Name: simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling
Uploaded: 2015-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

NOT: Tüm deneyler yerel kurumsal etik kurallarına uygun olarak yapılmıştır. 1. Kan Alma <ol><li> Antekubital damardan aracılığıyla yeşil kapaklı (heparinize edilmiş) tüplere sağlıklı gönüllü kan 14 tüpleri toplamak ve buz üzerinde yerleşmeden önce, her tüp ters. Optimal nötrofil verimi sağlamak için deney 15 dakika - 10 içinde kan toplayın. </li></ol> Tüm Blood 2. Nötrofil İzolasyon <ol><li> Kan sulandırmak için Ca ve Mg olmadan 5 ml PBS ile yapılan her bir kan yeşil kapaklı tüp yıkayın. 4 x 50 ml konik boruların her birinde, oda sıcaklığında, Limfosit Ayırma Ortamı (LSM), 15 ml ekleyin. Keskin LSM-kan arayüzü oluştururken, dikkatle LSM üzerine seyreltilmiş kan katman, 60 ml şırınga üzerine monte edilmiş bir 18 G iğne kullanarak. Not: mümkün olduğu kadar tabakalar karıştırma kaçının. </li><li> Ara vermeden, 21 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüjleyin. NOT: Ani sonları canFarklı katmanların karıştırma neden olur. </li><li> Altındaki eritrositler ve nötrofiller tortu gözlemleyin. Aspire ve sadece alt kırmızı tabaka bırakarak, lenfositler ve mononükleer hücreleri içeren bu katmanlar arasındaki arayüzü kurtulmak için emin üst 2 katmanları (plazma ve EKK) yapım atın. </li><li> Her bir tüpe, fosfat tamponlu salin (PBS) ve 20 ml 6% Dekstran çözeltisine 20 ml ekleyin. Yavaşça eritrosit ve nötrofillerin tabakası ile karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında oturmasına olanak sağlamak için her bir tüp ters. NOT: Bu kırmızı kan hücreleri (eritrositler) alt sediment sağlayacaktır. </li><li> 30 dakika sonra, taze tüp içine nötrofil zengin süpernatant aktarmak ve RBC pelet atın. 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de santrifüjleyin yüzer. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır. pelet çoğunlukla nötrofil ve birkaç eritrositlerde içerecektir. </li><li> Steril su, 4.5 ml tampon lize 0.5 ml ilave etmek suretiyle, bir yokedici çözelti hazırlayın. Lyse t RBC kalano bir tüp içine tüm yeniden süspanse pelet transfer, çözüm parçalama 5 ml hazırlanmış. 10 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında erimesini izin verir. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve kalan yokedici çözeltisi kurtulmak için 4 ° C&#39;de 450 x g hızında tekrar Ca ve Mg ve santrifüj olmadan 5 ml PBS ile yıkayın pelet. bu noktada elde edilen topak nötrofilleri içerir. Soğuk% 3 RPMI 30 ml pelletini tekrar ve buz koymak. Not:% 3 RPMI RPMI ortamı ilave etmek suretiyle yapılır% 3 fetal sığır serumu (FBS) </li><li> Metilen mavisi boyama kullanılarak numunenin saflığını doğrulayın. &gt; Hücrelerin% 95 çok-lober çekirdekleri ile granülositler olmalıdır. &gt; Doğrulamak hücrelerin% 95 canlılığı ve son nötrofil verimi saymak Trypan mavi boyama kullanın. 5 x 10 6 nötrofil / ml&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için buz gibi soğuk% 3 RPMI nötrofilleri seyreltin. </li></ol> 3. Nesil NET&#39;ler <ol><li> 500 n nötrofillerin teşvikPMA M (nötrofil çözeltisi, 30 ml için) ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de 4 saat süre ile, 20 mm ızgara ile bir 150 x 25 mm, düz doku kültürü çanağı üzerinde inkübe edin. Bu NETosis sağlayacaktır. </li><li> Stimülasyon 4 saat sonra, yavaşça alt yapıştırılmış NET&#39;ler ve nötrofillerin tabakası bırakarak aspire ve ortam atılır. Bu katmanı bozabilir etmeyin. </li><li> Tabak başına Ca ve Mg olmadan soğuk PBS, 15 ml toplam kullanarak, alt kısmında bulunan tüm yapışkan malzemeyi kaldırmak üzere çanak alt PBS 15 ml pipetle her çanağın tabanı yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de 10 dakika boyunca 15 ml konik bir tüp ve santrifüj her çanak (adım 3.3) yıkama elde edilen çözelti toplayın. Nötrofiller ve kalan hücreler, hücre içermeyen bir NET-zengin yüzer bırakarak alt pelet olacaktır. </li><li> Bölme 1.5 mi mikro santrifüj tüplerine süpernatan 4 ° C&#39;de 18000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj. Bu, tüm DNA pelleti, izin verir. NOT: Büyük tu Santrifüjbes aksi yüksek hızlı mikro-santrifüj kullanmak için küçük tüplerde Süpernatantlar bölmek gerekir, yüksek hızları normal santrifüj ulaşılabilir olup olmadığını tüketen kolay ve daha az zaman. </li><li> 100 ul PBS başına 2 x 10 7 nötrofil tekabül eden bir konsantrasyona kadar buz soğukluğunda PBS içinde, elde edilen bütün topaklar Süpernatant atılır ve yeniden süspanse edin. Bu, daha sonraki deneyler için kullanılan hücre içermeyen NET stok verecektir. </li><li> Spektrofotometri veya alternatif DNA miktar aracını kullanarak elde edilen numune DNA konsantrasyonu ölçün. 180 ng / ul - numune içinde yeterli bir konsantrasyonu 140 arasında olmalıdır. </li></ol> 4. NET-Kanser Hücre Statik Yapışma Deneyi <ol><li> Karanlıkta 4 ° C&#39;de kaplama kuyu O / N 96 gözenekli düz tabanlı plaka içinde gözenek başına daha önce elde edilen NET stokunun 100 ul ilave edin ve izin verir. </li><li> Daha sonra saat 12 ila 20, hücrenin düzgün bir tek tabaka oluşumunu doğrulamakmikroskop altında oyuklara altındaki serbest fileler (Şekil 1). Bu noktada, hafifçe alt NET tek tabaka bozmaya değil emin yapma, kuyuların dışında tüm yapışmayan malzeme aspire. </li><li> Her bir% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) ile bloke çözeltisinin 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin. </li><li> % 0.25 tripsin solüsyonu 2 ml kullanılarak bir T-75 balonuna A549 kanser hücrelerini ayırın. Bir kez, bağımsız 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de tripsinize edilmiş hücre ve santrifüj A549 ortam 10 ml ekleyin. 100 ul ortam başına 2 x 10 4, kanser hücrelerinin bir konsantrasyonu elde etmek üzere ortam içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücreleri atın. Not: A549 hücreleri, ayrıca büyütülmüştür. Kısaca, hücreler kültürlendi ve tekrar% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile inkübe içeren DMEM F12 ortamında muhafaza edilmiştir. 70 kere -% 80 hücre birleşme elde edildi, bunlar,% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak ayınlmış ve aynı ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiştirYukarıda tarif edilen. </li><li> Ortam ml&#39;si başına CFSE 1 ul ilave edilmesi ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında leke bırakın tarafından CFSE ile Leke kanser hücreleridir. 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de boyama, santrifüj aşağı sonra daha sonra 100 ul ortam başına 2 x 10 4, kanser hücrelerinin bir konsantrasyonu elde etmek üzere ortam başlangıç ​​hacminin supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atmak. </li><li> Yavaşça aspire bloke etme çözeltisi ve oyuk başına NET tek tabaka üzerinde, 100 ul eş bir ortam, 2 x10 4, kanser hücreleri eklemek ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile 90 dakika süreyle yapışmaya izin bloke NET&#39;ler 1 saat sonra. Yavaşça hücreler aspire ve herhangi bir bitişik olmayan Hücreleri yıkamak için her bir oyuğa 100 ul PBS ilave edin. </li><li> Bazı kuyularda, ağlar indirgeme yıkamadan önce 10 dakika boyunca oyuk başına DNAse1 bölgesinin 1000U ekleyin. Bu gibi negatif kontrol görev yapacak. Kuyu, araç kontrolü (VC) olarak görev yapacak 10 dakika boyunca oyuk başına steril su, 100 ul ilave edin. NOT: 3 conditio başına çoğaltırn genellikle numune boyutunu artırmak için yapılır. </li><li> Aspire kuyuları altındaki tek Nets ve yapışık kanser hücrelerini bırakarak tüm çözüm atmak ve. (Şekil 1) AĞLARINDA yapışık kanser hücreleri düzeltmek ve flöresanlı mikroskop altında tahlil okuma oyuk başına% 4 formaldehid çözeltisi 100 ul ekle. Arsa ve sonuçları analiz (Şekil 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1.">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA.">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs:+a+new+strategy+for+using+old+weapons.">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li><li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis.">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis.">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).</li><li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis.">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li><li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+NETs+in+reproduction:+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss.">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362 (2012).</li><li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li><li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression.">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li><li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils.">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lymphocytes,+granulocytes+and+macrophages.">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li><li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+hormones,+acting+on+the+TERT+gene,+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells.">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li><li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells.">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li><li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides/protamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging.">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death:+a+predominant+role+of+histones.">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

Bu videoda gösterildiği Nötrofil Ekstrasellüler Tuzak izolasyon protokolü nötrofil izolasyonu ve NET oluşumu için literatürde kullanılan farklı teknikler birleştirir. Bu oldukça karmaşık ve değişken sürecini basitleştiren ve diğer protokoller daha az adımlarla saflaştırılmış hücre-serbest Nets izole etmek çok güvenilir ve tekrarlanabilir bir yol sunar. Ayrıca, hazır reaktifler protokolleri basitlik ekleyerek istihdam edilmekte ve önemli ölçüde maliyetini azaltmak. statik yapışma dene...

Nötrofil hücre dışı trans (NET) yeni protein ve histon yüzlerce edilmiş hücre dışı DNA kordonlarından teşekkül nötrofil türevi elemanların keşfedilir. Onlar belirli uyaranlara aşağıdaki enfeksiyon ve inflamasyon bağlamında nötrofiller tarafından salgılanan ve onlar başlangıçta enfeksiyonlara karşı nötrofil savunma mekanizmalarının bir parçası olarak kabul edilmiştir. İlk bakteriler, virüsler ve mantarlar 1-3 dahil olmak üzere çeşitli mikrobik işgalciler yakalama teşvik gösterilmiştir. Mikrop Yakalama sonra kendi yıkımına hem doğrudan NET-ilişkili proteinler 3,4 ile ve dolaylı fagositik hücrelerin 5,6 yerel istihdam yoluyla yol açacak. NET&#39;ler rolü ancak savunma barındırmak için sınırlı görünmüyor. Daha yakın zamanda, bu, 9 trombozu, otoimmün hastalıklar 7,8 önemli bir rol oynadığı için, gebelik ile ilgili bozukluklar 10 ve hatta kanser ilerlemesinin gösterilmiştir11,12. Bu duruma göre, bu NET&#39;ler çeşitli fizyolojik süreçlerin bir çok sayıda çok önemli bir rol oynar gibi görünmektedir. Ancak, bu tür araştırmaların yeni doğası göz önüne alındığında, çok NET&#39;ler etkilerini gösterirler hangi mekanizmalar ile ilgili olarak aydınlatılamamıştır gerekmektedir. Burada, nötrofillerin yokluğunda NET&#39;ler izolasyonu için basit bir yöntem sunulmaktadır. Aşağıdaki videoda, insan tam kandan Nets izole etmek basitleştirilmiş ve kolay bir tekniği göstermek. Hücresiz NET&#39;ler daha sonra yapışma, çoğalma ve yer değiştirme gibi bir takım tahlillerin yanısıra kurutma, boyama, imuunofluorescence da dahil olmak üzere, in vitro deneylerde, bir dizi kullanılabilir. Diğer protokoller ancak onlar genelde, uzun, karmaşık, pahalı ve sık sık, düşük verim 13 olan, 13, 19 var. Bu basitleştirilmiş protokol nedenle procedu uzunluğunu minimize, temel reaktifler kullanır ve nötrofillerin izole etmek için gerekli adımların sayısını azaltırverimi en üst düzeye çıkarırken yeniden. Aşağıdaki yöntem, nötrofil izolasyonu için farklı teknikler, daha önce, canlı nötrofil çok saf bir örnek elde edildi basit bir protokol elde etmek için literatürde tarif edilen bir araya getirir. Literatürde önerildiği gibi, venöz kan EDTA tüplerde toplandı ve nötrofil aktivasyonunu 14 önlemek için 10 dakika içinde kullanılır. Bu heparinize tam kan, ilk boyum ve ark 15 ile tarif Ficoll yoğunluk santrifüj tekniği adapte edilmiş bir metot ile ilgili granülositleri ve kırmızı kan hücreleri izole etmek için, Limfosit Ayırma Ortamı (LSM), yoğunluk gradyanlı santrifüj kullanır. LSM sodyum metrizoat sodyum Diatrizoate yerine ve nötrofillerin 16-18 izole etmek birçok çalışmada başarıyla kullanılmaktadır Boyum formülasyonun bir değişiklik. Farklı yoğunluklu santrifüjleme, monositler ve lenfositler atılır tarafta; kırmızı kan hücreleri daha sonra çöktürülür% 6 Dekstran çözeltisi 14 kullanılarak ve kalan kırmızı kan Tripan mavisi ve metilen mavisi boyaması ile kontrol edilir saf nötrofil, bir popülasyon elde etmek için eritilir. Çok sayıda maddeler lipopolisakarit (LPS) ve forbol miristat asetat (PMA) ve interlökinler (IL-8), 3,5,6 de dahil olmak üzere, in vitro ve in vivo olarak NETosis uyarılması için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokol, izole edilmiş nötrofiller apoptozu 19,20 teşvik etmeden, tutarlı ve güvenilir bir .NET oluşumuna imkan vermek üzere yeterli bir konsantrasyonu gösterilmiştir 4 saat için 500 nM PMA ile uyarılır. Izole edildikten sonra, bu protokolden elde edilen hücre içermeyen NET&#39;ler bir yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir. DNAse1 sindirilmesi ve daha önce tarif edildiği gibi ağları ile indirgeme için kullanılır ve bu nedenle, bir kontrol 2,3,11 olarak hizmet eder. Diğer seçenekler NET Formatı inhibe etmek için Nötrofil elastaz inhibitörü (NEi) kullanımını içeriramaç NET oluşumunu inhibe ziyade bozulmasını 11 gerçekleştirmek için kabul edilebilir bir alternatif olan, üzerinde. NEi çeşitli fonksiyonları bir dizi olmasına rağmen, daha önce NET yerleştirme kromatin yoğunlaşması, nükleer degranülasyonunu ve nötrofıl ölüm 12 blokajı yoluyla NEi ile inhibe edilebilir olduğu gösterilmiştir

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td><td>Wisent</td><td>305-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Dextran hydrochloride (powder)</td><td>Spectrum</td><td>DE130</td><td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td><td>Wisent</td><td>350-000-CL</td><td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse Lysing buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma-Alrdrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>DNAse1</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>F12 DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Integrid tissue culture dish with 20 mm grid (150 x 25 mm)</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr></tbody></table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) son zamanlarda nötrofil en antimikrobiyal araçlara parçası olarak tespit edilmiştir. Apart enfeksiyonları mücadele onların rolü, son araştırmalar da kanser ilerlemesi de dahil olmak üzere diğer birçok hastalık süreçlerinde, yer olabileceğini göstermiştir. Arıtılmış Nets Yalıtımlı bu fonksiyonların çalışma izin çok önemli bir unsurdur. Bu video, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından hücresiz .NET izolasyon basit bir yöntem ortaya koymaktadır. İzole NET&#39;ler sonra immünofloresan boyama, kurutma veya çeşitli fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Bu nötrofillerin kendileri potansiyel karıştırıcı etkileri yokluğunda onların biyolojik özelliklerinin değerlendirilmesini sağlar. Bir yoğunluk gradyan ayırma tekniği sağlıklı donor bütün kandan nötrofilleri izole etmek için kullanılır. İzole edilmiş nötrofiller sonra forbol 12-myr tarafından uyarılıriState 13-asetat (PMA) NETosis tetiklemek için karıştırılabilir. Aktive edilen nötrofiller, daha sonra atılır ve hücre içermeyen bir .NET hazır elde edilir. Daha sonra A549 insan akciğer kanser hücreleri ile bir yapışma deneyinde kullanılabilir nasıl izole NET&#39;ler göstermektedir. NET hazır kat ilave edilir, 96 gözlü bir hücre kültürü plakası O / N, ve çukurlara altındaki uygun bir .NET tek tabaka oluşumuna katkıda sonra CFSE etiketli A549 hücrelerinin kuyu kullanılır. Yapışık hücreler Nikon TE300 floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilmiştir edilir. Bazı kuyularda, 1000U DNAse1 Nets aşağılamak için saymadan önce 10 dakika ilave edilir

NET&#39;ler ile statik yapışma deneyi başarılı olması kanser hücrelerinin ilave edilmesinden önce NET&#39;ler bir tek tabaka (Şekil 1) ile birlikte kuyu yeterli bir kaplama gerektirir. Tüm sonraki basamaklar bu katmanı bozmaya değil dikkatle yapılmalıdır. NET&#39;ler yeterli bir tabaka oluşturulur, bu Şekil 2A ve 2C&#39;de görüldüğü gibi NET&#39;ler önemli kanser hücrelerinin yapışmasını etmesi beklenmektedir. Bu etki Şekil 2B</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling at JoVE.com

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Aşağıdaki protokol, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından Nötrofil Ekstrasellüler tuzakları (NET) izole etmek için çok basit bir şekilde tarif eder. Daha sonra izole edilmiş NET&#39;ler kanser hücreleri bir in vitro yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir.

Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

simplified-human-neutrophil-extracellular-traps-nets-isolation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

29.8K Görüntüleme.  McGill University.  Aşağıdaki protokol, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından Nötrofil Ekstrasellüler tuzakları (NET) izole etmek için çok basit bir şekilde tarif eder. Daha sonra izole edilmiş NET'ler kanser hücreleri bir in vitro yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir. 

Video: Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved in various disease processes, such as autoimmune disease, thrombosis, and tumor metastases. Here, we show a detailed in vitro technique to detect NET activity during the trapping of free tumor cells, which grow after attachment to NETs. First, we collected low density neutrophils (LDN) from postoperative peritoneal lavage fluid from patients who underwent laparotomies. Short-term culturing of LDN resulted in massive NET formation that was visualized with green fluorescent nuclear and chromosome counterstain. After co-incubation of human gastric cancer cell lines MKN45, OCUM-1, and NUGC-4 with the NETs, many tumor cells were trapped by the NETs. Subsequently, the attachment was completely abrogated by the degradation of NETs with DNase I. Time-lapse video revealed that tumor cells trapped by the NETs did not die but instead grew vigorously in a continuous culture. These methods may be applied to the detection of adhesive interactions between NETs and various types of cells and materials.

Here, we present a method in which human low-density neutrophils (LDN), recovered from postoperative peritoneal lavage fluid, produce massive neutrophil extracellular traps (NETs) and efficiently trap free tumor cells that subsequently grow.

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Kanser Araştırmaları

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Tıp

Nötrofil hücre dışı tuzakları görselleştirmek için boyama ve görüntüleme

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Yazar Spotlight: İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar Görüntüleme 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

Çift Boyalı Canlı Hücre Analizi Kullanarak NET Oluşumunun Ölçülmesi

Real-Time High Throughput Technique to Quantify Neutrophil Extracellular Traps Formation in Human Neutrophils

Neutrophils are myeloid-lineage cells that form a crucial part of the innate immune system. The past decade has revealed additional key roles that neutrophils play in the pathogenesis of cancer, autoimmune diseases, and various acute and chronic inflammatory conditions by contributing to the initiation and perpetuation of immune dysregulation through multiple mechanisms, including the formation of neutrophil extracellular traps (NETs), which are structures crucial in antimicrobial defense. Limitations in techniques to quantify NET formation in an unbiased, reproducible, and efficient way have restricted our ability to further understand the role of neutrophils in health and diseases. We describe an automated, real-time, high-throughput method to quantify neutrophils undergoing NET formation using a live cell imaging platform coupled with a membrane permeability-dependent dual-dye approach using two different DNA dyes to image intracellular and extracellular DNA. This methodology is able to help assess neutrophil physiology and test molecules that can target NET formation.

Yazar Spotlight: Çift Renkli Canlı Hücre Görüntüleme Kullanarak Hastalık ve İlaç Taramasında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Ölçülmesi

We present an automated high-throughput method to quantify neutrophil extracellular traps (NETs) utilizing the live cell analysis system, coupled with a membrane permeability-dependent dual-dye approach.

Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği