This study was supported by the Swiss National Foundation (n&#176; 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)

Hayvan bakım İsviçreli yerel yetkililer (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, onay NRS. 52/11 ve 35/14) tarafından onaylanan kurallarına uygun olarak yapıldı. Bu yönergeler Avrupa Topluluğu Direktifi 2010/63 / AB ile uyum içindedir. Not: Steril aletler ve çözümleri ile bir laminer akış kaputu Çalışma tüm adımlar 1 - alt adımlara dahil 5. ÇÇA hazırlanması 1. Not: taraflı çevre, bir cam alt tabaka, mikro-işlenmiş metal elektrot ve bir SU-8, polimer yalıtım tabakasının oluşmaktadır (. Ayrıca Tscherter ark 3&#39;e bakın). Bu çalışmanın amacı doğrultusunda, ticari olarak mevcut ÇÇA&#39;lar özelleştirilmiş elektrot dizisi düzeni (Şekil 1 A ve B) ile emredildi. 68 elektrotlar elektrotlar ücretsiz 300 mikron genişliğinde oluk, Elek iki bölgeye bölünmüş olan bir dikdörtgen ızgara şeklinde düzenlenmiştirical yol açar ve yalıtım. Her bir elektrot büyüklüğü 40 x 40 mm olan ve merkezden merkeze 200 um ile birbirinden aralıklıdır. Dört büyük toprak elektrotları kayıt sitenin etrafında konumlandırılmış. Onlar kendi boyutunda (21 mm x 21 mm) piyasada mevcut diğer standart ÇÇA farklı ve sabit bir kayıt odasına sahiptir. <ol><li> En az 30 saniye, her% 100 etanol (2x),% 70 etanol (1 x) ve damıtılmış su (2x) dezenfeksiyon durulama ölçümü için. Kurumaya bırakın. Temiz bir cam petri (150 mm x 25 mm) 12 ölçümü ve kapağını kapatın - 10 koyun. </li><li> 120 ° C de 20 dakika süreyle otoklavlanmaktadır ölç. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> -20 ° C&#39;de ölçümü ve mağaza alikotları kaplama solüsyonu (maddeler listesine bakınız) hazırlayın. </li><li> Bağımsız bir steril petri kabı (35 mm x 10 mm), her MEA koyun. </li><li> Elektrotların üstüne 150 ul soğutulmuş kaplama çözümü koymak ve petri kapağını kapatmak için bir soğutulmuş pipet kullanın. Yaklaşık 10 dakika sonra, üst hava kabarcıkları kontrolGerekirse elektrotlar ve yavaşça bir lastik kaplı spatula ile çıkarınız. Oda sıcaklığında 1 saat bekletin. </li><li> Aspire kaplama çözeltisi kalıntıları, damıtılmış, steril su ile doğum öncesi ve embriyonik nöronlar ve 2x için optimize ortamı ile 1x yıkayın. Taraflı çevre ertesi güne kadar kullanılmadığı takdirde, kuluçka O / N 37 ° C&#39;de damıtılmış, steril su içinde tutmak. Aksi takdirde, oda sıcaklığında direkt olarak kurumaya bırakın. </li></ol> Organotipik Kültürleri Hazırlanması ve Büyüme İçin Gerekli Malzemeler 2. <ol><li> Kalsiyum içermeyen yıkama solüsyonu (malzeme listesine bakınız) hazırlayın. </li><li> Yaklaşık 20 dakika boyunca 3000 x g&#39;de, (kabarcıkların oluşumunu önlemek, hafifçe sallayarak, 1: 1) santrifüj ve steril bir tüpe açık bir içerik süzün yıkama çözeltisi içinde, tavuk plazma sulandırın. Kısım -20 ° C&#39;de cryotubes ve mağaza içine 200 ul. </li><li> Buna göre sığır plazması (200 U / ml) ve steril-filtre (0,2 um gözenek filtresi) trombinin sulandırın. Cryt içine kısım 200 ul-20 ° C&#39;de otubes saklayın. </li><li> 30 kültürler için besleyici ortam 100 ml (malzeme listesine bakınız) hazırlanması. </li></ol> 3. Omurilik Doku Diseksiyon 25 için embriyo, omurilik dilimlerinin sayısına bağlı olarak, Prosedür verim - 35 ko-kültür ve steril koşullar altında, bir laminar akış başlığı içinde hazırlanır: Not. <ol><li> Kas içine enjeksiyon yoluyla ana hayvana pentobarbital (0,4 ml) içindeki bir öldürücü doz uygulanır. Pedal çekilme refleksi kontrol ederek derin anestezi onaylayın. Başları kesilerek sezaryen ve fedakarlık ile E14 sıçan embriyolar sunun. </li><li> Steril, soğutulmuş, yıkama çözeltisi ile doldurulmuş bir petri kabına embriyoların organları aktarın. </li><li> Arka ayaklarında üstünde bir neşter ve ön ayakları üstünde başka biriyle tam bir çapraz kesim yapın ve vücuttan bacaklarda çıkarın. Sonraki frontal düzlemde bir kesim spinal co içeren arka parça viserayı ayırmak için yapmakrd. </li><li> Dilimlemek için, bir montaj disk üzerinde bir seferde omurilik biri içeren parçaları geri aktarın ve 225 kalınlığında kesilmiş - Bir doku kıyıcı ile 250 mikron. Doğranmış doku üzerinde yıkama çözeltisi bir damla koymak ve 35 mm steril, soğutulmuş, yıkama çözeltisi ile doldurulmuş x 10 mm petri kaplarına bir spatula ile dilimleri aktarın. </li><li> Ayrı ayrı dilim için, doku kalan uzak omurilik teşrih. Ekli dorsal kök ganglionlar bırakın. </li><li> Dilimleri 4 ° C&#39;de 1 saat bekletin. </li></ol> 4. ÇÇA üzerinde Omurilik Doku Dilimleri Montaj <ol><li> Inkübatör, steril besin ortamı Isınma (37 ° C, hafifçe oksijenlenme için kapağı sökülebilir). </li><li> Odak elektrod dizi stereo bir mikroskop altında bir petri oda sıcaklığında kauçuk kaplı uçları steril cımbızla Pozisyon MEA. Temiz tozsuz ve steril elektrot dizisinde tavuk plazma 6 ul damlacık ortalayın. Dikkatlice kaydırın, küçük bir spatula kullanarakventral taraf plazma damlacık içine birbirine bakacak şekilde iki omurilik bölümleri. Spatula ile elektrotlara dokunmayın. </li><li> Tavuk plazma damlacık etrafında trombin 8 ul ekleyin. Trombin pipet kullanarak dikkatlice karıştırın ve iki dilim etrafında tavuk plazma / trombin karışımı yayıldı. Yine, doğrudan kırılgan elektrot dizisi dokunmayın. Sadece koagülasyon önce, aşırı tavuk plazma / trombin aspire. </li><li> MEA / kültür takımı, 37 ° C&#39;de inkübatör içinde nemlendirilmiş bir odada yaklaşık 1 saat süre ile oturur yüksek nem tutmak için petri Cap. </li><li> Dikkatle petri kap ve yaklaşık 30 dakika süreyle tekrar inkübatör içine koymak, kültür odası besin ortamında 10 ul ekle. </li><li> Bir silindir tüp içine steril, kauçuk kaplı uçları her MEA / kültür tertibatını yerleştirin 3 besin ortamının ml ve sıkıca kapatın kapağı ekleyin. % 5 CO 2 inkübatör rpm - 1 dönen silindir tambur roller tüpü yerleştirin <su37 ° C&#39;de b&gt; 2-ihtiva eden bir atmosfer. </li><li> Haftada 2 kez - in vitro 7 gün (DIV) ve daha sonra 1 sonra besin orta yarısı değiştirin. </li></ol> 5. Mekanik Lezyonlar <ol><li> Odak doku ile stereo mikroskop altında besin ortamı olmadan bir petri silindir tüp ve yersiz steril, kauçuk kaplı ipuçları MEA / kültür takımını atın. Görme iki dilim kaynaşmış doğrulayın. </li><li> MEA kauçuk kaplı ipuçları cımbız yerleştirerek montaj sabit MEA / kültür tutun. </li><li> Doku dilimleri yakın MEA oluk bir neşter bıçak yerleştirin. Yerine yatay neşter tutun. </li><li> Neşter kadar idare ancak neşter bıçak tabanından bıçak &quot;rulo&quot; ipucu ve böylece oluk kapsayan doku içinden keser o şekilde MEA oluğuna kalmana izin kaldırın. </li><li> 25 G iğne ucu necess ise şiddetli herhangi bir kalıntı doku bağlantılarıli. Oluk içindeki alanda sadece iş ve ihale kenarları dokunmayın. </li><li> Silindir tüp içine geri MEA / kültür tertibatını koyun. Kültürlere taze besin ortamının 3 ml sağlayın ve inkübatör silindir tambur içine geri koyun. </li></ol> Spontan Faaliyet 6. Elektrofizyolojik Kayıtlar <ol><li> DIV seçilen sayıdan sonra iki omurilik dilim arasındaki fonksiyonel rejenerasyon araştırmak için, bir mikroskop bir kayıt odasındaki MEA / kültür tertibatını monte ve yaklaşık 500 ul hücre dışı çözüm (malzeme listesine bakınız) uygulanır. </li><li> Sistem stabilize etmek için izin ilk kayıttan önce 10 dakika bekleyin. </li><li> RT&#39;de MEA her aktivite tespit elektrottan yaklaşık 10 dakika süreyle Tutanak temel spontan aktivite 2x. </li><li> Istikrarlı dışı koşulları sağlamak her kayıt seansından sonra hücre dışı çözüm alışverişinde. </li><li> Ağ disinhibit için, hücre-dışı çözelti, co geçerlidirstriknin (1 uM) ve gabazine (10 uM) ntaining. Kayıt başlamadan önce en az 2 dakika bekleyin. </li></ol> 7. Veri analizi Not: ekstraselüler kaydedilen aksiyon potansiyellerinin tespiti için her bir elektrodun standart sapmaları ve sonraki diskriminatör dayalı bir dedektör kullanmak. Bu prosedür, Tscherter ve ark., 3 detaylı olarak tarif edilmektedir. <ol><li> Standart prosedürlerle 3 (Şekil 1F) uygun bir tarama planı her elektrotun tespit nöronal aktivitenin gösterir. </li><li> Belirleyin ve 1 msn adımlarla kaydırılır 10 msn kayar pencere içinde uygun kanallar olayların sayısını toplanarak her bir dilim için toplam ağ etkinliğini görüntüler (Şekil 1G ve Tscherter ve ark., 3). </li><li> Her dilim ayrı patlamaları (birkaç elektrotlar üzerinde görünen faaliyet kümeleri) algılamak. Bu nedenleKarşılık gelen toplam ağ etkinliği minimal zirve faaliyeti eşiğini ayarlamak ve her patlama başlangıç ​​ve patlama sonunu tanımlar. Örneğin, uygun bir eşik ortalama patlama genliği% 25 ve bir patlama başlangıç ​​olarak bir zaman penceresinde son olay olmanın en az 5 ms, bir patlama bitiş bir zaman penceresinde ilk etkinlik olma tanımlanabilir en az 25 milisaniye (HEIDEMANN ve ark. 10). </li><li> Fonksiyonel rejenerasyon iki dilim arasında senkronize patlamaları yüzdesini hesaplamak ölçmek için. Bunu yapmak için, bir dilim bir patlama ve diğer dilim aşağıdaki kaymasının arasındaki gecikmeyi hesaplamaktadır. Not: gecikme ortalama patlama uzunluğundan daha küçük olduğunda bir patlama çifti olarak adlandırılan &quot;senkronize&quot; dir. Özellikle birçok aktivite ile ko-kültürlerde olasılığı her iki tarafın tesadüfen seçilen gecikme pencerede bir patlamasını başlatılmasını dair kanıtlar vardır. Bu durum, sy yüzde miktarının dikkate alınmalıdırnchronized patlamaları. Hesaplamalar ayrıntılı bilgi için Heidemann ve ark bakın. 10. </li></ol> Kültürler ve İmmünohistokimya 8. Tespit <ol><li> Yıkama veya inkübasyon dahil tüm adımlar için doku içinden çözümün doğru yayılmasını sağlamak için bir devirme masaya kültürleri koymak emin olun. </li><li> Kayıt oturumu kurulumu dışında MEA / kültür takımını almak bittikten sonra doğrudan, bir petri (35 mm x 10 mm) koymak ve yaklaşık 2 ml ekstrasellüler çözüm ekleyin. </li><li> In vitro süre boyunca oluşmuş çevreleyen hücre katmanlarından dilimleri ayırmak için, 10 ul pipet alabilir ve dilimleri daire. Kültürleri zarar vermemeye dikkat edin. Bu aşamasını atlamak ancak gerçekleştirildiğinde daha sonra gömme kolaydır mümkündür. </li><li> Ince bir ametal şırınga iğne kullanın dışı soluti ile dolu bir 1 ml şırınga ile birlikte (materyalleri listesi bakınız)yavaşça MEA kapalı kültürünü darbe için. </li><li> Pasteur pipet ucu çıkarın ve slivered ucundaki lastik ampulü takınız. (Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 0.1 M) ile% 4 paraformaldehit) fiksatif içine kültür aktarmak için arka uç kullanın. Çok küçük ve kültürler katlanmış olacak ve muhtemelen tahrip çünkü transferi için Pasteur pipet ucu standart kullanmayın. 4 ° C&#39;de 2 saat - 1 saptamak için. Distile su ile durulayın ve MEA parmak uçları ile doku artıkları çıkarmak ama çivi ile çizmeyin. 4 ° C&#39;da damıtılmış su içinde mağazası ÇÇA&#39;lar </li><li> En az 10 dakika her biri PBS içinde 3 kez yıkanır Kültürlerin. 4 ° C de PBS içinde saklayın veya doğrudan boyama işlemi ile başlar. </li><li> Çözeltisi (% 5 keçi serumu,% 1 sığır serum albümini, PBS içinde% 0.3 deterjan) bloke en az 90 dakika boyunca kültürler inkübe edin. </li><li> Bloke çözeltisi içinde seyreltilmiş birinci antikor ekleyin ve 4 ° C &#39;de 3 gece inkübe edilir. </li><li> L at için PBS içinde yıkayın 3xdoğu 30 dakika her. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS içinde seyreltilmiş ikinci bir antikor ekleyin. </li><li> En az 30 dakika her biri için PBS içinde yıkama 3x. </li><li> Bir nesne slayt kaldırılmış ucu ile Pasteur pipeti ile dilimleri aktarın. Aşırı PBS çıkarın ve orta montaj embed. </li></ol>

<ol>
	<li>Avossa, D., Rosato&#8211;Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+circuits+formation:+a+study+of+developmentally+regulated+markers+in+organotypic+cultures+of+embryonic+mouse+spinal+cord.">Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord.</a> Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).</li><li>Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+developmental+profile+of+neurons+and+glia+in+motor+nuclei+of+the+brainstem+and+spinal+cord,+and+its+comparison+with+organotypic+slice+cultures.">Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures.</a> Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).</li><li>Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+characterization+of+rhythmic+activity+in+rat+spinal+cord+slice+cultures.">Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).</li><li>Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+oscillations+of+spiking+activity+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).</li><li>Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+correlated+spontaneous+activity+in+the+assembly+of+neural+circuits.">A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits.</a> Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).</li><li>Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rhythmic+patterns+of+activity+by+ventral+interneurones+in+rat+organotypic+spinal+slice+culture.">Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture.</a> J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).</li><li>Hanson, M. G., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+patterns+of+spontaneous+activity+are+required+for+correct+motor+axon+guidance+and+the+expression+of+specific+guidance+molecules).">Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules).</a> Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).</li><li>Courtine, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+supraspinal+control+of+stepping+via+indirect+propriospinal+relay+connections+after+spinal+cord+injury.">Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury.</a> Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).</li><li>Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+intraspinal+connections+in+a+new+in+vitro+model.">Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model.</a> Neuroscience. 262, 40-52 (2014).</li><li>Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+motor+neurons+corelease+glutamate+and+acetylcholine+at+central+synapses.">Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).</li><li>Tsuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+induces+selective+motor+neuron+death+in+organotypic+slice+cultures.">Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).</li><li>Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+activity+and+positive+feedback+in+motor+circuits+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).</li><li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture.">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).</li><li>Mentis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncholinergic+excitatory+actions+of+motoneurons+in+the+neonatal+mammalian+spinal+cord.">Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).</li><li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+are+rich+in+non&#8211;phosphorylated+neurofilaments:+Cross&#8211;+species+comparison+and+alterations+in+ALS.">Motor neurons are rich in non&#8211;phosphorylated neurofilaments: Cross&#8211; species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Res. 861 (45&#8211;58), (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Sunulan prosedürde çeşitli unsurlar doğru ve tekrarlanabilir deneyler başarı için esastır. ÇÇA&#39;lar, çözeltilerin hazırlanması ve dilim kültürlerinin üretimi sırasında tüm adımlar bir laminer akış başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilir. Onlar kendiliğinden aktiviteyi 14 etkileyebilir çünkü antibiyotikler besin ortamına uygulanmaz. MEA kaplama sırasında, en önemli kısmı ekstrasellüler matriks jel çözüm her zaman soğuk kalır emin olmaktır. Buzdolabında ve tüm işlem için buz üzerinde tutmak o çözülme 0 ° C&#39;ye yakın bir maksimal sıcaklığını sağlamak için. Buz soğuk diseksiyon tamponlar kullanarak düşük sıcaklığa dilim hızlı izolasyon ve kesit hazırlanması yanı sıra ödeme dikkat sırasında sağlıklı kültürlerin yüzdesini arttırır. Ayrıca, plazma / trombin koagülasyon en kritik adımlardan biridir. İlk olarak, plazma düzgün Mixe emin oluntrombin d. İkinci olarak, ÇÇA için dilimler düzgün eki sağlamak için mümkün olduğunca fazla kalıntı kaldırılması için özel dikkat. Bu adım son derece zaman duyarlıdır; zaman çerçevesi çok kısa ise, plazma / trombin karışımı çok fazla kaldırılır. Zaman çerçevesi çok uzunsa, pıhtılaşma zaten artık plazma / trombin ile birlikte dilimleri kaldırarak riskini artıran oldu. Mekanik lezyonlar planlanan, bu doğru bir tasarıma sahip ÇÇA kullanmak önemlidir. Lezyon amaçlanan alan elektrotlar, teller ve yalıtımın serbest olması gerekir. Aksi takdirde, MEA elektrik hasarlı ve bu nedenle, hiçbir kayıtlar artık yapılabilir gidiyoruz. Başka önemli bir adım lezyonun boyutunu ilgilidir. Bu lezyon sonrası iki genç dilim bağlamadan iki gün 10 alır, daha önce gösterilmiştir. Tüm deneyler için, kural uzay betwe olduğu kullanıldılezyon sonrası dilimleri en MEA oluk (300 um) genişliğinden daha büyük olması gerekir. Lezyon hiçbir yeniden bağlanma hiç, çok büyük ise A büyük lezyon boyutu, yeniden bağlanma için daha uzun bir zaman dilimi içinde sonuçlanabilir veya olabilir. Açıklama, eski deneyler ortaya koyduğu çok düşük bağlantı hızı bir başlangıç ​​iki dilim yerleştirilmesi daha uzağa 1 mm&#39;den sonuçları. Bunun yerine kuluçka 37 ° C kayıtları, oda sıcaklığına kadar, en az 10 dakikalık bir ayar süresi, başlamasından önce, ve hücre dışı çözeltiye yerine yetiştirme ortamı önerilmektedir. Bu ilk dakika boyunca faaliyet desen yakın gözlem ölçülen veri kayıt başlandı uygun sonra kültür patlaması modelini temsil sağlar. Aktivite, veri toplama ve ileri işleme tespiti için, ev yapımı donanım, Lab programları (, amplifikatörler ve amplifikatörler bağlantıları odasına kayıt)GÖRÜNTÜSÜ, C ++, IgorPro kullanılır. Ticari MEA kurulumları ve diğer yazılım paketleri bu işlemler için de uygundur. Burada, elektrotlar tarafından görülen sinyaller 1001 defa büyütülmüş ve daha sonra 6 kHz hızında dijitalize edilmiştir. In vivo, onlar artan ve lif yolları azalan müdahalesi olmadan çalışmak zordur, çünkü sunulan model propriyospinal bağlantıları incelemek için yararlı bir araç olabilir. İki omurilik dilim eş kültür zarif bu sorunu aşmak olabilir. Kültürler sıkı kontrol ve kolayca manipüle edilebilir bir mikro sağlamak. Öte yandan, Supraspinal ve duyusal giriş eksik tabii ki. Buna ek olarak, kültür hazırlama süreci CNS hasar durumu temsil etmektedir. Astrositler ve mikroglia gibi glial hücreler, bu nedenle artan proliferasyon ve lezyonlarda yanıt bilinmektedir, doku yeniden bir ölçüde olduğunu. Sunulan moda İlişkinmekanik lezyonlar gerçekleştirdikten sonra l glial skar oluşumu gözlenmemiştir. Bir açıklama astrositlerden adaptif mekanizmalar zaten hazırlık sürecinde tetiklenen olduğunu ve kültürlerin lezyonları daha da tepkiye neden olmadığını olabilir. Ayrıca, myelin ilişkili inhibitörlerinin katılımı için, örneğin herhangi bir kanıt yoktur., Nogo-A, eski bir yaşta lezyonlu kültürlerin düşük rejenerasyon potansiyeli. Bununla birlikte, Rolipram, dilim 10 arasında 23 DIV artar fonksiyonel rejenerasyon lezyon gerçekleştirdikten sonra, başlangıçtan fosfodiesteraz 4 inhibitörü ile muamelenin gördü. Bu sonuçlar, fonksiyonel iyileşme eski kültürlerde artabilir göstermektedir. Lezyon sitesini kapısı akson sayısını sayarken Gözle, genç yaşta Lezyonlu kültürler ve eski bir yaşta lezyonlu kültürler arasında hiçbir fark tespit edilmiştir. Bu bulgular aksonal rejenerasyon bu eksikliği en önemli nedeni f değil önermekveya bu nedenle kültür geç lezyonlardan sonra iyileşme kaybı ve yenilenme fonksiyonel analiz sağlayan bir model için gerekliliğini vurgulamaktadır. Sinaptik oluşumu ve sinaptik plastisite kurtarma işlemi 10 önemli bir rol oynayabilir. Bu mekanizmalar son yıllarda çok ilgi kazandı ve günümüzde yaygın olarak onlar omurilik hasarı sonrası sonucun üzerinde büyük bir etkiye sahip olduğu kabul edilmektedir. Bu nedenle, izolasyon ve çok detaylı bu süreçleri araştırmak için kararlı şartları sağlayan bir model kesinlikle omurilik fonksiyonel dönüşüm konusunda fikir edinmek için yardımcı olabilir.

Merkezi sinir sisteminde (CNS) Organotipik dilim kültürler nöron gelişmeden nörodejenerasyona ulaşan muhtelif fizyolojik ve patolojik fenomenler incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrışmış hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında, organotipik dilim sağlam bir hücre mimarisini ve yerel sinaptik devresi ile daha fazla karmaşıklık avantajı sunuyoruz. Aynı zamanda, dokuya in vivo bağlamda bütünün karışıklık bulaştırmak için gerek kalmadan bir izole edilmiş şekilde analiz edilebilir. Ayrıca, tercih edilen hücrelere kolay ve tekrar erişim garanti edilir hücre dışı ortamı hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve genellikle in vitro modelleri, in vivo göre daha az maliyetlidir. Son yıllarda, çeşitli çalışmalar mukabil yaşayan hayvanların 1,2 karşı uzun vadeli kültürlerinin gelişim profiller arasında çarpıcı benzerlikler sundu. Çeşitli merkezi sinir sistemi regio bu nöronal devreler gösterilmiştirns geliştirme sırasında spontan ağ etkinliğini ifade ve organotipik dilimleri kısmen bu fenomeni 3 -7 korumak. İzole spinal kord hazırlıkları özellikle ritim nesil 6 ve nöronal devrelerin 1 oluşumunu araştırmak için kullanılmıştır. Organotipik dilim spontan aktivite kayıt için bir yol çoklu elektrot diziler (ÇÇA) üstünde kültürüne onları etmektir. Bu cihazlar çok sayıda eşzamanlı hücreleri (multi-unit kayıt) aksiyon potansiyelleri tarafından oluşturulan hücre dışı potansiyelleri izleyebilirsiniz birden elektrotlar içerir. MEA kayıtları yüksek zamansal çözünürlüğü verilen nöronal devrenin içinde kesin aktivite dinamiklerini yeniden kullanılabilir. Ayrıca, aksine yama-sıkma tekniği nöronlar davranışlarında etkilenmez gerçeği uzun vadeli ölçümleri ve sonuçları izin veren, non-invaziv olduğunu. Fya da Bu çalışmanın amacı, omurilik organotipik ko-kültür ve çoklu kayıtları kombinasyonu omurilik içinde fonksiyonel rejenerasyon araştırmak için kullanıldı. Yetişkin yüksek omurgalıların omuriliğin hasar kurtarmak için potansiyeli sınırlı olduğundan, farklı stratejiler omurilik yaralanması sonrası rejenerasyon teşvik etmek çalışılmıştır. Şimdiye kadar, kortikospinal yolu genellikle bu tür soruşturmaların için seçim model sistem olmuştur. Bu deneyler genellikle zaman alıcı, pahalı ve sonucu tek gruplar içinde yüksek değişkenliğe büyük hayvan kohortlardan gerektirir. Dahası, kanıt propriyospinal bağlantıları (tamamen omurilik içinde sınırlıdır nöronlar) omurilik lezyonları 8 Aşağıdaki toparlanma sürecine çok önemli bir rol oynayabilir düşündürmektedir. Bu elyaflar artan ve elyaf yolları azalan müdahalesi olmadan, in vivo çalışma zordur. Bonnici ve Kapfhammer 9, uzunlamasına omurilik kullanılanalternatif bir yaklaşım olarak doğum sonrası farelerin dilim kültürleri. Mekanik lezyonlar yaptıktan sonra onlar yarı kantitatif omurilik segmentleri arasında akson morfolojik rejenerasyonu analiz. Onlar olgun yaşta kesilen kültürlerde lezyon sitesini kapısı az değil hiçbiri aksonlar gözlemlenmiştir. 7 gün sonra, hasar - Buna karşılık, daha genç bir aşamada lezyonlu sonunda kültürler 5 aksonal rejenerasyon yüksek miktarda gösterilir. Ancak, fonksiyonel bağlantıları için kanıt sundu değildi. Bu nedenle, fonksiyonel rejenerasyon soruşturma sağlar propriyospinal liflerin vitro model bir temsilcisi gelişimi omurilikte rejeneratif süreçleri ile ilgili bilgimizi genişletmek için değerli bir araç olabilir.

<table><tbody><tr><td>Planar multielectrode array</td><td>Qwane Biosciences</td><td></td><td>custom-made according to the design of our lab</td></tr><tr><td>Nutrient medium</td><td></td><td></td><td>For 100 ml</td></tr><tr><td>Dulbeccos modified Eagle&#039;s medium</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>80 ml</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Gibco</td><td>26050-070</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>distilled, sterile water</td><td></td><td></td><td>10 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nerve growth factor-7S [5 ng/ml]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0513</td><td>200 &amp;micro;l</td></tr><tr><td colspan="4">reconstituted in wash solution with 1% BSA</td></tr><tr><td>Coating solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracellular matrix gel</td><td>BD Biosciences</td><td>356230</td><td>Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td></tr><tr><td>medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Wash solution</td><td></td><td></td><td>[mg/L]</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>400</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>60</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>8,000</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; anhydrous</td><td></td><td></td><td>48</td></tr><tr><td>D-Glucose (Dextrose)</td><td></td><td></td><td>1,000</td></tr><tr><td colspan="4">According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td></tr><tr><td>Extracellular solution (pH 7.4)</td><td></td><td></td><td>[mM]</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>4</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Na-pyruvate</td><td></td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Blocking Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detergent: Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0.3%, harmful if swallowed</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td>1%</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>5%</td></tr><tr><td>Chicken Plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2366</td><td>Lyophilized, reconstitute with wash solution</td></tr><tr><td>Gabazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SR-95531</td><td></td></tr><tr><td>Mecamylamine hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>2843</td><td>toxic if swallowed</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td></td><td></td><td>harmful, 4%</td></tr><tr><td>SMI-31</td><td>Covance</td><td>SMI-31P</td><td></td></tr><tr><td>SMI-32</td><td>Covance</td><td>SMI-32R-500</td><td></td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td>toxic</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Merck Millipore</td><td>1123740001</td><td>irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution</td></tr><tr><td>Tissue culture flat tube 10 (= roller tube)</td><td>Techno Plastic Products AG</td><td>91243</td><td></td></tr></tbody></table>

investigating functional regeneration in organotypic spinal cord co-cultures grown on multi-electrode arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

E14 fare embriyonlarının omurilik türetilmiş ko-kültürler fonksiyonel iyileşme potansiyeli araştırmak için, lezyon 28 DIV 8 bir zaman penceresi içinde yapıldı. 2 ila 3 hafta sonra, kendiliğinden nöron faaliyeti ÇÇA (Şekil 1 C ve D) ile kaydedildi. Ekstraselüler kaydedilen aksiyon potansiyelleri, her bir elektrot (Şekil 1E) çevrimdışı tespit edilmiştir. Ağ etkinlik araziler takip raster araziler oluşturulan bu verilerin (Şekil 1F), Dan yan (Şekil 1G) başına ayrı ayrı toplam aktiviteyi görselleştirmek için. Her dilim spontan aktivite genellikle öbekler halinde düzenlenmiştir. Dilimler işlevsel bağlıysa, bu patlamaları bir dilim diğer yaymak olabilir. Bu nedenle, iki dilim arasında senkronize kaymalarının miktarı kantitatif fonksiyonel rejenerasyon ölçmek için hesaplandı. Nasıl dönüşüm int ayrıntılı bilgi içinFarklı araziler o yapılır ve senkronize aktivitenin yüzde hesaplama formülü türetilmiştir nasıl, Heidemann ve ark., 10 bakınız edilir. Tüm deneylerde, etkinliği ilk standart koşullar altında kaydedilmiştir. İkinci bir aşamada, sinaptik inhibisyonu, hücre dışı banyo çözeltisine striknin (1 uM) ve gabazine (10 uM) ilave edilerek bloke edilmiştir. Bu disinhibisyon patlamaları tanımını ve böylece dilimleri arasındaki patlama senkronizasyon belirlenmesini kolaylaştırır uzamış patlamaları ve patlama aralıklarla daha düzenli bir aktivite deseni, genellikle yol açar. Genç yaşta lezyonlu Kültürler - kültürleri sonraki aşamalarda (&gt; 19 DIV) (Şekil 2 A yenilemek yeteneği belirgin bir azalma gösterdi de lezyonlu ise (7 9 DIV) 2-3 haftalar lezyon sonra senkronize aktivitenin yüksek miktarda görüntülenen - F). Bu bulgular rejenerasyon yeteneği olduğunuspinal kord kesit kültürlerinde işlevsel bağlantıların kültür üç hafta içinde in vivo olarak daha gelişmiş olan, temsil eden düşük bir seviyeye, in vivo olarak embriyonik durumu temsil eden yüksek düzeyde azalır. Bağlantıların ne tür aslında iki dilim arasına daldı eşitleme katılıyor? Propriyospinal bağlantıları yanı sıra, lifler de motonöronlar veya dorsal kök ganglion nöronlarının ortaya çıkabilecek. Bu omurilik 10 dilimler arasındaki dorsal kök ganglion nöronları fonksiyonel bağlantı hakkında olmadığını önceden gösterilmiştir. Bununla birlikte, motor nöronlar dahil olması olasılığı kalmıştır. Motor nöronlar nikotinik reseptörlerin 13 ile omurilik nöronlarına kolinerjik bağlantılar oluşturmak bilindiğinden, omurilik ko-kültürler aktivitesi 8 DIV, kültürler yüksek aktivitesi 10 senkronize göstermektedir bir anda ve nikotinik antagonist Mecam kaydedilmiştirilamin (MEC, 100 uM) hücre-dışı banyo çözeltisine ilave edildi. Iki dilim arasındaki bağlantının motor nöronlar bir katılımı senkronize bir aktivite azalması yüzdesi ile sonuçlanacaktır. Ancak, bu durumda değildi (MEC: 91.0 ± 4.5% n = 7; kontrolü: 93.6 ± 4.6%, n = 7, p&gt; 0.05, Wilcoxon eşleştirilmiş çifti testi). Bu sonuçlar kolinerjik sinaps dilimler arasındaki fonksiyonel bağlantının katkıda olmadığını göstermektedir. Motor nöronlar, aynı zamanda merkezi sinir sistemi 11, 15 içindeki sinapslarda glutamat salgılamaktadır gösterilmiştir Bununla birlikte, bu deneyler, tamamen katılımlarını dışlamaz. SMI-32 uygulandı ile motonöronlar olmayan fosforile nörofilaman H karşı immünohistokimyasal lekelenmelerinin tespit etmek. Bu dilim (Şekil 3A) üzerine dağıtılmış motonöronlar için tipik birçok etiketli büyük hücre gövdeleri, ortaya koymuştur. SMI-32 antikoru motoneuro hücre gövdelerini etiketlemek için bildirilmiştirns 12 ve bu bulgu da kullanılabilir kültürler 13 için de geçerlidir. Ayrıca, B-III-tubulin veya neun yanı sıra glial hücre gövdeleri, örneğin. Karşı genel örneğin nöronal hücre gövdeleri, bir renklendirmeler, GFAP antikoru ile astrositler diğer raporlar doğrultusunda ve (bu hücre tiplerinin morfolojik açıklamalarını maç Şekil 3 B - D). Bununla birlikte, SMI-32 antikoru ile akson etiketlenmesi (Şekil 3E) ile ilgili olup. Beklentilerin aksine, bu antikor kullanarak liflerin büyük bir ağ görünür ve fosforile nörofilaman H (Şekil 3F) etiketleri SMI-31 boyanma benzer. Bu sonucun bir yorumu nörofilaman fosforilasyonu / defosforilasyonundan gelişimsel düzenleme, in vivo duruma göre kullanılan kültürlerde olduğu gibi sıkı olmadığını olabilir. Aynı akson fosforile ve fosforilatlanmamış nörofilament karışık olay Expl olabilirBu bulguyu değilim. Başka bir olasılık SMI-32 etiketli aksonlar projeksiyon nöronlarının kaynaklanan olmasıdır. Tsang ve arkadaşları 16 o örneğin göstermiştir, Clark&#39;ın sütun ve sütun intermediolateral hücre nöronlar motor nöronlar yanında SMI-32 tarafından boyandı. Bu tür nöronların belirgin nörit çoğalması da SMI-32 pozitif liflerin bolluğu açıklayabilir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" /> Şekil 1. Ekran ve spontan Faaliyet Analizi. (A) MEA diyagramı. Platin örtülü elektrotlar, siyah, kırmızı, şeffaf teller ve sarı MEA ortasında oluk tasvir edilmiştir. (B) MEA merkezinde bulunan elektrot dizisinin Close-up. Diyagramları nazik M. Heuschkel tarafından sağlanmaktadır. (C) 8 SAYI eski Kültür Parlak alan görüntüe. Dilimler büyüdü ve birbirine bakan kenarları boyunca kaynaşmış. Sarı bar MEA electrode- ve yalıtım gerektirmeyen oluk temsil eder. Deneylerin Ölçek çubuğu = 400 mikron (D) Timeline. E14 sıçan embriyoların iki spinal kord dilimleri ÇÇA üzerinde yanyana yerleştirilir. Birkaç gün içinde, dilim büyür ve sigorta birbirine bakan kenarları boyunca. 8 bir zaman dilimi içinde - 28 DIV, tam lezyonlar füzyon sitesi üzerinden yapılmaktadır. İki üç hafta sonra spontan aktivite kaydedilir ve kültürler immünohistokimyasal boyamalar için sabittir. (E), bir 23 DIV eski kültürün her bir elektrot spontan aktivite izleri. Net görselleştirme için, sadece her iki eser gösterilmiştir. Turuncu izleri sol taraftan sağ tarafta dilim kaydedilmiştir aktivite, mavi izleri betimliyor. Patlamaların çoğu ikisi arasındaki senkronize edilir. Sol dilim sadece p meydana gelen bir patlama ok noktalarıartially doğru dilimine yayılır. Sağ dilim etkinliği Ancak göre yan ortalama maksimal zirve aktivitesinin en az% 25 seçilmiş eşiğine ulaşamadı ve bu nedenle, bir patlama olarak algılanmaz. Sağdaki büyütme son senkronize patlama çifti tasvir. (E) &#39;de gösterilen faaliyet (F) Raster çizimi. (E) &#39;de gösterilen faaliyet tanımlanan patlamaları (taban çizgisinin altına çubuklar) ile (G) Ağ etkinliği arsa. Heidemann ark. 10 uyarlanmıştır. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" /> Şekil 2. Değil Senkronize Faaliyet karşı Senkronize. (A, B) kültürlerin Raster araziler lesioneGenç yaşta d (7 at - 9 DIV), standart koşullarda (A) ve disinhibisyon altında (B) kapsamında senkronize aktivitesini gösteren. (C, D) standart koşullar (C) ve disinhibisyon altında (D) altında olmayan senkronize aktivitesini gösteren (&gt; 19 DIV at) bir yaşta lezyonlu kültürlerin Raster araziler. Senkronize aktivitesi (E, F) ortalama yüzdesi, standart koşullar (E) ve disinhibisyon altında (F) altında kaydedilmiştir her lezyon gün için işlenmiştir. 3 hafta lezyonun gün sonra - Kayıtlar 2 alınmıştır. Heidemann ark. 10 uyarlanmıştır. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" /> FŞEKIL 3. immünohistokimyasal Karakterizasyonu. SMI-32 ile motor nöral hücre gövdeleri (A) Boyama. (B) olgun nöronal hücre gövdeleri ve süreçlerin β-III tubulin etiketleme. GFAP ile astrositlerde (C) Kimlik. Neun olgun nöronal hücre gövdesinin (D) Etiketleme. SMI-31 tarafından tanımlanan fosforilatlanmamış sinir lifi H. (F) Fosforlaştırılmış nörofilaman H (E) SMI-32 boyanması. Heidemann ark. 10 uyarlanmıştır. Her ikisi de dikkat edin, SMI-31 ve SMI-32, liflerin büyük bir ağ kültürlerinde görülebilir. Barlar AD = 20 um, H &amp; F = 100 mikron. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays at JoVE.com

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Burada in vitro propriyospinal bağlantıları işlevsel rejenerasyonu çalışma çoklu elektrot dizileri üzerinde kültürlü omurilik dilimleri dayanan bir protokol mevcut.

Çok elektrot Dizileri Yetiştirilen Organotipik Omurilik Co-kültürler Fonksiyonel Rejenerasyon incelenmesi

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

investigating-functional-regeneration-organotypic-spinal-cord-co

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.0K Görüntüleme.  University of Bern.  Burada in vitro propriyospinal bağlantıları işlevsel rejenerasyonu çalışma çoklu elektrot dizileri üzerinde kültürlü omurilik dilimleri dayanan bir protokol mevcut. 

Video: Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Biyomühendislik

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Nörobilim

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Kültür Bulaşık A Fonksiyonel Motor Birim: Omurilik Eksplantlarından ve Kas Hücrelerinin Co-kültür

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Beyazlatılmış Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Ensheathing Glia ile Birlikte, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun In Vitro Modeli Olarak

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) pathophysiology in vitro. Multi-electrode array (MEA) recordings are a means to record electrical field potentials from large populations of neurons and analyze network activity over time. It was previously demonstrated that the presence of hiPSC-A that are differentiated using techniques to promote a spinal cord astrocyte phenotype improved maturation and electrophysiological activity of regionally specific spinal cord hiPSC-motor neurons (MN) when compared to those cultured without hiPSC-A or in the presence of rodent astrocytes. Described here is a method to co-culture spinal cord hiPSC-A with hiPSC-MN and record electrophysiological activity using MEA recordings. While the differentiation protocols described here are particular to astrocytes and neurons that are regionally specific to the spinal cord, the co-culturing platform can be applied to astrocytes and neurons differentiated with techniques specific to other fates, including cortical hiPSC-A and hiPSC-N. These protocols aim to provide an electrophysiological assay to inform about glia-neuron interactions and provide a platform for testing drugs with therapeutic potential in ALS.

We describe a method for differentiating spinal cord human induced pluripotent-derived astrocytes and neurons and their co-culture for electrophysiological recording.

ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

<meta charset="utf8"></head><body>Beyin Topluluklarında Ağ Aktivitesinin Kaydedilmesi: Çok Elektrotlu Dizi Yaklaşımı

A Multi-Electrode Array Platform for Modeling Epilepsy Using Human Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Assembloids

Human brain organoids are three-dimensional (3D) structures derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) that recapitulate&#160;aspects of fetal brain development. The fusion of dorsal with ventral regionally specified brain organoids in vitro generates assembloids, which have functionally integrated microcircuits with excitatory and inhibitory neurons. Due to their structural complexity and diverse population of neurons, assembloids have become a useful in vitro tool for studying aberrant network activity. Multi-electrode array (MEA) recordings serve as a method for capturing electrical field potentials, spikes, and longitudinal network dynamics from a population of neurons without compromising cell membrane integrity. However, adhering assembloids onto the electrodes for long-term recordings can be challenging due to their large size and limited contact surface area with the electrodes. Here, we demonstrate a method to plate assembloids onto MEA plates for recording electrophysiological activity over a 2-month span. Although the current protocol utilizes human cortical organoids, it can be broadly adapted to organoids differentiated to model other brain regions. This protocol establishes a robust, longitudinal, electrophysiological assay for studying the development of a neuronal network, and this platform has the potential to be used in drug screening for therapeutic development in epilepsy.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: İnsan Beyin Assembloidlerinin Çok Elektrotlu Dizi Tabanlı Uzun Süreli Elektrofizyolojik İzleme ile Genetik Epilepsi Çalışmalarını Geliştirme

This protocol aims to stably plate dorsal-ventral fused assembloids on multi-electrode arrays for modeling epilepsy in vitro.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Topluluklarını Kullanarak Epilepsiyi Modellemek için Çok Elektrotlu Bir Dizi Platformu

Human brain organoids are three-dimensional (3D) structures derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) that recapitulate&#160;aspects of fetal ...

Studying the Regeneration of Functional Connections between Spinal Cord Slices Using a Multi-Electrode Array

Source: Heidemann, M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53121">Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. (2015).
The video demonstrates the functional regeneration of propriospinal connections using a multi-electrode array (MEA)-based assay. The spinal cord slices are placed on the MEA and are allowed to fuse. The fused slices are mechanically separated by creating a lesion, inducing propriospinal neurons to grow over the lesion and connect the slices. The electrical activity of the slices is assessed to identify the regeneration of functional connections.

Omurilik Dilimleri Arasındaki Fonksiyonel Bağlantıların Çoklu Elektrot Dizisi Kullanılarak Yeniden Üretilmesinin İncelenmesi

1. Preparation of MEAs
Note: MEAs are composed of a glass substrate, micro-fabricated metal electrodes and a SU-8 polymer insulation layer. For the ...

Çok elektrot Dizileri Yetiştirilen Organotipik Omurilik Co-kültürler Fonksiyonel Rejenerasyon incelenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Kültür Bulaşık A Fonksiyonel Motor Birim: Omurilik Eksplantlarından ve Kas Hücrelerinin Co-kültür

Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji

Beyazlatılmış Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Ensheathing Glia ile Birlikte, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun In Vitro Modeli Olarak

ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Topluluklarını Kullanarak Epilepsiyi Modellemek için Çok Elektrotlu Bir Dizi Platformu

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Topluluklarını Kullanarak Epilepsiyi Modellemek için Çok Elektrotlu Bir Dizi Platformu

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Topluluklarını Kullanarak Epilepsiyi Modellemek için Çok Elektrotlu Bir Dizi Platformu

Omurilik Dilimleri Arasındaki Fonksiyonel Bağlantıların Çoklu Elektrot Dizisi Kullanılarak Yeniden Üretilmesinin İncelenmesi