım olabilirerken embriyolar f genler durumunda elektroporasyon floxed koşullu mutant alelleri taşıyan embriyolarda gerçekleştirilir. Bu nedenle, bu elektroporasyon tekniği lokalize yabani tip oluşum safhasındaki ortamları, bir hücre tarafından hücre bazında hücre iç faktörlerin rol anlamak için yararlı bir fonksiyonel bir araç sağlar.

Hücre kültürü yaygın gelişimsel biyoloji çalışmalarında kullanılmıştır. Fare Embriyonik kök hücreler (ESCs) ve epiblast kök hücreleri (EpiSCs), in vitro olarak her üç germ içine ayırt ve erken memeli embriyojenez hücre farklılaşması için faydalı bir model olarak olabilir. Bu hücre hatları türetilmesi in vitro manipülasyon ve erken embriyonik desenlendirme sırasında çalışan lokalize sinyal olaylar ve transkripsiyonel ağların ayrıntılı inceleme için bir fırsat açtı. Bununla birlikte, bu kültürde gerçekleştirilen herhangi bir manipülasyon in vivo belirlemek üzere önemli olmaya devam etmektedir. Preimplantasyon embriyo kaynaklı fare EKH in vivo potansiyel preimplantasyon embriyoları (morulları veya blastosist) 1 geri tanıtarak değerlendirilmiştir. Ancak, İmplantasyon embriyolar epiblast hücreleri temsil EpiSCs preimplantasyon embriyoları 2,3 verimli entegre olamaz. Bizim oncekiBize bulgular İmplantasyon embriyolar 4 içine aşılı zaman EpiSCs verimli kimeralar oluşturmak ve tüm germ katkıda bulunabileceğini göstermiştir. Bu nedenle, in vitro kültürlenmiş hücrelerin değerlendirilmesi için en iyi yol, in vivo olarak karşılık gelen temel alanlarına tanıtmaktır. Elektroporasyon, in vivo ve in vitro deneylerde, hem hedef hücrelere ekzojen molekülleri salıvermek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Elektrik enerjisi dışsal deoksiribonükleik asit (DNA) ya da hücrelere girmek için ribonükleik asit (RNA) sağlar hücre zarı, gözeneklerin sayıda oluşturabilir. Bu tekniğin en büyük zorluklardan biri yüksek electrotransfection verimlilik 5,6 ile optimum hücre canlılığını birleştirmektir. Embriyonik dokularda nükleik asitlerin elektroporasyon için, altın, geniş bir aralıkta mekansal 7-9 hücre hedefleme sağlayan, elektrotlar en sık kullanılmış olan kaplama. Daha loca elde etmek içinlized gen transferi, iğne şeklindeki elektrod fokal elektrik alanı 10,11 elde etmek için kullanılmıştır. Bu yöntemi kullanarak, yazarlar elektroporasyon sonra yaklaşık 30-60 hücre 11 DNA yapısının içine alınır gösterdi. Bununla birlikte, doğru elektroporate edilmiş hücrelerde sayısını ayarlayarak sabit genişlikli elektrot ile zor kalır gibi görünmektedir. Kılcal elektroporasyon tekniği tek hücre 12-14 kadar plazmidler teslim etmek için kullanılır olmuştur. Ancak, bu teknik ex vivo embriyolar için plasmidlerin electroporating uygulanan edilmemiştir. Daha yakın bir zamanda, erken mikrovasıta İmplantasyon Fare embriyolarında 15 lokal olarak electroporate birkaç uzak organ endoderm hücreleri (en az 4 hücreleri) olarak bildirilmiştir. Ancak bu cihaz verimli ektoderm hedef ve ex vivo mesodermi edip hala bilinmemektedir. Bu çalışmada, erken sonrası hücresel ve gen fonksiyonunu değerlendirmek için iki yeni yöntemleri tarif-implantation embriyolar. Biz ilk in vivo potansiyelini değerlendirmek için erken fare embriyoları tanımlanan sitelerine in vitro kültür hücreleri greft nasıl gösterilmektedir. Aşılı hücreleri ve onların soyundan entegrasyonu, tüm genetik etiketi (örneğin, yeşil floresan protein (GFP) etiketli, ayrıca doku spesifik proteinlerin immün tarafından muayene edilebilir 4. İkincisi, biz tam DNA teslim geliştirilmiş bir yöntem tarif Bunun yerine, bir iğne şekilli elektrot kullanarak daha elektroporasyon ile embriyo lokalize sitelere., bir ince uçlu bir cam boru içinde ince bir tel yerleştirilir ve bu değişiklik, yüksek verimlilik ve sınırlı sayıda hücre az sayıda DNA teslim edebilir göstermek hücre ölümü. Ayrıca, biz farklı açılış boyutları ile cam kapilerleri kullanarak, biz Electroporated hücrelerinin sayısını kontrol olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, o bu yöntem küçük sayılar içeren erken embriyonik desenlendirme incelemek için büyük bir kullanım olabilir inanıyorumf hücreler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Forceps</td>
			<td style="width:275px;">Dumostar</td>
			<td style="width:275px;">T5390</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Dissecting stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:275px;">&#160;Zeiss</td>
			<td style="width:275px;">Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Stereomicroscope system with fluorescence&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Nikon</td>
			<td style="width:275px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Inverted microscope with a digital camera</td>
			<td style="width:275px;">Olympus</td>
			<td style="width:275px;">Olympus BX61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Inverted confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:275px;">Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Low melting point agarose&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">11397863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">30mm Petri dishes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">121V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">4-well plates</td>
			<td style="width:275px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:275px;">179820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">10010015&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Paraformaldehyde (PFA)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">NICHIRYO</td>
			<td style="width:275px;">Nichipet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">tips&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:275px;">685280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:275px;">SANYO</td>
			<td style="width:275px;">MCO-17AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Roller culture apparatus&#160;</td>
			<td style="width:275px;">BTC Engineering</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Syringe filters 0.45&#181;m, sterile&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">10462100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">SH30549.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">SH30239.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:275px;">DE17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Gas Cartridge for Portable Meker Burner</td>
			<td style="width:275px;">COLEMAN&#160;</td>
			<td style="width:275px;">COLEMAN 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:347px;">Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:275px;">640798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">A5177-5EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Flaming/Brown micropipette puller&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:275px;">P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Microforge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">De Fonbrune</td>
			<td style="width:275px;">BS030301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pneumatic pico pump&#160;</td>
			<td style="width:275px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:275px;">PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Microloader tips&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:275px;">5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">ECM 830 square wave pulse generator&#160;</td>
			<td style="width:275px;">BTX</td>
			<td style="width:275px;">45-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Green food coloring dye</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">C.I. 42053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye</td>
			<td style="width:275px;">Biotium</td>
			<td style="width:275px;">40060-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">pCAG-Cre:GFP&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Addgene</td>
			<td style="width:275px;">#13776&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">pCAG-GFP&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Addgene</td>
			<td style="width:275px;">#16664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Multimeter</td>
			<td style="width:275px;">Excel</td>
			<td style="width:275px;">XL830L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Micromanipulators&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Leitz&#160;</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">0.2mm diameter platinum wire&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:275px;">E404-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:275px;">Abcam</td>
			<td style="width:275px;">ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Goat anti-Chicken IgY, HRP</td>
			<td style="width:275px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:275px;">sc-2428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Liquid DAB+ Substrate Chromogen System&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Dako</td>
			<td style="width:275px;">K3467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">A far-red fluorescence nuclear counterstain</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for precisely localized transfer of cells or dna into early postimplantation mouse embryos

Erken fare embriyo manipülasyonu ve kültür güçlü henüz büyük ölçüde altında kullanılan bu model sistemin değerini artıran teknoloji bir olduğunu. Bunun aksine, hücre kültürü yaygın gelişim biyolojisi çalışmalarında kullanılmıştır. Bununla birlikte, in vitro kültürlenmiş hücrelerin gerçekten in vivo hücre tiplerinde temsil olup olmadığını belirlemek için çok önemlidir. Gelişimi sırasında katkıları değerlendirilmesi ardından embriyolar içine hücreleri, aşılama in vitro kültür hücreleri potansiyelini belirlemek için yararlı bir yöntemdir. Bu çalışmada, ex vivo kültür ardından erken implantasyon sonrası fare embriyosu, tanımlanmış bir siteye hücreleri aşılama için bir yöntem tarif eder. Ayrıca, yüksek transfeksiyon verimlerine ve düşük hücre ölümü hem eksojen DNA&#39;nın alınması hücrelerin sayısının hassas bir lokalizasyonu ve ayarlama sağlar bilinen bir çapa cam kılcal kullanan optimize edilmiş bir elektroporasyon yöntemi sunuyoruz. Herhangi bir sp gerekmez Bu teknikler,ecialized ekipman, gastrulasyon ve erken organogenezisin aşamalı fare embriyo mümkün deneysel manipülasyonlar, kültürlü hücre alt bağlılık ve hücre farklılaşmasında yerinde genetik manipülasyonlar etkisi sağlayan analizini vermekteyiz.

Aşılama Her yerde bulunan bir EGFP (mESCs in vitro türetilebilir E6.5 epiblast türetilen R04-GFP, ve C2), 4 ifade EpiSCs elle kültür kabı kazınır ve E7.5 embriyolar, farklı bölgelerde (Şekil 2A) aşılanmıştır. Embriyolar ex vivo kültive ve 24 saat sonra analiz edilmiştir. Donör hücrelerin dağılımı floresan mikroskobu ile değerlendirildi. Donör hücreleri dahil, bunlar çoğalmıştır ve bunların türevleri ana embriyoların (Şekil 2B) içinde dağıtılmış. Bu ana embriyoların (Şekil 2A, 2B ve) &#39;de etkili bir şekilde dahil 10-16 hücreleri ihtiva eden greftler, ancak, daha fazla hücre aşılama daha chimaerism neden olmadığı gözlenmiştir. Bunun yerine, aşılanmış hücreler adi kümeleri (Şekil 2C ve 2D) üretildi. Elektroporasyon Bir içinembriyo belirli sitelere: ssess bizim elektroporasyon sisteminin verimliliği, biz GFP ifade plazmidler (GFP pCAG-GFP ve pCAG-Cre) teslim etti. Bir önceki çalışmada 11 ile uyumlu olarak, GFP + hücreler embriyolar elektroporasyon (Şekil 2E ve 2G) sonra 1-2 saat tespit edildi. Geç ilkel çizgi sahne embriyo distal epiblast hücrelerinin elektropore edildiğinde, etiketli hücreler kültürde 24 saat (Şekil 2E ve 2F) sonra nöral ektoderm katkıda bulunmuştur. Bu sonuç gastrulasyon sahne embriyoların 17 epiblast hücrelerinin bilinen kaderi haritalarına iyi gelir. GFP ekspresyon plazmidi E8.5 (2-5 Somitlerin) ilkel çizgi elektroporasyona Benzer bir şekilde, GFP + hücreler geç Başlangıç ​​çizgisinin 18 bilinen kaderi haritaları ile tutarlıdır paraksiyel mezoderm (Şekil 2G ve 2H), katkıda . Ayrıca, biz, Electroporated hücrelerden her üç germ (Şekil 2I-K) katkı gözlendielektroporasyon prosedürü, in vivo olarak, hücre davranışını ödün vermeyen düşündürmektedir. Ancak, biz de epiblast (E7.5) ya da ilkel çizgi hücreler (E8.5) hedeflenmiş iken, bazı endoderm hücreleri aynı zamanda (Şekil 3C ve Tablo 1) elektroporate fark ettim. Bir kılcal elektrodu kullanılmasının önemli avantajlarından biri, elektroporate edilmiş hücrelerde sayısı sadece kendi açıklığın çapı değiştirilerek kontrol edilebilir olmasıdır. Elektroporasyona hücrelerin sayısını belirlemek için, embriyolar elektroporasyon sonra 2 saat sabit ve konfokal mikroskop wholemount olarak görüntülenmiştir. GFP + hücrelerinin sayısı el konfokal Z yığınlarının sayılmıştır. Tablo 1, bu daha fazla hücre DNA alımında 20 mikron ile 30 sonuçlardan cam kapiller açılış boyutunu artırarak belirli bir aşamaya, için. Tek bir açıklık boyutu (E8.5 karşı E7.5) aşamaları arasında karşılaştırıldığında, daha fazla hücre ikinci aşamada elektropore olduğu bulundu. Bu etki, E8.5 amniyotik boşluğunda bulunan DNA, daha yüksek bir konsantrasyona kadar bağlı olabilir. DNA solüsyonu yeşil gıda boyası ile karıştırılmış Çünkü, biz amniyotik boşluk DNA konsantrasyonu değerlendirmek için yeşil renk kullanabilirsiniz. Mikroskop, bu E8.5 embriyolar ile karşılaştırıldığında DNA enjeksiyonundan sonra yeşil renk E7.5 embriyoların boşluğu içinde daha hafif olduğunu, olduğu açıktır. DNA çözeltisi içinde aynı konsantrasyondaki E7.5 ve E8.5 embriyoların içine enjekte edildi, ancak daha fazla DNA çözüm, daha büyük boyutta olduğundan tamamen doldurmak için E8.5 embriyoların amniyotik boşluk içinde oldu. Enjeksiyon iğnesi geri çekilmesi sonrasında, her zaman amniyotik boşluk DNA çözeltisinin kaçak bir derece vardır ve delinme deliği önceki embriyolarda amniyotik kavite büyüklüğüne oranla daha büyük olduğundan, oransal olarak daha sızıntı olduğunu muhtemeldir daha düşük bir DNA konsantrasyonunun neden E8.5 embriyolar daha E7.5 gelen. Transfekte farklı sayıdaHücreler, farklı aşamalarda farklı hücre çap veya indüklenen transmembran voltajı (ITV) eşik nedeniyle olabilir. Elektroporasyon bir dezavantajı, ilişkili hücre ölümüdür. Geleneksel altın benzer kaplama ya da iğne şekilli elektrotlar, bir kılcal elektrodu kullanılarak elektroporasyon hücre ölümüne neden olur. Elektroporasyondan sonra, hedeflenen bölgenin hücre ölümünün bir miktar, bu alanda oluşmuştur gerektiğini belirten, komşu bölgelerde (Şekil 3A ve 3B) ile karşılaştırıldığında daha koyu renkte ortaya çıktı. Daha da elektroporasyon prosedürü neden ölü hücrelerin sayısını belirlemek için, embriyolar bir flüoresan hücre zan-geçirgen bir nükleer boya ile boyanmıştır. Ölü hücrelerin çekirdekleri, bir zara-geçirmeyen uzak-kırmızı bir floresan boya ile etiketlenmiştir. Boyama Bu kılcal elektroporasyon tekniği sadece elektroporasyon alanının yakınında ölü hücreleri (Şekil 3D ve Ta az sayıda sonuçlanır doğruladıble 1). Biz ölü hücreler elektroporasyon yerinde görünmesine rağmen, GFP + hücreler ve ölü hücreler de birbirlerine (Şekil 3E ve 3F&#39;de) en seçkin olduğunu fark ettim. E8.5 kaudal yanal epiblast pCAG-GFP ve 20 um&#39;den bir cam kılcal açıklık, GFP + hücreleri çok sayıda elektroporasyona Dahası, kültür içinde 48 saat (Şekil 3G ve 3H) sonra tespit edildi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar en GFP + hücreler daha kültür sırasında hala canlı olan elektroporasyon sonra 2 saat tespit öneririz. Biz 24 saat ex vivo kültürden sonra GFP + hücre sayısını attı. Altı embriyolar 20 um çaplı bir kapiler açıklığı kullanılarak, E7.5 de pCAG-GFP ile elektropore edildi. GFP + hücreler / embriyo tespit edildi 107 ± 31 (sd ortalama ±). Kültür (2 saat) başlangıcında bu yana, 9 hücreleri başına ortalama embriyo üzerinde elktroporatlandı ( <s<html> trong&gt; Tablo 1), bu hücreler, 2 saat elektroporasyona olan 3-4 bölümleri geçirmediğini ortaya koymaktadır. E8.5 embriyoların E7.5 saati iki katına ortalama hücre dışında ventral düğümde 19,20 olanlardan tüm hücrelerde 6-7 saattir. Bu elektroporasyon prosedürü normal hücre büyümesini engel olmadığını göstermektedir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig1.jpg" /> Elektroporasyon kurulumu gösteren Şekil 1. Devre şeması. Onun amniyotik boşluk içinde embriyo içeren DNA solüsyonu iki elektrot arasına yerleştirildi. Seçilen parametreler Cari bir kare dalga darbe jeneratörü (güç kaynağı) tarafından sağlandı. Bir multimetre embriyo geçen elektrik akımı algılamak için seri olarak bağlanmıştır. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53295/53295fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Her zaman &quot;&gt;:&quot; keep-together.within-sayfa = fo &quot;jove_content <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53295/53295fig2.jpg" /> Şekil 2. konak embriyolar aşılı veya Electroporated hücrelerin dağılımı. Wholemount embriyoların (gri tonlama) (A) aydınlık görüntüleri (AH) GFP floresan bindirmeleri (yeşil) 10-16 GFP + EpiSCs geç distal bölgeye aşılanmış -streak aşamasındaki embriyo. (C), GFP + EpiSCs daha büyük bir tutam bir orta çizgi evresindeki embriyonun uzak bölgesi içine aşılanmıştır. (B ve D) &#39;de gösterilen bir ev sahibi embriyolar EpiSCs türetilmiş hücreler (yeşil) dağılımını ( A ve kültür 24 saat sonra C). donör hücrelerinin doğru entegrasyon öne konak embriyo içinde dağılmış (B) GFP + hücreleri. (D) Aşılama daha büyük hücre kümeleri ev sahibi embriyo adi topak oluşumu ile sonuçlandı. (EK) pCAG-Cre: GFP plazmid ele<html> Yabanitip embriyoların belirli alanlara ctroporated. Bir erken tomurcuk aşamalı bir embriyoya (E) ya da hücre gruplarının 2-5 aşamalı bir embriyoya (G) Başlangıç ​​çizgisinin uzak bölge electroporating 2 saat işlemden sonra, bu bölgelerde GFP + hücreleri sonuçlandı. (F ve H) kültür içinde 24 saat sonra ana embriyoların GFP + hücrelerinin dağılımı, Elektroporasyona tabi tutulan hücreler nöroektoderm (siyah ok) katkıda bulunduğunu gösteren (F) ve paraksiyel mezoderm (beyaz ok) (lH). (TK) Elektroporasyona tabi tutulan hücreler nöroektoderm (I) ortaya çıkmasına neden olabilir gösteren GFP + hücreleri için DAB imüno mezoderm (J) ve kültür 24 saat sonra endoderm (J ve K). Ölçek çubuğu (AH) = 250 mikron; Ölçek çubuğu (IK), 100 mikron =. Not: Şekil 1A ve 1B önceki yayının 4 yeniden basıldı edilir.= &quot;https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot; href&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53295/53295fig3.jpg" /> GFP + hücreleri ve elektroporasyon sonra embriyolar ölü hücrelerin Şekil 3. Dağılımı (AC) pCAG-Cre. GFP plazmidi, bir E8.5 kaudal yan epiblast hücrelerine elektroporasyon (2-5 hücre gruplarının aşama) embriyo (kapiler açıklık büyüklüğü :. 20 mikron) (A) 2 saat işleminden sonra, hedeflenen bölge embriyonun diğer bölgelerine kıyasla koyu renk (beyaz ok) gösterdi. Ankastre Elektroporasyona bölgenin büyütülmüş bir halini göstermektedir. (B) aydınlık görüntü (gri tonlama) içinde elektroporasyona tabi hücreler (yeşil) gösteren yeşil flüoresan kanalı ile kaplanmış. (C) konfokal z dilimli gösterenKuyruk yanal epiblast hücreleri hedef alındı, iki endoderm hücreleri (yeşil) da plazmid aldı. . Hücre çekirdekleri (DF) pCAG-Cre kırmızı ile gösterilmiştir: GFP plazmidi, bir E8.5 embriyo düğümün kaudal elektroporasyona (kapiler açıklık büyüklüğü: 30 um). Embriyo 2 saat kültürlendi. Elektroporasyona tabi tutulan hücreler, kırmızı ve yeşil ölü hücreleri gösterilmektedir. (D) içinde elektroporasyona tabi alanı GFP + hücrelerin yanı sıra ölü hücreleri hem de içerir. Beyaz kutu bölge ayrıca bir konfokal mikroskop analiz edilmiştir. Z-yığınının Manuel sayma 33 GFP + hücreler ve bu alanda 23 ölü hücreler olduğunu göstermiştir. Sadece iki hücre her iki fluorophores için olumlu hem de vardı. (E ve F) GFP + hücreler ölü hücreleri ayrıdır gösteren D beyaz kutulu bölgeden bir konfokal z-dilim XYZ görünümü. Çekirdekleri mavi gösterilmiştir (G ve H) pCAG-Cre. GFP plazmidi, bir kaç hücre içine elektropore edildiBir E8.5 embriyo kaudal yanal epiblast LS (kapiler açıklık büyüklüğü: 20 um) ve iki (G) ve 48 (H) saat ex vivo kültür Not sonra görüntülü: (H) embriyo kültürü sonra, iki kesildi. Baş ve kalp bölgeleri çıkarıldı. Ölçü bar (A, B, D, G ve H) = 250 um; Ölçek çubuğu (C, E ve F) = 100 mikron. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53295/53295fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Kılcal tüpün açıklığının çapı </td><td> Embriyo evresi </td><td> Elektroporasyon verimliliği: hayır. 2h / toplam sonra GFP + hücreleri içeren embriyolar. ve electroporated embriyolar (no. 24 veya 48 saat kültürden sonra normal gelişti + embriyolar GFP) </td><td> Sd ± embriyo başına GFP ortalama sayısı + hücreler (n = no. Incelenen embriyoların) </td><td> No.Sd ± her embriyo başına GFP + endodermal hücreleri (n = no. Incelenen embriyoların) </td></tr><tr><td> 20 um </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 7/9 (7) </td><td> 9 ± 3 (n = 4) </td><td> 4 ± 2 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30 um </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> / 15 (12) 13 </td><td> 17 ± 2 (n = 4) </td><td> 6 ± 1 (n = 4) </td></tr><tr><td> 20 um </td><td> E8.5 (2-5 Somitlerin) </td><td> / 13 (10) 12 </td><td> 21 ± 4 (n = 4) </td><td> 11 ± 4 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30 um </td><td> E8.5 (2-5 Somitlerin) </td><td> 02/02 (2) </td><td> 33 ve 26 (n = 2) </td><td> 14 ve 16 (n = 2) </td></tr></tbody></table> PCAG-Cre Tablo 1. Elektroporasyon verimliliği: fare embriyoları GFP plazmid. Kısaltma: LS geç ilkel çizgi sahne; LB: Geç tomurcuk sahne. Embriyolar göre sahnelenirÇıkışlar ve Davies 12

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos at JoVE.com

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

methods-for-precisely-localized-transfer-cells-or-dna-into-early

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Görüntüleme.  School of Biological Sciences, University of Edinburgh. We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Video: Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Gelişim Biyolojisi

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç<em&gt; Ex Ovo</emErken Civciv Embriyolar&gt; Time-lapse Görüntüleme

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Üç boyutlu yüksek frekanslı Ultrasonografi romanı kullanımı için fare erken gebelik karakterizasyonu

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

Transcriptome Profil

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli

Üç boyutlu yüksek frekanslı Ultrasonografi romanı kullanımı için fare erken gebelik karakterizasyonu

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları