Name: molecular probe optimization to determine cell mortality in a photosynthetic organism (microcystis aeruginosa) using flow cytometry
Uploaded: 2016-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry at JoVE.com

Yazarlar araştırma ve tesisler için destek ve finansman için doktora öğrencisi Dave Hartnell ve Bournemouth Üniversitesi kabul etmek istiyorum.

Moleküler Probe ve Akış Sitometre 1. hazırlanması <ol><li> Ultra saf süzüldü H2O gerekli konsantrasyonlarda alikuota dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 5 mM çözelti olarak tedarik edilir, nükleik asit prob, ana solüsyonları seyreltin </li><li> 25 o C kadar kullanım - -5 o C arasındaki karanlık koşullarda nükleik asit probları saklayın. </li><li> Akış sitometresi ve yük yazılım paketi açın (FCM özellikleri için Malzeme / Ekipman tabloya bakınız). </li><li> Numune enjeksiyon probu (SIP) boş bir hemoliz tüpü (12 x 75 mm) koyun, FCM temizleme işlemini başlatmak için geri floş sonra unclog ve tıklayın. NOT: SIP için bazı örnek aşamaları mikrosantrifüj tüpler dahil tüpler çeşitli barındırabilir. FCM tertibatında kullanılan moleküler prob seyreltici madde ve kılıf sıvısı analitik dereceli &quot;tip 1&quot; 0,22 um membran filtre kaynağı yer alıyor. </li><li> Yeri15 dakika karıştırıldı ve hızlı bir akışkan hızına (veya&gt; 66 | il / dakikalık bir akış oranı) - SIP, aşırı saf, süzüldü, H2O, 2 ml taze bir hemoliz tüpü 10 için bir zaman limiti belirlemek. </li><li> Arka plan gürültüsünü azaltmak ve &#39;koşmak&#39; tıklayın floresan ve ışık yayılımı kanallar hakkında eşikler koymak yeni bir veri hücresini seçin. </li><li> Saniyede toplam etkinlik üretici firmaların tavsiyelerine altında değilse, o zaman oruç 2 dakika süreyle dekontaminasyon solüsyonu 2 ml örneği çalıştırmak ve daha sonra 1.4 ve 1.5 adımları tekrarlayın. NOT: modelleri arasında değişebilir olarak, start-up protokolleri temizlik FCM için üreticilerin öneriler kontrol ediniz. Belirli eşikleri için test de bazı ekipman arttırmak veya optik dedektörler kaydedilen elektrik sinyali azalan photomultiplier tüpleri (Proje Yönetim Ekipleri) için gerilimler kazanımları uygulamak için izin verir FCM modeli ile uyumlu olması gerekir. Bu deney kullanılan FCM modeliment gerilim PMT sabit ve parçacıkları daha küçük 2.0 mm ve elektronik gürültü dışlamak için 80,000 ileri ışık yayılımı (FSC-H) bir eşiğini kullandı. </li></ol> Kültürler ve İlk Hücre Sayımı 2. Hazırlık <ol><li> 120 o C&#39;de 20 dakika boyunca 250 ml&#39;lik bir cam kaba alg ortam (x50 konsantrasyonu), aşırı saf, süzüldü H2O ve 2 ml Otoklav 98 mi </li><li> SIP kapsamında bir tüp içine, yüksek kararlı durum yoğunluğu yer örnek 2 ml M.aeruginosa (7806 PCC) bir ilk tarımı kaynaktan. Vorteks veya sonikasyon 20 herhangi bir koloni oluşumunu bölmekte ve ışık mikroskobu ile eşit dağılmış hücreleri onaylayın. NOT: Ultrasonik dalgalar aşırı maruz kalma hücre erimesi neden olabilir ve dikkatli kullanılmalıdır. Böyle yan ışık yayılımı olarak çıkışlar (M.aeruginosa gibi türlerde bulunan gibi) sonication gaz veziküller daraltabilirsiniz beri (SSC-H) yoğunluk se daha olabilirnsitive. </li><li> FCM yazılımı içinde, ileri ışık saçılım (FSC-H) verileri kaydetmek ve eksen üzerinde bir günlük ölçeğinde görüntülemek için &quot;log&quot; linkine tıklayarak arsa özelliklere yapılandırmak için bir histogram arsa seçin. </li><li> Ayrı bir çıkış, böyle M.aeruginosa bulunan aksesuar fotosentetik pigment phycocyanin (FL4-H, 675 ± 12.5 nm) gibi doğal floresan kaydetmek için (ekseni log) Başka bir histogram seçin. </li><li> Phycocyanin ve elde edilen floresan kaynaklanan emisyonları filtre bir dedektör heyecanlandırmak bir ışık kaynağı kullanın. NOT: fikosiyanin 600 nm üzerinde heyecanlı ve sadece kırmızı ışık kaynağı 21 ile tespit edilecektir ise fotosentetik pigment gibi klorofil olarak, yaygın olarak kullanılan 488 nm mavi lazer ile heyecanlı olabilir. Uyarma ışık kaynakları için akış sitometrelerinde üreticisi ve emisyon dedektörleri spektrumları, burada hem 488 nm ve 640 nm lazer ile kontrol ile birlikte kullanılmıştırBir 675 ± 12.5 nm optik filtre. </li><li> Hedef organizmanın (10 mikron) ve nispeten yavaş akış hızı (/ dak 14 ul) çekirdek büyüklüğüne yakın yüksek çözünürlük seçme ayarları kayıt için. NOT: En iyi çözünürlük örnekleri için saniyede olayların öneri üreten göre çalıştırılmalıdır. </li><li> Elde veri kapı dışarı ışık saçılımı ve / veya floresan sinyallerine bir eşik kullanmadan önce elektronik arka plan gürültüsü veya hücre numunesi enkaz neden olduğu. </li><li> Yeni bir veri hücre seçin bir günlük ölçeğinde FSC-H ve SSC-H parametreleri ile bir yoğunluk arsa oluşturmak ve çalıştırmak tıklayın. </li><li> Numune yoğunluğu aşırı olay oranı neden olursa, seyreltme adımlar doğruluk ve hassasiyetini arttırmak için alınabilir. </li><li> Yoğunluk arsa üzerinde arka plan gürültü ya da enkaz (FSC &lt;320000) tarafından üretilen düşük seviyeli dağılım sinyalleri, dışlamak için önceki histogram yazılım kapıları geçerlidir. Yüksek bağıl floresan Tersine kapısıfikosiyanin hücrelerinden gelen sinyaller ve sadece bu olayları (- 1950000 FL4, 56000) içerir. </li><li> Ml başına kaç hücre çalışmak, kapı alanlarda kaydedilen hücre sayısını kullanın ve FCM geçti numunenin toplam hacmine bölerek. Not: Burada kullanılan FCM modeli örnek hacmi belirlenecek sağlayan bir mikroişlemci kontrollü peristaltik pompa sistemi vardır. Diğer FCM ekipman kalibre boncuk süspansiyonu veya toplam Numune hacmini doğrulamak H 2 O ağırlık / hacim farklılıkları bir hesaplama gerektirebilir. </li><li> M.aeruginosa bir parti büyüme çevriminin (250,000 hücre / ml) başlatmak için taze olarak hazırlanmıştır ortama hücrelerin gerekli hacim. NOT: Türler yani bir toplu döngüsü yaşam döngüsü aşamaları belirlemek için önceden kaydedilmiş olmalıdır onların yerinde çevre parametreleri ve besin durumuna bağlı olarak büyüme oranlarında farklılık gösterir. </li></ol> 3. OptimMoleküler Probe Hücre Alımı ve zasyon <ol><li> M.aeruginosa kültür hasat yarım üslü fazda aşama 2&#39;de hazırlanan bir &quot;canlı&quot; bir kontrol olarak kullanırlar. NOT: Düz bir üstel faza yüksek yoğunluklu kültüründen seyreltilmiş numuneler bir başlangıç ​​gecikme / indüksiyon fazından aşılanan kültürlerin karşılaştırıldığında, ölü hücre ciro yoluyla optimizasyon sonuçlarını etkileyebilir. </li><li> 30 dakika 6,11,22 1 saat, paraformaldehid veya% 4 formaldehit 60 o C&#39;de yöntemleri gibi% 70 etanol, ısıtma örnekleri kullanarak, bir &quot;ölü&quot; bir kontrol olarak, diğer yarısı hazırlayın. Numuneler mikroçevrede varyasyonları (örneğin., PH) kontrol edin. NOT: M.aeruginosa pozitif, ısı ile öldürülmüş, &#39;ölü&#39; kontrol fikosiyanin sinyalleri onun azalması yoluyla &#39;canlı&#39; örnek ayrılır. Diğer yöntemlerle mortalite uyaran aynı çıktıyı neden olmayabilir ve bir yerdedirtürlerde y. </li><li> Farklı oranları kullanılarak karışık örnekleri kurmak &#39;canlı&#39; ve &#39;ölü&#39; örnekleri (örneğin,% 0,% 25,% 50,% 100). </li><li> Vorteks veya sonikasyonla koloni oluşumunu bölmekte ve pH&#39;ı kontrol edin. </li><li> Kendi ilgili dedektör vasıtasıyla fikosiyanin sinyalleri kaydetmek için 488 nm yeşil floresan gelen kaydedebilirsiniz dedektörleri yanında lazer (FL1, 530 ± 15 nm) ve portakal (FL2, 585 ± 20 nm) nükleik asit probları ve 640 nm lazer seçin. Not: DNA ya bağlandığı zaman turuncu bir nükleik asit sondası 570 nm 547 nm ve emisyon maksimumlar bir eksitasyon dalga boyuna sahip iken, yeşil bir nükleik asit probu, 523 nm 504 nm ve emisyon maksimumlar yaklaşık flüoresan uyarma dalga boyuna sahiptir. Bir 488 nm argon iyon katı hal lazer hem moleküler problar uyarmak için kullanılabilir, ancak, (547 nm kadar) yeşil bir lazer daha yüksek bir turuncu bir floresan üretir. </li><li> Başlangıç ​​noktası olarak tanıtmaküreticileri ile moleküler prob% 50 &#39;canlı&#39; ve% 50 &#39;ölü&#39; kültüre konsantrasyonunu tavsiye ve karanlıkta inkübe edin. </li><li> Yeni bir veri hücre seçin arka plan gürültüsünü (FSC-H 80000) azaltacaktır eşikleri ve tetikleyiciler ile SIP altına numuneyi yerleştirin. </li><li> FSC-H ve SSC-H parametreleri ve üç histogramlar ile yoğunluk arsa oluşturun. Ilgili moleküler prob optik detektör kanal (FL1 veya 2), tek bir fikosiyanin emisyonlarını (FL4-H) ve bir log ölçeğinde için diğer FSC H, bütün tespit etmek için kullanılarak, bir histogram. </li><li> Zaman noktalarında (1, 5, 10, 15, 30 ve 60 dakika) bir sayıda, ayrı bir veri hücrelerinde kayıt kadar 60 dakika boyunca karanlıkta nükleik asit probları ile M.aeruginosa örnekleri inkübe edin. NOT: Belirli kimyasalların potansiyel reaksiyonlar için üretmektedir ile pH kontrol gibi parametreler ayarlarken (test nükleik asit için bir tampon fosfat veya tek değerlikli veya diva yüksek düzeyde içeremez sondalarödünç katyonları, DNA bağlanma azalacaktır gibi). </li><li> İlgili floresan prob kanal histogram içine hücre boyutu organizmalar hedef - Bir yazılım kapısı sadece FSC-H histogram (1.500.000 320.000) dahil etmek uygulayın. NOT: Bu protokolde kullanılan konsantrasyonlar arttırılması veya M.aeruginosa numune veya nükleik prob başlangıç ​​stok çözeltisi hacmi azaldığı biri ile değiştirilebilir 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ve 100 uM idi. </li><li> Floresan prob kanalında en yüksek histogram tepe (- 1650000, turuncu FL2-H, 30.000 - Yeşil FL1-H, 240.000 165.000) başka herşey bir yazılım kapısı uygulamak ve daha sonra kapının o yoğunluk arsa içine pozitif prob floresan. </li><li> Moleküler prob konsantrasyonları (örneğin x 0.1 x 10) ve / veya sıcaklık ve pH düzeyini gerekirse ayarlanması,% 100 &quot;canlı&quot;,% 100 &#39;ölü&#39; ve tüm karışık kültür örnekleri ile 3.11 - Run 3.1 adımları tekrarlayın. </li> &lt;li&gt; nükleik aside ile boyanmış hücrelerin toplam yüzdesini bulmak için (yarım toplam FSC-H veya% 100 &#39;ölü&#39; kültüründen alınan) &#39;ölü&#39; hücreleri orijinal hücre yoğunluğuna pozitif moleküler prob floresan sinyalleri sayısını karşılaştırın Problar. </li><li> Non-spesifik boyama (bir Tek Yönlü Varyans Analizi veya Kruskal-Wallis tek yönlü analizi araçları kullanmak üretmeden hücre nükleik prob alımı en yüksek yüzdesi için en uygun protokol bulmak için her konsantrasyon içinde her süre için yapın, verileri) parametrik olmayan ise. </li></ol> 4. Moleküler Probe Floresan Ayrımcılık <ol><li> Intrinsik veya spesifik olmayan hücre boyama floresan girişim / örtüşme testi için 50% &#39;canlı&#39; ve% 50 &#39;ölü&#39; karışık kültür verilerini seçin ve tüm kapıları kapalı alır. </li><li> Sadece FSC-H histogram (320000 - 1500000) dahil etmek için bir yazılım kapısı uygulayın hedef için phycocyanin içine hücre boyutu organizmalarKanal histogram. </li><li> Kapısı &#39;ölü&#39; olarak etiketlenmiş düşük zirve ilavesi ile &#39;canlı&#39; olarak en yüksek fikosiyanin zirve ve etiket. </li><li> Ortalama dalga boylarını hem kayıt, &#39;canlı&#39; ve ardından &#39;ölü&#39; fikosiyanin (FL4) sinyalleri aynı anda birini kullanarak, ilgili moleküler prob floresans histogram kanalına başka bir kapı adımı gerçekleştirin. NOT: Bu deneyde mortalite başlatılması için mod bu protokol kapsamında açıkça fikosiyanin sinyallerini azaltır ısıl işlem, tarafından yapıldı. &#39;Ölü&#39; hücreleri üreten popülasyonlarının diğer yöntemler edinilen çalışır farklı çıkışları verebilir. </li><li> Oran pozitif moleküler prob floresan (&#39;ölü&#39;) ve içsel / spesifik olmayan sinyal (&#39;canlı&#39;) ortalama dalga boyları protokol hassasiyetini belirlemek için. NOT: &#39;canlı&#39; ve &#39;ölü&#39; popul floresan ayrımcılığı artırmak içinkus, hücre duvarı geçirgenliği ve elde edilen floresan sinyalleri 6 geliştirmek için besin tükenmiş hücreleri veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde Etkin leke alımı karbon kaynağı artar. Spektral örtüşme bazı FCM modellerinde sınırlı tazminat örnek edinme (PMT gerilim değişiklikleri) sırasında veya sonrasında analitik özel yazılım kullanıcı-manipüle ikili düzeltme yapılabilir. </li><li> &#39;Ölü&#39; en yüksek hücre miktarı oluşumu non-spesifik boyanması olmadan lekeli olmuştur optimize protokolü seçin. Testin bir numara varsa benzer sonuçlar iyi floresan sinyal ayrımcılık ile birlikte düşük konsantrasyon ve inkübasyon süresi ile protokol kabul. Takip sitometresinin kapatma işlemi için talimat üretmektedir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+Activity+in+Readily+Culturable+Bacteria:+A+Review+and+Discussion+of+the+Practical+Issues.">Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues.</a> Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).</li><li>Adams, D. G., Duggan, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tansley+Review+No.+107.+Heterocyst+and+Akinete+Differentiation+in+cyanobacteria.">Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria.</a> New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).</li><li>Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Physiological+Heterogeneity+in+Microbial+Population+Behavior.">The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior.</a> Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).</li><li>Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Nutrient-Replete+Microcystis.+PCC+7806+Cultures+is+Inhibited+by+an+Extracellular+Signal+Produced+by+Chlorotic+Cultures.">Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures.</a> Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).</li><li>Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Microbial+Viability+Using+Flow+Cytometry.">Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7,+Parameters+and+Probes.">Chapter 7, Parameters and Probes.</a> Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).</li><li>Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., K&#246;ster, O., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-Cytometric+Total+Bacterial+Cell+Counts+as+a+Descriptive+Microbiological+Parameter+for+Drinking+Water+Treatment+Processes.">Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes.</a> Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).</li><li>Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Applications+of+Flow+Cytometry+in+Aquatic+Microbiology.">Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology.</a> Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).</li><li>Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+Flow+Cytometry+of+Bacteria.">Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria.</a> Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).</li><li>Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Applicability+of+Fluorescent+Vitality+Probes+on+Phytoplankton.">Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton.</a> J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).</li><li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Viability+and+Antibiotic+Susceptibility+Testing+with+SYTOX+Green+Nucleic+Acid+Stain.">Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).</li><li>Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Senescence+and+Death+in+Emiliania+huxleyi.+and+Thalassiosira+pseudonana.">Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana.</a> Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).</li><li>Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+SYTOX+Green+Stain+for+Bacterial+Viability+Assessment.">Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).</li><li>Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Activity+and+Membrane+Integrity+Changes+in+Microcystis+aeruginosa.-+New+Findings+on+Hydrogen+Peroxide+Toxicity+in+Cyanobacteria.">Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria.</a> Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).</li><li>Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+Experimentally+Generated+Turbulence+on+the+Mash01+Unicellular+Microcystis+aeruginosa+Strain.">The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain.</a> Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).</li><li>Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+Microcystin+production+in+the+Cell+Cycle+of+Microcystis+viridis.">Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis.</a> Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).</li><li>Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Control+of+HAB+Species+using+Low+Biosurfactant+Concentrations.">On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations.</a> Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).</li><li>Bouchard, J. N., Purdie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Elevated+Temperature,+Darkness,+and+Hydrogen+Peroxide+Treatment+on+Oxidative+Stress+and+Cell+Death+in+the+Bloom-Forming+Toxic+Cyanobacterium+Microcystis.">Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis.</a> J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).</li><li>Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+Natural+Microcystis+Populations.">Enumeration of Natural Microcystis Populations.</a> Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).</li><li>Marie, D., Simon, N., Vaulot, D., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytoplankton+Cell+Counting+by+Flow+Cytometry.">Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry.</a> Algal culturing techniques. , 253-268 (2005).</li><li>Assun&#231;ao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+method+for+the+assessment+of+the+minimal+inhibitory+concentrations+of+antibacterial+agents+to+Mycoplasma+agalactiae.">Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae.</a> Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).</li><li>Davey, H. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting+of+Heterogeneous+Microbial+Populations:+The+Importance+of+Single-Cell+Analyses.">Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses.</a> Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).</li><li>Franklin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explaining+the+Causes+of+Cell+Death+in+Cyanobacteria:+What+Role+for+Asymmetric+Division?.">Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division?.</a> J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).</li><li>Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+Physiological+Heterogeneity+within+Starved+Cultures+of+Micrococcus+luteus.+by+Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting.">Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).</li><li>Waggoner, A., Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+cytometry.">Fluorescent probes for cytometry.</a> Flow cytometry and sorting. , 209-225 (1990).</li><li>Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Sleeping+Beauty&#34;:+Quiescence+in+Saccharomyces+cerevisiae.">&#34;Sleeping Beauty&#34;: Quiescence in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).</li><li>Keer, J. T., Birch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+for+the+Assessment+of+Bacterial+Viability.">Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability.</a> J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

15,19,22,23 - moleküler problar kullanılarak yayın artan sayıları, güvenilir ve bilgilendirici veriler 5,6,8 elde edilebileceğini gösterir. Henüz itibarıyla aynı konsantrasyon ve kuluçkalama süresi 6,10 Tüm türler arasında etkili olabilir hücre canlılığı için mükemmel bir leke yoktur. Değişmiş floresan emisyonları ile prob hatta aynı tip doğru konsantrasyon ve inkübasyon süresi (Tablo 1 ve 3) kurmak için bir gereksinim olduğunu...

Hücre sürekli fizyolojik parametrelerini değiştirerek ve işlevini değiştirerek çevreye yanıt karmaşık bir sistemdir. 3 - izogenik mikrobiyal nüfus doğada ve laboratuar hem de nüfus dinamikleri bile nispeten sabit çevresel koşullar altında meydana gelen 1, alt popülasyonlar gelişimi etkilenir. Doğal mikrobik topluluk değişkenliği nedeniyle çevre koşullarının oldukça değişken doğası ortaya çıkmaktadır. Bunlar bazen stokastik süreçler sonradan nüfus ortalamasına çok farklı subpopülasyonunun üretirler. Son kanıtlar bu fizyolojik alt popülasyonlar çevresel koşullara farklı tepki ve dramatik etkiler ve genel nüfus 3,4 etkileyen sinyal bileşikleri veya inhibitörleri üretebilir ortaya koymuştur. Bir nüfus içinde heterojenliği tanımlamak için bir yöntem oluşturulması un anahtarıdırÇeşitli ortamlarda mikroplar ekolojisini ların önemli ve heterocysts gibi özel hücrelerin geliştirilmesi, çevresel dalgalanmalara tepki olarak morfolojik heterojenlik gösterir ağır etkiler insan su güvenliği konusunda. Türler gibi Anabaena gibi toksik Microcystis gibi, sıkıntı siyanobakterilerin bilgi oluştururken gereklidir ve akinetes 2. Buna karşılık, Microcystis hücreleri stres yanıtı sırasında belirgin morfolojik heterojenliğini görüntüler yok. Canlı ve cansız hücreler arasında ayrımcılık fizyolojik farklılaşmanın en önemli yönüdür ve mikrobiyal populasyon dinamiği daha iyi anlaşılmasını verir. Ancak, bakteriyel canlılığı kendisinin kavramsal sorunu zor ve kötü 1,5,6 karakterize kalır. Flow sitometri (FCM) tek tek hücrelerin analiz güvenilir ve hızlı bir yöntemdir. Tek hücreli fizyo anlayışı artırmak içinFCM aracılığıyla logy moleküler problar metabolik ve biyokimyasal süreçlerin 7 bir dizi ayırmak için kullanılmıştır. Bu hücresel ve nüfus düzeyinde türlerin artan bilgiye açtı ve sırayla su kaynakları yönetimi 8,9 yardımcı oldu. Bununla birlikte, organizmalar, moleküler prob tasarımı ve protokolü uygulaması 6,10,11 bir dizi yol açan hücre duvarları ve zarlarına gözenekler ve pompalar, moleküler prob alımı ve efflux bakımından farklılık gösterir. Ticari ve araştırma amaçlı kullanılabilir moleküler problar genellikle çok farklı hücre tipine uygulanabilir genel bir protokol ile temin edilmektedir. Bir başka 6&#39;ya bir hücre tipi için geliştirilen protokoller transferinde çok dikkatli olmalı, etkin kullanımdan önce moleküler problar optimize etmek önemli bir görev bu nedenle. Yeşil ve turuncu bir nükleik asit probları en az bir baz ile çift ve tek sarmallı nükleik asit hem bağlama seçinivity ve hücrelerin plazma zarı bütünlüğünün değerlendirmek için kullanılır. Yeşil bir nükleik asit probu, hücre canlılığının bir göstergesi olarak hareket edebilir örneğin propidium iodide bazlı bileşikler 12 gibi diğer moleküler problar, kıyasla belirgin bir şekilde daha iyi hücre etiketleme floresan sinyalini alır. Terimi hücre canlılığı, &#39;burada, DNA parçalanma, plazma zan bütünlüğü kaybı sonra meydana varsayar. Nükleik asit probları üç pozitif ücretleri ile simetrik olmayan siyanin boyalar ve hem de ökaryotik ve prokaryotik 11,13 14,15 organizmalarda karakterize konsantrasyonlarda altında intakt membranlı hücrelere giremez. Nükleik asitlerin bir nükleik asit sondasının bağlanması, bunların zar bütünlüğü tehlikeye sahip hücrelerde endojen sinyallerden flüoresans emisyonlarının a&gt; 500 misline kadar artış ile sonuçlanabilir. Örneğin yeşil bir nükleik asit prob olarak moleküler problar tek hücre fizyolojisinin iyi bir göstergesi olabilir, ancak, bir ihtiyaç vardır tYalnız Microcystis deneylerde 0.5 uM 15 - - 0,1 mcM 30 dakika ve konsantrasyon aralıkları - 19 inkübasyon süreleri 7 dk arasında değiştiği gibi o, amaçlanan hedef organizmanın her prob optimize. Burada yeşil sitometrik deneyleri ve (bugüne kadar siyanobakteriyel türler M.aeruginosa üzerinde test edilmemiştir) nispeten yeni turuncu nükleik asit probları optimize etmek bir protokol mevcut. Aşağıdaki gelişmiş metodoloji sonra diğer türlere aktarılır ve böylece mikropların anlayış ve ekolojik davranışları artırarak, diğer moleküler problar protokolleri optimize etmek için bir platform olarak kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Cyanobacteria Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061-500ML</td><td>BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)</td></tr><tr><td>Decontamination Fluid</td><td>BD Biosciences</td><td>653155</td><td>Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 &amp;micro;l/min.&amp;nbsp; Followed by 2 min of sheath H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>by request</td><td>BD Accuri C6</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>Nucleic acid stain &amp;ndash; 5 mM solution in DMSO</td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S11368</td><td>Nucleic acid stain &amp;ndash; 5 mM solution in DMSO</td></tr></tbody></table>

molecular probe optimization to determine cell mortality in a photosynthetic organism (microcystis aeruginosa) using flow cytometry

Saha ve laboratuvar çalışmaları mikrobiyal alt popülasyonlar morfolojik ve fizyolojik parametrelerin yüksek heterojenite görüntülemek için gösterilmiştir. Mikropların hücre bölünmesi ve metabolik faaliyetler azalır sayede atıl durumda, var gibi bir mikrobiyal hücre gerçek zamanlı durumunu belirlemek, canlı ya da ölü kategorilerde ötesine geçer. Genel nüfus canlılığı belirlemeye yardımcı olmak için hızlı ve doğru bir yöntem moleküler problar ile tespit ve mikropların ölçümü ihtiyacını, sitometri (FCM) akış sağlar Verilen. Membran bütünlüğünü algılamak için bir model siyanobakterilerin olarak Microcystis aeruginosa SYTOX Yeşil ve SYTOX Turuncu kullanarak, tek bir hücre ölümlerinin hızla endikasyon için bir transfer yöntemi geliştirmek. Actio karşılaştırılabilir moduna sahip benzer bir eksitasyon ve emisyon dalga boyları ile diğer ürünlerin olmasına rağmen, bu derginin içinde kullanılan moleküler problar (sırasıyla yeşil ve turuncu bir nükleik asit problarının anılacaktırön probları belirtilen n, biz özellikle) başvurun. Moleküler problar kullanılarak protokoller konsantrasyon ve inkübasyon süreleri esas olarak farklı türler arasında değişiklik göstermektedir. M.aeruginosa yola Bu protokol izlenerek, yeşil bir nükleik asit probu 30 dakika kuluçkalama ve 10 dakika sonra 1 uM turuncu bir nükleik asit probu sonra 0,5 uM konsantrasyonlarında optimize edilmiştir. Membran hasarı olan hücrelerin raporlama altında yol açtı belirtilen optimum az Her iki probları konsantrasyonlarda. Bunun aksine, her iki sondalarda 5 uM konsantrasyonları ve daha yüksek &#39;canlı&#39; hücreler &#39;canlı olmayan hücreli bir sayı üzerindeki gösterimine neden hedef floresan ürettiği ve böylece spesifik olmayan lekelemeye bir tür, sergiledi. Kontrol nesil uygunluğu tartışma konusu olmaya devam rağmen pozitif kontroller (ısı ile öldürülmüş), sınanabilir ölü biyokütle sağladı. Yeşil ve turuncu nükleik asit probları biz de optimize etmek için adımlar mantıklı bir dizisini gösterereketkin bir siyanobakteriyel fizyolojik durumunu analiz etmek için kullanılabilecek bir protokol oluşturmak için nasıl monstrate.

Üslü fazda bir M.aeruginosa toplu kültüründen İleri doğru ışık saçılımı (FSC) ve yan ışık dağıtma (SSC) çıkışları, sırasıyla, hücre boyutu (çapı) ve iç boyu bilgileri (Şekil 1A) içerir. FSC M.aeruginosa olmak için çok büyük ve / veya küçük olan hücreleri ayırabilir. Bu ayrımcılık veya yolluk bir FSC çıkışı (Şekil 1C) belli noktaları arasındaki rafine verilerle yapılabilir. Kırmızı ...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry at JoVE.com

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Mikrobiyal popülasyonları genel davranışı dikte edebilir önemli hücre heterojenitesini içerir. Flow sitometri ile Moleküler prob analizi ancak uygulama türler arasında değişir, hücrelerin fizyolojik durumlarını belirlemek. Bu çalışma küçümseyen ya da yanlış pozitif sonuç kayıt olmadan, doğru bir siyanobakteryumdur nüfus içinde hücre ölümlerini belirlemek için bir protokol sağlar.

Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Akım Sitometri Kullanımı

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

molecular-probe-optimization-to-determine-cell-mortality

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

8.9K Görüntüleme.  Bournemouth University.  Mikrobiyal popülasyonları genel davranışı dikte edebilir önemli hücre heterojenitesini içerir. Flow sitometri ile Moleküler prob analizi ancak uygulama türler arasında değişir, hücrelerin fizyolojik durumlarını belirlemek. Bu çalışma küçümseyen ya da yanlış pozitif sonuç kayıt olmadan, doğru bir siyanobakteryumdur nüfus içinde hücre ölümlerini belirlemek için bir protokol sağlar. 

Video: Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Çevre

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical applications driven by microorganisms. Next generation sequencing methods are widely utilized to resolve microbiomes, but they are generally resource and time intensive and deliver mostly qualitative information. Flow cytometric microbiome analysis does not suffer from those disadvantages and can provide relative subcommunity abundances and absolute cell numbers at-line. Although it does not deliver direct phylogenetic information, it can enhance the analysis depth and resolution of sequencing approaches. In sharp contrast to medical applications in both research and routine settings, flow cytometry is still not widely used for microbiome analysis. Missing information on sample preparation and data analysis pipelines may create an entry barrier for the researchers facing microbiome analysis challenges that would often be textbook flow cytometry applications. Here, we present three comprehensive workflows for pure cultures, complex communities in clear medium and complex communities in challenging matrices, respectively. We describe individual sampling and fixation procedures and optimized staining protocols for the respective sample sets. We elaborate the cytometric analysis with a complex research centered and an application focused bench top device, describe the cell sorting procedure and suggest data analysis packages. We furthermore propose important experimental controls and apply the presented workflows to the respective sample sets.

Flow cytometric analysis has proven valuable for investigating pure cultures and monitoring microbial community dynamics. We present three comprehensive workflows, from sampling to data analysis, for pure cultures and complex communities in clear medium as well as in challenging matrices, respectively.

Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge rapidly in tumor cells as a response to damage induced by various cancer treatments. Tumor cell senescence is generally considered undesirable, as senescent cells become resistant to death and block tumor remission while exacerbating tumor malignancy and treatment resistance. Therefore, the identification of senescent tumor cells is of ongoing interest to the cancer research community. Various senescence assays exist, many based on the activity of the well-known senescence marker, senescence-associated beta-galactosidase (SA-&#946;-Gal). 
Typically, the SA-&#946;-Gal assay is performed using a chromogenic substrate (X-Gal) on fixed cells, with the slow and subjective enumeration of "blue" senescent cells by light microscopy. Improved assays using cell-permeant, fluorescent SA-&#946;-Gal substrates, including C12-FDG (green) and DDAO-Galactoside (DDAOG; far-red), have enabled the analysis of living cells and allowed the use of high-throughput fluorescent analysis platforms, including flow cytometers. C12-FDG is a well-documented probe for SA-&#946;-Gal, but its green fluorescent emission overlaps with intrinsic cellular autofluorescence (AF) that arises during senescence due to the accumulation of lipofuscin aggregates. By utilizing the far-red SA-&#946;-Gal probe DDAOG, green cellular autofluorescence can be used as a secondary parameter to confirm senescence, adding reliability to the assay. The remaining fluorescence channels can be used for cell viability staining or optional fluorescent immunolabeling.
Using flow cytometry, we demonstrate the use of DDAOG and lipofuscin autofluorescence as a dual-parameter assay for the identification of senescent tumor cells. Quantitation of the percentage of viable senescent cells is performed. If desired, an optional immunolabeling step may be included to evaluate cell surface antigens of interest. Identified senescent cells can also be flow cytometrically sorted and collected for downstream analysis. Collected senescent cells can be immediately lysed (e.g., for immunoassays or 'omics analysis) or further cultured.

A protocol for fluorescent, flow cytometric quantification of senescent cancer cells induced by chemotherapy drugs in cell culture or in murine tumor models is presented. Optional procedures include co-immunostaining, sample fixation to facilitate large batch or time point analysis, and the enrichment of viable senescent cells by flow cytometric sorting.

Akış Sitometrisi ile Yaşlanan Tümör Hücrelerinin Tanımlanması ve Zenginleştirilmesi için Uzak Kırmızı Floresan Yaşlanma İlişkili β-Galaktosidaz Probu

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Kanser Araştırmaları

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

Flow Sitometride Bacillus subtilis Spor Sayımı ve Etiket Analizinin İyileştirilmesi

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Biyokimya

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Biyoloji

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the modification of proteins, lipids, and DNA, which finally may lead to alteration in cellular function and cell death. Therefore, it is beneficial for cells to increase their antioxidant defense in response to detrimental insults, either by activating an antioxidant pathway like Keap1/Nrf2 or by improving redox scavengers (vitamins A, C, and E, &#946;-carotene, and polyphenols, among others). Inflammation and oxidative stress are involved in the pathogenesis and progression of retinopathies, such as diabetic retinopathy (DR) and retinopathy of prematurity (ROP). Since M&#252;ller glial cells (MGCs) play a key role in the homeostasis of neural retinal tissue, they are considered an ideal model to study these cellular protective mechanisms. In this sense, quantifying ROS levels with a reproducible and simple method is essential to assess the contribution of pathways or molecules that participate in the antioxidant cell defense mechanism. In this article, we provide a complete description of the procedures required for the measurement of ROS with DCFH-DA probe and flow cytometry in MGCs. Key steps for flow cytometry data processing with the software are provided here, so the readers will be able to measure ROS levels (geometric means of FITC) and analyze fluorescence histograms. These tools are highly helpful to evaluate not only the increase in ROS after a cellular insult but also to study the antioxidant effect of certain molecules that can provide a protective effect on the cells.

Here, we propose a systematized, accessible, and reproducible protocol to detect cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in M&#252;ller glial cells (MGCs). This method quantifies total cellular ROS levels with a flow cytometer. This protocol is very easy to use, suitable, and reproducible.

Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

Nörobilim

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Source: McBride, J. E., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54779">Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis Biyofilmler