Biz görüntüleme çalışmaları ile yardım için Dr. William Cashdollar ve Wisconsin Kan Araştırma Enstitüsü&#39;nde Kuzeybatı Karşılıklı Vakfı Görüntüleme Merkezi&#39;ni teşekkür ederiz. Biz de bu yazının ve yararlı bir tartışma eleştirel okuma Dr Daria Ilatovskaya teşekkür ederim. Bu çalışma (AS) Sağlık Hibeler HL108880 National Institutes ve (AMG için) DP2-OD008396 tarafından desteklenmiştir.

Aşağıda açıklanan deney prosedürleri Wisconsin Tıp Koleji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca idi. Sıçan Aort 1. İzolasyonu <ol><li> Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakımı) veya başka bir IACUC ile sıçan uyutmak yöntemi onayladı. </li><li> Bir yatar pozisyonda sıçan yerleştirin. Karın organları açığa çıkarmak amacıyla, deri ve deri altı karın dokusu sayesinde küçük bir ventral orta hat kesi yapmak. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi kullanılması gazlı bez yavaşça aort ve vena cava açığa çıkarmak için bağırsak saptırır. </li><li> Kısaca, bağ dokusu ve vena kava gelen aort teşrih künt. Böbrek mümkün olduğunca yakın aort kapalı kravat, dikiş kullanma. Aort 2 cm ve 15 ml konik tu yerleştirin - yaklaşık 1 teşrihNormal fizyolojik tuz çözeltisi içeren olabilir (PSS; mM olarak: 140 NaCl, 1.2 MgCl2, 2 CaCl2, 4.5 KCI, 6 Glikoz, 10 HEPES), buz üzerinde. </li><li> Aort izole edildikten sonra, onaylanmış IACUC protokollere göre hayvan euthanize. Olmayan tüm yaşam bitiminde prosedürleri hayvanın insani ölümünü sağlamak için pnömotoraks uyaran torakotomi ile derinden anestezi hayvanları euthanize. 3 </li><li> Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, forseps ince uçlu ve microscissors aort kapalı yağ ve bağ dokusu teşrih. Aort temiz kez uzunlamasına aort kesip daha sonra buz üzerinde PSS yerleştirin. </li></ol> 2. Boya Yükleme ve Kuluçka <ol><li> Pipet alüminyum folyo ile kaplanmış olan tek tek 500 ul tüplere, DMSO-bazlı çözelti içinde temin edilmektedir 1mM Fluo-04:00 boya, 7 ul. Zamanla boya özelliklerini korumak için -20 ˚C de dondurucuda saklayın. Not: Bu yüzden aliquotedmel çözümler, en az altı ay stabil olmalıdır. </li><li> Kullanımdan önce, boya çözeltileri açmadan önce oda sıcaklığına ısınmaya bırakın. Kullanımdan hemen önce çalışan çözümleri hazırlayın. Daha sonra kullanılmak üzere sulandırılmış reaktifi tutmayın. </li><li> Bir kalsiyum içeren PSS 450 ul DMSO çözeltisi içinde çözülmüştür hazır 1 mM Fluo-04:00 boya 7 ul ekleyin. Asetoksimetil (AM) esterleri dağıtmak yardımcı ve kalsiyum boya yükleme iyileştirmek için yükleme kokteyli olmayan DMSO bazlı% 10 Pluronic Asit çözeltisi 40 ul ekleyin. </li><li> 1 saat boyunca (as 2.3 açıklanmıştır) yükleme kokteyli içeren 500 ul tüpler içine disseke aorta yerleştirin. Oda sıcaklığında bir döner çalkalayıcı üzerinde folyo ve yer ile tüm tüpler örtün. </li><li> Damar NO üretimini izlemek için DAF-FM diasetat boya kullanın. 450 ul PSS, 40 ul pluronik asit ve 10 mM DAF-FM diasetat 5 ul ihtiva eden bir çözelti içinde aorta inkübe edin. (2.3 açıklanmıştır) kalsiyum kuluçka protokolüne benzer, aort yerleştirinoda sıcaklığında Sonraki 30 dakika, ardından 4 ° C&#39;de 30 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde folyo ve yerine kaplı NO boya çözeltisini ihtiva eden bir 500 ul bir tüp içinde. </li><li> NO üretimi ölçüldüğünde, Şekil 4B&#39;de gösterildiği gibi, bir kontrol olarak NO üretimini engellemek için, endotel NO sentaz engelleyici, L-NAME kullanın. Bu işlem için, (oda sıcaklığında) inkübasyon son 30 dakika süreyle (2.5 de anlatıldığı gibi) kokteyl 100 nM L-NAME ekleyin. </li></ol> 3. Lazer Tarama İki foton Mikroskopi Protokolü <ol><li> Dışı boya kaldırmak için temiz PSS 3 kez - 1 saat inkübasyondan sonra, aorta 2 yıkayın. </li><li> Normal PSS veya Ca 2 + -ücretsiz tampon (deney protokolünde bağlıdır) ya içeren bir silikon kaplı çanak aort aktarın. Silikon ile temas adventisya aşağı silikon kaplama üzerine aorta Pin (yani çanak açılış maruz kalan endotel lümen) μ şeklinde işaretçilerine kullanarak. Alternatif olarak, bir dilim Anchor kullanınızgara veya tutkal dokusunu düzeltmek için. Not: stres ve olası mekanik eserler, transferi azaltmak ve Ca 2+ -ücretsiz çözüm aort düzeltmek ve 5 beklemek için - deney başlamadan önce 10 dakika. </li><li> Peristaltik bir pompa ya da ilaçların, otomatik veya manuel uygulama ya da hücre-dışı çözelti değişen silikon kaplı plakaya bir şırınga bağlayın. </li><li> Dik iki foton mikroskop burun parçasının altında çanak yerleştirin ve yüklemek ve numune üzerinde 25 × (NA 1.05 ve çalışma mesafesi 2 mm) su daldırma objektif lens yerleştirin. Not: Bu özel bir mercek mevcut değilse normal bir amaç ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde sinyal çözünürlüğünü artırabilir, çünkü özellikle iki foton görüntüleme için üretilmiş bir objektif kullanın. </li><li> Yazılımını kullanarak iki foton lazer etkinleştirin (lazer pompa ve açmak için başlar). Dinle 820 nm lazer uyarım. </li><li> Epifloresans kullanarak, aort bulmak ve üzerine objektif odakKaba ayarı kullanarak endotel yüzey. </li><li> Uyarma lazer modu kilitli olmayan descanned dedektörler ilgileniyoruz ve beklenen emisyon spektrumları uygun emisyon filtreleri yüklü olmasını sağlamak, iki foton lazer tarama moduna mikroskop Anahtarı. Not: Burada FV10-MRL / R (495 nM 540) kullanılmıştır. </li><li> Yaklaşık% 5, lazer gücünü kullanarak canlı taramayı başlatmak ve ince endotel hücrelerini görselleştirmek için objektif odak. Not: Normal PSS inkübe zaman endotel hücreleri güçlü bir floresan sinyal sergileyecek. Gemi, kalsiyum içermeyen tampon maddesi içinde inkübe edilir, bu fark daha zayıf olacaktır. endotelial hücreler açılır aort üst ve düz kas hücreleri, sadece endotel hücreleri (bakınız Şekil 2) aşağıda görülebilir mevcut olacaktır. Kan damarları düz ne de düz kas hücreleri ve endotel hücrelerinin her ikisi de mevcut yerler olacak ne olduğundan. &lt;/ Li&gt; <li> Hücreler odak olduğunda, mikroskop yazılım programı hızlı tarama modunda sıralı görüntüleri (raster tarama, 1.1 sn kare toplama frekansı ile 512 x 512 piksel pencere) toplamak için. Flu-4:00 floresan paralel olarak, damar daralması değişiklikleri algılamak ve daha iyi deneysel koşullar görselleştirmek için ışıklı görüntüleri bulaşan toplamak. </li><li> Bazal sinyal görüntüleri toplandıktan sonra, harici bir çözelti içinde Ca2 + iyonu konsantrasyonu değiştirmek ya da yavaş yavaş peristaltik pompa görüntüleme sırasında kullanarak farmakolojik uyaran maddeler uygulanır. Yüklenen hücrelerin içindeki floresan sinyal artışı dikkate alınmalıdır. Not: Endotel hücreler, akış değişikliklere bu nedenle Ca 2+ veya hiçbir sinyal farmakolojik aktivatörleri uygulanmasından önce, düşük laminer uygulamaları ve araç test kullanılması önerilir yanıt. Fluo-4 (Fluo-4 i için ayrışma sabiti yüklü gemiler nM konsantrasyon değerlerine hücre içi kalsiyum yeniden hesaplamak içins 345 nM), flüoresan yoğunluğu, taban çizgisinde ve Genişleme ve MnCI2 eklenmesinden sonra kaydedilebilir. 4 </li></ol> 4. Görüntü İşleme ve Hesaplamalar <ol><li> Download ve Fiji görüntü işleme paketini yükleyin. </li><li> Fiji görüntü dosyasını açın. İstendiğinde dosyasını içe üzerine, kanallar (iletilen ışık ve florasan sinyali) bölün. Veri analizi için sadece floresan sinyal kullanın. </li><li> Fiji programı kapsamında, analiz sekmesini tıklayın ve araçları seçeneğine gidin. Araçlar seçeneği altında, ROI yöneticisi diyor sekmeyi bulmak ve üzerine tıklayın; Yeni bir pencere açılacaktır. </li><li> Bundan sonra, analiz sekmesi altında ayarlanan ölçümlerine tıklayın. Özel ilgi ölçümleri seçin. Kalsiyum geçici ölçümler için ortalama gri değer seçeneğini kullanın. </li><li> Dairesel iz aracı ile, ilgi alanları (ROI) bölgelerini izlemek ve her R ROI yöneticisi ekranda &quot;eklemek&quot; butonuna tıklayınız başlarOI. Bir kez ilgi tüm hücreleri ROI yöneticisi penceresinde, &quot;daha&quot; sekmesi altında Çoklu Tedbir seçin takip edilmiştir. Bir elektronik tabloya bu ölçümlerin hepsi doğrudan ölçümleri kaydetmek veya kopyalayıp yapıştırın ya unutmayın. </li><li> Açık * .txt dosyası veya Excel Fiji ve yeni bir çalışma sayfasına Kökeni numaraları aktarın. Not: Alternatif olarak, daha fazla analiz için Sigma Plot veya Prism gibi herhangi bir program kullanın. </li><li> Origin programı kapsamında, tüm geçici tepkilerin bir bakış gözlemlemek için Line + Sembol menüsü → Plot kullanın. Tepkisiz hücreleri kaldırın. </li><li> Zaman ölçeği (X ekseni) iz numarasını yeniden hesaplayın, Sütun → Set Sütun Değerlerini kullanın ve (bizim durumumuzda 1,1sn olarak) resim koleksiyonu frekansına iz numarası sütunu çarpın. </li><li> Mean (Y ekseni) ve Standart Hata izleme hesaplamak için seçilen tüm kayıtlar için Satır Analysis → İstatistikleri kullanın. Hücrelerin mevcut grup Line + Sembol → Konu için son Grafik çizilir. </li><li> meaolarak takip n kalsiyum geçici hesaplama açıklanmıştır. <ol><li> Kökeni program dahilinde toplam kalsiyum salınımı için, daha sonra, Grafik tıklayın menüsü Analizi → Matematik kullanın → entegre edin. Eğri altında kalan alan toplam ayrılmaz Sonucu giriş görünür. </li><li> (X ekseni geçici yanıt sonuna kadar maksimum aralığı seçin) Analiz → Doğrusal olmayan Curve Fit → Seçiniz Veri Seti: Geçici kinetik için Graph üzerine tıklayın, ardından menüyü kullanabilirsiniz. Bitti → Üstel Çürüme 1 → Seç Fonksiyonu → Montaj başlatın. Üstel uydurma Grafik penceresinde görüntülenir ve Giriş Sonuç: Not. Elde edilen veriler (değerler) yayımlanan kalsiyum toplam miktarını temsil ve kanalların kinetik geçici yanıt aracılık. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+2-photon+microscopy+to+understand+albuminuria.">Using 2-photon microscopy to understand albuminuria.</a> Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).</li><li>Burford, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+podocyte+calcium+in+glomerular+injury+and+disease.">Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease.</a> J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).</li><li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H(2)O(2)+release+in+freshly+isolated+kidneys.">Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+analysis+and+calcium+imaging+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated.">Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated.</a> J Vis. Exp. In Press, (2015).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+superoxide+and+angiotensin+II+suppression+in+salt-induced+changes+in+endothelial+Ca2++signaling+and+NO+production+in+rat+aorta.">Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).</li><li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Plekha7+attenuates+salt-sensitive+hypertension+in+the+rat.">Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318, 558-561 (1985).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastin+network:+its+relationship+with+collagen+and+cells+in+articular+cartilage+as+visualized+by+multiphoton+microscopy.">The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy.</a> J. Anat. 215, 682-691 (2009).</li><li>Sathanoori, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+modulates+endothelial+KLF2+through+activation+of+P2X4.">Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4.</a> Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).</li><li>Hall, A. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Multiphoton+Microscopy:+Focusing+Light+on+Acute+Kidney+Injury.">Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury.</a> Physiology. 29, 334-342 (2014).</li><li>Campese, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+sensitivity+in+hypertension.+Renal+and+cardiovascular+implications.">Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications.</a> Hypertension. 23, 531-550 (1994).</li><li>Cowley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+nongenetic+determinants+of+salt+sensitivity+and+blood+pressure.">Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure.</a> Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypertension+susceptibility+loci+on+rat+chromosome+12.">Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12.</a> Hypertension. 60, 942-948 (2012).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+multiple+causative+genes+at+a+single+GWAS+locus.">Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus.</a> Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).</li><li>Mattson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mutation+of+recombination+activating+gene+1+in+Dahl+salt-sensitive+rats+attenuates+hypertension+and+renal+damage.">Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).</li><li>Rudemiller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD247+modulates+blood+pressure+by+altering+T-lymphocyte+infiltration+in+the+kidney.">CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney.</a> Hypertension. 63, 559-564 (2014).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXM+-+a+new+tool+for+mapping+breast+cancer+risk+in+the+tumor+microenvironment.">CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment.</a> Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Deneysel Bakış. Daha iyi damar fizyolojisi HAYIR kalsiyum katkısını anlamak ve için, yeni bir yöntem ölçmek için geliştirilen [Ca 2 +] i ve NO düz kas ve izole bozulmamış aorta endotel hücreleri içinde. 1) Mekanik izolasyon ve hazırlık (enzimatik olmayan sindirim) Geminin: Birlikte, bu protokol bu kritik adımlardan oluşur. Optimum fizyolojik kayıtları elde etmek mümkün olduğunca sağlıklı ve sağlam dokuyu tutmak önemlidir. Pluronik asit ile 2) kalsiyum etiketle...

Kalsiyum, endotel ve düz kas hücreleri gibi vasküler hücreler içinde temel bir ikinci mesajcı olan. Bu vasküler kasılma için birincil uyaran ve endotel içinde YOK nesil yoluyla etkileri de dahil olmak üzere, vasküler dilatasyon önemli bir rol oynamaktadır. Nedeniyle görüntüleme teknolojilerinin sınırlamaları nedeniyle, sağlam geminin içinde kalsiyum işleme gözlemlemek neredeyse imkansız olmuştur. İki foton görüntüleme sistemleri ve yeni kalsiyum yaratılması veya HAYIR etiketleme boyalarının geliştirilmesi, kalsiyum dinamikleri ve damarsal içinde NO üretimini anlamaya başlamak için yeterli derinlik ve çözünürlükte görüntü mümkün kılar. İki foton mikroskop son zamanlarda doku, organ ve çünkü derinden düşük eşiğe ve yüksek sinyal duyarlılığı ile dokulara nüfuz üstün yeteneği bile tüm hayvan çalışmalarında uygulanmıştır. 1,2 illuminat iki foton uyarma dar spektrumluiyon odak noktası olan ve olmayan descanned dedektörlerin kullanımı iki foton mikroskopi geleneksel konfokal mikroskobu üstündür nedenleri vardır. Mikroskopisi nedeniyle oto-floresan ve konfokal iğne deliği içine out-of-focus ışık saçılması için gerekli doku derinlikte yüksek kaliteli görüntüler üretemez. Sonuç olarak, [Ca2 +] i sinyal ölçmek için iki foton mikroskopu kullanılarak bir yöntem ve yüksek bir çözünürlüğe ve düşük sinyal-gürültü oranına sahip olduğu gibi, tek tek kan taşıyıcı hücrelerin NO üretimi geliştirdik.

<table><tbody><tr><td>DAF-FM</td><td>Life Technologies</td><td>D-23842</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>L-NAME</td><td>Tocris</td><td>0665</td><td></td></tr><tr><td>Olympus upright microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee-OL&amp;nbsp;</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>Ti:sapphire laser 690nm &amp;mdash; 1040nm</td></tr><tr><td>Filters</td><td>Olympus</td><td>FV10-MRL/R&amp;nbsp;</td><td>495 to 540 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25&amp;times; water-immersion objective lens</td><td>Olympus</td><td>XLPL25XWMP</td><td>N.A. 1.05 and working distance 2 mm</td></tr><tr><td>Slice Anchor grid&amp;nbsp;</td><td>Warner Instrument&amp;nbsp;</td><td>SHD-27LH</td><td></td></tr><tr><td>Other basic reagents&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon imaging of intracellular ca2+ handling and nitric oxide production in endothelial and smooth muscle cells of an isolated rat aorta

Kalsiyum vasküler dokularda çok sayıda fizyolojik süreçte önemli bir düzenleyicidir. En endotel ve düz kas fonksiyonları yüksek hücre içi kalsiyum ([Ca2 +] i) ve nitrik oksit (NO) değişikliklere bağlıdır. Amacıyla iki foton mikroskobu ile boyaları [Ca 2 +] i, NO ve alt molekülleri vazokonstriktörlere ve vazodilatörler yanıt olarak bir kan damarı tarafından işlenir, biz kalsiyum etiketleme geçerli yeni bir teknik (ya da NO-etiketleme) geliştirdi nasıl anlamak için İzole kan damarlarındaki kalsiyum taşıma (veya NO üretimini) ölçmek için. Burada anlatılan sıçan, etiket kalsiyum veya HAYIR endotel veya düz kas hücrelerinin içinde aort izole ve görüntü kalsiyum geçici (veya HAYIR üretim) fizyolojik aşağıdaki iki foton mikroskop kullanarak nasıl gösterir bir ayrıntılı adım-adım prosedürü ya da farmakolojik uyaranlar. yöntemi kullanmanın yararları çok yönlüdür: 1) aynı anda mümkündürly endotel hücreleri ve farklı uyarıcılara tepki olarak, düz kas hücreleri, hem de geçici kalsiyum ölçülmesi; 2) görüntü, endotelyal hücreler ve nativ ortamda düz kas hücrelerinin bir sağlar; 3) Bu yöntem hücre içi kalsiyum veya HAYIR değişiklikler ve hassas ölçümler için yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir karşı çok hassastır; ve 4) tarif edilen yaklaşımı, bu reaktif oksijen türleri gibi diğer moleküller, ölçümü için uygulanabilir. Özetle, iki foton lazer emisyon mikroskobu uygulama geçici kalsiyum ve izole bir kan damarı endotel ve düz kas hücrelerinde NO üretimini yüksek kalitede nicel verilerin sağlanan ve vasküler fonksiyonları düzenleyen mekanizmaların anlayışımızı teşvik etmiştir izlemek için.

Doğru vasküler fizyoloji (damar genişlemesi ve vazokonstriksiyon) kalsiyum katkısını değerlendirmek için, bir protokol endotel hücreleri ve izole sağlam aortlarından düz kas hücrelerinin hem kalsiyum boyalar yüklemek için tasarlanmıştır. Şekil 1 &#39;de gösterilen kurulmuş, genel deney, izolasyon ve görüntüleme önce kabın hazırlanması için temel strateji gösterir. Kısaca, sıçan aort izolasyonundan sonra, yağ ve bağ dokusu temizlenmeli ve uzunlamasına ...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta at JoVE.com

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

two-photon-imaging-intracellular-ca2-handling-nitric-oxide-production

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

11.2K Görüntüleme.  Medical College of Wisconsin. Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta. 

Video: Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Aort Kalsifikasyon ve Enflamasyon Vasküler düz kas hücrelerinin ve Görüntüleme Kalsifikasyon

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

Tıp

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Sıçan izole direnç arter Video mikroskobu kullanan vasküler kontrol mekanizmalarının değerlendirilmesi

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Fare Direnç arterlerden mikrovasküler endotel Tüpler İzolasyonu

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Biyoloji

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Nörobilim

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Genetik Kodlanmış Floresan Nitrik Oksit Uygulama (• NO) Tek Hücrelerde YOK • Sinyallerin Gerçek zamanlı Görüntüleme için sondalar, geNOps,

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Measurement of Endothelium-Dependent Vasorelaxation in the Mouse Thoracic Aorta Using Tensometric Small Volume Chamber Myography

Small volume chamber tensometric myography is a commonly used technique to evaluate the vascular contractility of small and large blood vessels in laboratory animals and small arteries isolated from human tissue. The technique allows researchers to maintain isolated blood vessels in a tightly controlled and standardized (near-physiological) setting, with the option of adjusting to various environmental factors, while challenging the isolated vessels with different pharmacological agents that can induce vasoconstriction or vasodilation. The myograph chamber also provides a platform to measure vascular reactivity in response to various hormones, inhibitors, and agonists that may impact the function of smooth muscle and endothelial layers separately or simultaneously. The blood vessel wall is a complex structure consisting of three different layers: the intima (endothelial layer), media (smooth muscle and elastin fibers), and adventitia (collagen and other connective tissue). To gain a clear understanding of the functional properties of each layer, it is critical to have access to an experimental platform and system that would allow for a combinational approach to study all three layers simultaneously. Such an approach demands access to a semi-physiological condition that would mimic the in vivo environment in an ex vivo setting. Small volume chamber tensometric myography has provided an ideal environment to evaluate the impact of environmental cues, experimental variables, or pharmacological agonists and antagonists on vascular properties. For many years, scientists have used the tensometric myograph technique to measure endothelial function and smooth muscle contractility in response to different agents. In this report, a small volume chamber tensometric myograph system is used to measure endothelial function in the isolated mouse aorta. This report focuses on how small volume chamber tensometric myography can be used to evaluate the functional integrity of the endothelium in small segments of a large artery such as the thoracic aorta.

The present protocol describes the concepts and technical application of the tensometric myograph technique using a multi-chamber myograph system in the experimental ex vivo assessment of mouse aortic endothelial function.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler